CD147和VEGF—C在肺鱗癌、腺癌中的表達與臨床意義

吳強　張祥海

[摘要]目的 本研究旨在探討CDl47和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達水平與臨床病理之間的聯(lián)系以及相互關系。方法運用免疫組化的方法對57例肺癌組織標本進行CDl47和VEGF-C檢測。結果（1）57例肺鱗癌、腺癌中CDl47和VEGF-C的陽性表達率分別為63.16%、66.67%。肺鱗癌組和腺癌組CDl47和VEGF-C表達無差異（P>0.05）。（2）肺鱗癌、腺癌中CDl47和VEGF-C表達與腫瘤淋巴結轉移有關（P<0.05）及腫瘤TNM分期有關（P<0.01），而與患者的年齡、性別、吸煙及腫瘤細胞分化程度無關（P>0.05）。（3）CDl47與VEGF—C的表達呈正相關（x2=12.214，P<0.01）。結論 CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌的浸潤進展和轉移過程中起重要作用，而且可能發(fā)揮協(xié)同作用。CD147和VEGF-C可作為判斷肺癌患者預后的有用指標。

[關鍵詞]肺腫瘤；免疫組化；CD147；VEGF-C

[中圖分類號]R734.2 [文獻標識碼]B [文章編號]2095-0616（2016）06-156-05

CDl47是一種廣泛分布于人體多種組織細胞表面的跨膜糖蛋白，又名為細胞外基質金屬酶誘導蛋白（EMMPRN），屬于免疫球蛋白家族（IgSF）成員。它在多種腫瘤細胞中高表達，刺激腫瘤中的成纖維細胞分泌基質蛋白酶類（MMPs），參與細胞外基質和基底膜降解，在腫瘤浸潤、轉移過程中起重要作用。VEGF-C是VEGF家族成員，具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用，VEGF-C的高表達可以促進腫瘤淋巴管的生成及腫瘤細胞向區(qū)域淋巴結轉移。本研究采用免疫組織化學方法，檢測57例非小細胞肺癌（NSCLC）組織中CDl47和VEGF-C的表達情況，探討其與肺癌組織的組織學類型、分化程度、臨床分期、淋巴結轉移等臨床病理特征之間的關系及二者的相關性。

1.材料與方法

1.1病理標本

收集三峽大學第一臨床醫(yī)學院（宜昌市中心人民醫(yī)院）胸心外科2003年7月-2007年4月手術切除且術前未經(jīng)放化療的原發(fā)性肺鱗癌、腺癌組織標本57例。所有標本均常規(guī)取材，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，厚度5um連續(xù)切片。分別做HE和免疫組化染色。

1.2臨床與病理資料

本組共57例患者均經(jīng)臨床病理確診，術前均未經(jīng)放療或化療治療，其中男46例，女11例；年齡28～71歲，平均57.3歲，鱗癌46例，腺癌11例；手術切除淋巴結病理證實有淋巴結轉移者29例，病理分級：高分化16例，中分化24例，低分化17例。按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002年頒布的第6版國際肺癌TNM分期標準進行分期，I（Ia+Ib）期13例，Ⅱ期（Ⅱa+Ⅱb）26例，Ⅲ（Ⅲa+Ⅲb）期13例，Ⅳ期5例，吸煙（吸煙指數(shù)>400）34例。

1.3試劑

兔抗人CDl47多克隆抗體，兔抗人VEGF-C多克隆抗體及PV-9000二步法即用型試劑盒均從北京中杉金橋生物技術有限公司購買。

1.4方法

免疫組化染色采用PV-9000二步法，按照說明書操作步驟如下：（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化。（2）用3%H2O2去離子水孵育10min，阻斷內源性過氧化物酶。（3）根據(jù)一抗要求用微波加熱抗原修復。（4）滴加一抗，濕盒中37℃兩小時，PBS沖洗，2min×3次。（5）滴加試劑1，室溫孵育20min，PBS沖洗2min×3次。（6）滴加試劑2，室溫孵育30min，PBS沖洗2min×3次。（7）用DAB溶液顯色。（8）蘇木精復染后，脫水，透明，封片。用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性對照片作陽性對照。

