胃癌患者血清miRNA-223的表達(dá)水平及其診斷價(jià)值

劉海寧， 朱新宇， 吳　昊， 陳玉琢， 英和娜拉， 劉韜韜

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科，上?！?00032

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·論著·

胃癌患者血清miRNA-223的表達(dá)水平及其診斷價(jià)值

劉海寧△， 朱新宇△， 吳昊， 陳玉琢， 英和娜拉， 劉韜韜*

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200032

目的： 探討胃癌患者血清中miRNA-223的表達(dá)水平及其診斷價(jià)值。方法： 采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測50例胃癌患者和50名健康對照者血清miRNA-223的表達(dá)量，分析miRNA-223與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。構(gòu)建受試者工作特征(ROC)曲線，比較miRNA-223與癌胚抗原(CEA)的診斷效能。結(jié)果： 胃癌患者血清miRNA-223水平高于健康對照組(P<0.05)。ROC曲線顯示，miRNA-223診斷胃癌的曲線下面積(AUC)達(dá)0.636(95%CI 0.526～0.746)，靈敏度、特異度分別為48%、82%；miRNA-223聯(lián)合CEA診斷胃癌的AUC達(dá)0.769(95%CI 0.675～0.862)，靈敏度、特異度分別為70%、78%。結(jié)論： miRNA-223聯(lián)合CEA有助于胃癌的診斷。

胃癌；miRNA-223；診斷價(jià)值

胃癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率占第4位的惡性腫瘤，在東亞地區(qū)的發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他地區(qū)[1]。多數(shù)胃癌患者在明確診斷時(shí)已為晚期，預(yù)后較差。因此，尋找胃癌的早期診斷標(biāo)志物對于提高其早期診斷率與降低病死率顯得尤為重要。微小RNA(microRNA)是一類非編碼的單鏈RNA，包含20～24個(gè)核苷酸，可精細(xì)調(diào)控基因的表達(dá)。血液中多種microRNA可以作為胃癌的早期診斷標(biāo)志物。miRNA-223在多種惡性腫瘤中表達(dá)增加。本研究通過檢測胃癌患者及健康對照血清中miRNA-223的表達(dá)量，評價(jià)其對胃癌的診斷效能。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2015年7月—9月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診的胃癌患者。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，且均無手術(shù)或放化療史。50例患者中，男性33例，女性17例；年齡(64.5±10.0)歲。診斷依據(jù)胃鏡或手術(shù)后病理活檢結(jié)果。TNM分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第7版標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期13例，Ⅱ期13例，Ⅲ期18例，Ⅳ期6例。病理分期以病變僅侵及黏膜及黏膜下層為早期胃癌[2]，相當(dāng)于T1N0M0期。本研究中，早期胃癌12例，進(jìn)展期胃癌38例。另選擇2015年4月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢中心體檢的50名健康志愿者作為對照，其中，男性29例，女性21例；年齡(34.8±7.2)歲；排除腫瘤性疾病。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，所有患者及健康志愿者均知情同意并填寫知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清收集及DNA提取清晨，空腹條件下，用SST血清分離膠管(BD公司，美國)抽取外周靜脈血約3 mL，血清析出后以1 000 ×g離心，吸取上層血清保存至-80℃冰箱。秀麗隱桿線蟲miRNA-39(cel-miRNA-39)作為外參，加入100 mL血清中。用miRNA提取分離試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取血清中總RNA。

1.2.2miR-223定量檢測用cDNA第一鏈合成試劑盒和miRNA熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR檢測[試劑盒及引物均購自天根生化科技(北京)有限公司]。miR-223序列為5′-UGUC AGUUUGUCAAAUACCCCA-3′。實(shí)時(shí)定量PCR儀購自Applied Biosystems公司(7500型，美國)。1.2.3Ct值的處理PCR反應(yīng)結(jié)束后，融解曲線顯示引物特異性良好。以Applied Biosystems 7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀默認(rèn)的閾值為標(biāo)準(zhǔn)，可得到目的基因在該樣本中擴(kuò)增的Ct值。所有樣品均設(shè)3個(gè)副孔，取平均Ct值。相對表達(dá)量以cel-miR-39為外參，以log10(2-ΔCt)方法計(jì)算miRNA-223的相對表達(dá)量[3]。1.2.4血清癌胚抗原(CEA)檢測全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定血清標(biāo)本的CEA濃度。CEA<50 ng/L為正常。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Stata 12.0及SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。胃癌組與健康對照組的miRNA-223表達(dá)量采用成組兩樣本t檢驗(yàn)，CEA濃度采用成組兩樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)。胃癌患者miRNA-223表達(dá)量與性別的關(guān)系采用成組兩樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分期的關(guān)系采用成組兩樣本t檢驗(yàn)，與年齡、腫瘤直徑的關(guān)系采用Pearson線性相關(guān)分析。用受試者工作特征(ROC)曲線及其曲線下面積(AUC)評估m(xù)iRNA-223及CEA的診斷效能。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2　結(jié)　果

2.1兩組血清miRNA-223表達(dá)水平及CEA濃度的比較胃癌組患者血清miRNA-223的表達(dá)量為3.64±0.62，健康對照組為3.35±0.54，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.518，P=0.013)。胃癌組血清CEA中位濃度為2.2 ng/L，健康對照組中位濃度為1.2 ng/L，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.264，P<0.001)。兩組miRNA-223的表達(dá)水平見圖1。