1.5CD147和VEGF-C結果判定

CDl47以細胞膜和（或）細胞質呈黃色為陽性，VEGF-C陽性染色主要為細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機觀察5個高倍視野（400倍），每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞數(shù)。CDl47綜合染色強度和陽性染色細胞占癌細胞總數(shù)的比例進行判斷。（1）按切片中細胞著色深淺評分：0分細胞無著色；1分為黃色；2分棕黃色；3分為棕褐色。（2）按陽性細胞數(shù)占癌細胞總數(shù)的比例評分：1分為<25%；2分為≥25%且≤50%；3分為>50%且≤75%；4分為>75%。取（1）、（2）兩項的乘積為總積分：0～3分為陰性；>3分且≤6分為（+）；>6分且≤9分為（++）；>9分為（+++）。VEGF-C陽性強度判斷標準：癌細胞，脈管內皮細胞質呈棕黃色為染色陽性細胞。肺癌細胞VEGF-C表達強度：按癌細胞免疫組化染色著色深淺計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。按陽性細胞所占百分比打分：陰性為0分、陽性細胞<10%為1分、陽性細胞數(shù)11%～50%為2分、陽性細胞數(shù)>51%為3分；染色強度與-陽性細胞分比的乘積：0～2分為，3～4分為+、5～7分++、8～9分+++。染色結果有兩名病理醫(yī)師采用雙盲法評定，（-/+）為低表達，（++/+++）為高表達。

1.6統(tǒng)計學方法

應用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料采用x2檢驗和相關分析，并計算Pearson列聯(lián)系數(shù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1CDl47與VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達及與病理特征的關系

免疫組化染色CD147主要定位于腫瘤細胞膜和細胞質內，VEGF-C主要定位于腫瘤細胞的細胞質，均呈棕黃色或褐色小片狀或顆粒狀。在本組病例中CDl47與VEGF-C的陽性表達率分別為63.16%（36/57）、66.67%（38/57），CDl47在肺鱗癌、腺癌的陽性率分別為58.70%（27/46）、81.82%（9/11），VEGF-C在肺鱗癌、腺癌的陽性率分別為60.87%（28/46）、90.91%（10/11），二者在肺鱗癌、腺癌中的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在不同的細胞分化程度之間CDl47和VEGF-C的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。CDl47和VEGF-C在有淋巴結轉移組的陽性率分別為（24/29）82.76%、82.76%（24/29），顯著高于無淋巴結轉移組42.86%（12/28）、50.00%（14/28）（P<0.05）。見表1。

2.2CD147與VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達與臨床特征的關系

CD147和VEGF-C在肺癌中的陽性表達與患者的年齡、性別及有無吸煙（吸煙指數(shù)>400）均無明顯地相關性。在I+Ⅱ期組CDl47和VEGF-C的陽性率分別為48.72%（19/39）、53.85%（21/39）；在Ⅲ+Ⅳ期組分別為94.44%（17/18）、94.44%（17/18）。CDl47和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達與腫瘤的臨床分期有密切關系（P<0.01）。見表2。

2.3CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達的相互關系

57例患者中，36例CDl47陽性表達中同時有VEGF-C陽性表達30例；21例CDl47陰性患者中，有8例VEGF-C陽性表達。CDl47與VEGF-C的表達呈正相關（X2=12.214，P<0.01）。見表3。

3.討論

肺癌與其他實體腫瘤一樣具有侵襲和遠處轉移的生物學特性，而惡性腫瘤細胞的侵襲、轉移是多因素參與的交聯(lián)式多步驟反應的復雜過程。包括原發(fā)腫瘤浸潤、基底膜降解、腫瘤細胞進出血管和腫瘤細胞對靶組織侵襲等環(huán)節(jié)。在這一復雜的過程中，細胞外基質的降解、腫瘤血管及淋巴管的生成對腫瘤細胞的侵襲轉移起著至關重要的作用。近年來對CDl47與腫瘤的關系研究發(fā)現(xiàn)，CDl47廣泛表達于人體多種細胞，在膀胱癌、肺癌、神經(jīng)膠質瘤、黑色素瘤、淋巴瘤，結直腸癌，子宮內膜癌等多種腫瘤細胞中表達增加。CDl47可調節(jié)血管內皮生長因子而對腫瘤的血管生成有促進作用，也可以刺激成纖維細胞產(chǎn)生金屬基質蛋白酶（MMP2、MMP9等），其通過水解Ⅳ型膠原破壞腫瘤細胞周圍的基底膜和調節(jié)VEGF而影響腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移。Zheng等在對胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD147表達增強具有促進血管生成及VEGF表達的作用。黎明等在對膀胱移行細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者都存在CD147和VEGF共同表達，且兩者呈正相關（r=0.406，P<0.01）。Tang等在共培養(yǎng)的乳腺癌細胞和成纖維細胞中，CD147過表達時VEGF的表達上調；抑制CD147的表達、中和CD147蛋白的活性或抑制MMP的活性，都會使VEGF的表達受到抑制。Tang等還對VEGF產(chǎn)生過程中可能的信號通路如P13K-Akt、MAPK、JUN、p38激酶進行了研究。發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231乳腺癌細胞系中，過表達的CDl47只能刺激Akt和MAPK的磷酸化，而不能刺激JUN和p38激酶的磷酸化。而抑制CDl47的表達會抑制Akt和MAPK的磷酸化。這些結果表明在腫瘤細胞和成纖維細胞中，CDl47是通過P13K-Akt途徑調節(jié)VEGF的表達。

VEGF-C是VEGF家族成員之一，是特異的促淋巴管內皮生長因子和腫瘤血管生成標志物，在促進腫瘤淋巴管和血管生成以及腫瘤轉移起重要作用。其受體有VEGFR-2（FLK-1）和VGEFR-3（fit-4）。VEGF-C對VEGFR-3（fit-4）有更高的親和力，與之優(yōu)先結合，VEGF-C與VEGFR-3結合后通過MEK/ERK和P13K-Akt途徑引起淋巴管內皮細胞增生，VEGF-C蛋白水解后的成熟形式還可結合并激活VEGFR-2，作用于血管、淋巴管內皮細胞。近年來許多研究表明多種人類腫瘤表達VEGF-C，大部分中VEGF-C表達上調，且與局部淋巴結轉移有關。

本研究運用免疫組織化學方法對CDl47在57例肺鱗癌、腺癌中的表達進行了分析。結果顯示CDl47和VEGF-C在肺鱗癌和腺癌中高表達，陽性率分別為58.70%（27/46）、81.82%（9/11）和60.87%（28/46）、90.91%（10/11），二者之間無顯著統(tǒng)計學差異。CDl47和VEGF-C在有淋巴結轉移組的陽性率分別為82.76%（24/29）、82.76%（24/29），顯著高于無淋巴結轉移組42.86%（12/28）、50.00%（14/28）（P<0.05）；TNM分期Ⅲ+Ⅳ期組的陽性率分別為94.44%（17/18）、94.44%（17/18）顯著高于I+Ⅱ期組的48.72%（19/39）、53.85%（21/39）。CDl47和VEGF-C的高表達與有無淋巴結轉移及TNM分期密切相關，而與患者年齡、性別、吸煙等臨床因素及腫瘤組織類型、細胞分化程度無明顯的相關性。本研究結果顯示有淋巴結轉移的患者和腫瘤后期的患者CDl47和VEGF-C的陽性表達率明顯增高，說明CDl47和VEGF-C與肺鱗癌、腺癌的侵襲和轉移能力正相關。與王莉等對CDl47的研究及陳蘇娟等對VEGF-C的研究結果一致。

目前國內對CDl47和VEGF-C的相互作用尚未見文獻報道。黎明等在對膀胱移行細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者都存在CD147和VEGF共同表達，且兩者呈正相關。Tang等試驗表明，CDl47通過P13K-AKT途徑調節(jié)VEGF的表達，從而加速腫瘤血管的生成。VEGF-C是VEGF家族成員之一，可以調節(jié)腫瘤血管及淋巴管的生成，其主要作用是促進腫瘤淋巴管的生成。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌、腺癌中出現(xiàn)CDl47和VEGF-C聯(lián)合表達的比例較高，在36例CDl47陽性的病例中有30例VEGF-C表達陽性，二者表現(xiàn)出明顯的正相關（P<0.01）。提示CDl47和VEGF-C這兩種蛋白在肺鱗癌、腺癌中可能發(fā)揮協(xié)同作用，CDl47也可能上調VEGF-C的表達，促進腫瘤淋巴管的生長及腫瘤細胞的轉移。

綜上所述，CD147和VEGF-C在肺鱗癌、腺癌中的表達與腫瘤的臨床分期及淋巴結轉移關系密切，CD147和VEGF-C即可以作為獨立因素也可能相互協(xié)同促進肺鱗癌、腺癌的侵襲與轉移，二者均可作為判斷肺癌預后的參考指標。