圖1　胃癌組及健康對照組血清miRNA-223表達(dá)水平

2.2胃癌患者血清miRNA-223表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性胃癌患者血清miRNA-223表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分期無關(guān)(表1)。胃癌患者不同TNM分期的血清miRNA-223表達(dá)水平見圖2。

表1　胃癌患者miRNA-223的相對表達(dá)量與

圖2　胃癌患者不同TNM分期血清miRNA-223的表達(dá)水平

2.3血清miRNA-223的診斷價(jià)值ROC分析(圖3)顯示：miRNA-223診斷胃癌的AUC為0.636(95%CI 0.526～0.746)；當(dāng)臨界閾值為3.71時(shí)，約登指數(shù)最高，診斷胃癌的靈敏度為48%、特異度為82%、陽性預(yù)測值為72.7%、陰性預(yù)測值為61.2%。以CEA<50 ng/L作為正常參考值，CEA診斷胃癌的靈敏度為16%，特異度為100%。miRNA-223聯(lián)合CEA診斷胃癌的AUC達(dá)0.769(95%CI 0.675～0.862)。聯(lián)合診斷的計(jì)算式為：0.719×miRNA-223+0.874×CEA。當(dāng)臨界閾值為4.16時(shí)，約登指數(shù)最高，兩者聯(lián)合診斷胃癌的靈敏度為70%、特異度為78%、陽性預(yù)測值為76.1%、陰性預(yù)測值為72.2%。

圖3　miRNA-223和(或)CEA診斷胃癌的ROC曲線

3　討　論

miRNA-223在多種惡性腫瘤患者血清中表達(dá)量升高，如胃癌[4]、結(jié)直腸癌[5]、肺癌[6]。研究[7]表明，腫瘤相關(guān)細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞)可通過釋放含miRNA-223的外泌體來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。Zhou等[8]的研究表明，miRNA-223可通過F框/WD-40域蛋白7( FBXW7)調(diào)控胃癌細(xì)胞周期，促進(jìn)其對順鉑的耐藥。

本研究進(jìn)一步表明，胃癌患者的血清miRNA-223表達(dá)水平較健康人顯著升高，為健康人的1.95倍。miRNA-223表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分期無關(guān)，提示該指標(biāo)作為分期、化療后或術(shù)后療效預(yù)測、預(yù)后標(biāo)志物有局限性。miRNA-223作為診斷標(biāo)志物的曲線下面積為0.636，診斷效能最高時(shí)靈敏度為48%，特異度為82%。需要指出，本研究胃癌組與健康對照組年齡有顯著差異(P<0.001)，但Zhou等[8]的研究與本研究均認(rèn)為，血清miRNA-223表達(dá)水平與年齡無關(guān)。

CEA是傳統(tǒng)的胃癌診斷標(biāo)志物，但其在多種消化系統(tǒng)惡性腫瘤、肺癌中均可能升高，因此診斷特異度不高，且易受到吸煙、感染等影響。本研究以<50 ng/L作為CEA的正常參考值，CEA的靈敏度僅為16%，特異度為100%。CEA的特異度與既往研究不符，原因可能在于：由于其他癌癥人群比例較健康人群過低而未納入對照組，且<50 ng/L為95%健康人群的取值范圍，而本研究僅納入50例健康人為對照。聯(lián)合miRNA-223與CEA可使診斷的ROC曲線下面積上升至0.769，診斷效能最高時(shí)靈敏度為70%、特異度為78%。因此，miRNA-223聯(lián)合CEA可用于胃癌的診斷，并優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用miRNA-223或CEA。

然而，miRNA-223及CEA水平在多種惡性腫瘤中升高，使其診斷胃癌的特異度降低，因此需先通過影像學(xué)檢查進(jìn)行定位診斷。

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[本文編輯]姬靜芳

Diagnostic value and expression of serum miRNA-223 in patients with gastric cancer

LIU Hai-ning△, ZHU Xin-yu△, WU Hao, CHEN Yu-zhuo, Enkhnaran Bilegsaikhan, LIU Tao-tao*

Department of Gastroenterology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To discuss the expression and diagnostic value of miRNA-223 in patients with gastric cancer. Methods： The expression of serum miRNA-223 was detected in 50 patients with gastric cancer and 50 healthy controls by using real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The relationship of miRNA-223 and clinicpathological parameter of gastric cancer was analyzed. The receiver operating curve (ROC) was constructed and the diagnostic value of miRNA-223 and carcinoembryonic antigen (CEA) was compared. Results： The serum miRNA-223 in patients with gastric cancer was significantly higher than control group. The ROC indicated that area under the ROC curve (AUC) of miRNA-223 was 0.636 (95%CI 0.526-0.746) with sensitivity of 48% and specificity of 82% whileAUCof combination of miRNA-223 and CEA was 0.769 (95%CI 0.675-0.862) with sensitivity of 70% and specificity of 78%. Conclusions： Combining miRNA-223 and CEA can be used to diagnosis gastric cancer.

gastric cancer；miRNA-223；diagnostic value

2016-05-29[接受日期]2016-08-01

劉海寧,博士生.E-mail: lhn0116@126.com;朱新宇, 主管護(hù)師. E-mail: zhu.xinyu@zs-hospital.sh.cn

Corresponding author). Tel: 021-64041990-2070, E-mail: liu.taotao@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160638

R 735.2

A

△共同第一作者(Co-first authors).