凝膠過濾色譜分離純化魚蛋白酶解產(chǎn)物

胡二坤，郭興鳳，鄭慧

1. 河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹飪食品與健康學(xué)院（鄭州 450046）；2. 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院（鄭州 450001）

魚蛋白粉經(jīng)過蛋白酶水解，其產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性。在食品工業(yè)中，為了更充分地利用魚蛋白酶解產(chǎn)物，尤其利用其自由基清除能力作天然食品抗氧化劑，有必要對其復(fù)雜的水解產(chǎn)物進行分離和純化，以提高水解產(chǎn)物的抗氧化效果。蛋白的酶解產(chǎn)物一般是多肽片斷或游離氨基酸，目前常用的分離純化方法有超濾、層析等。

凝膠過濾色譜法是以多孔凝膠為支持物，利用分子篩原理進行分離的方法，也是目前研究中常用的層析方法之一[1-2]。凝膠層析被廣泛用于脫鹽、蛋白質(zhì)分離純化和相對分子質(zhì)量的測定等方面，在魚蛋白酶解產(chǎn)物的分離方面也有應(yīng)用。Venkatesan等[3]利用G-25葡聚糖凝膠分離純化北方鱈魚魚肉蛋白；莊永亮等[4]利用G-25葡聚糖凝膠層析法分離純化羅非魚魚皮抗氧化肽；江海萍[5]采用G-15葡聚糖凝膠層析法分離藍園鰺抗氧化活性肽。

此次試驗選用凝膠層析法對魚蛋白酶解產(chǎn)物進行分離純化，考察洗脫速度和上樣濃度對魚蛋白水解產(chǎn)物分離效果的影響，確定凝膠層析分離純化魚蛋白酶解產(chǎn)物的最佳條件，為后續(xù)分離純化組分的抗氧化活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

Sephadex G-15（Pharmacia公司）；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司）；還原型谷胱甘肽（純度＞99%，阿爾法化工有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）、無水乙醇等試劑均為分析純。

魚蛋白酶水解產(chǎn)物（實驗室自制）。制備條件：采用堿性蛋白酶（酶活3.0×105U/mL），在底物濃度18.05%、加酶量2.40%、水解pH 8.07、水解溫度48.84℃條件下進行酶水解，酶解液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥后制成粉末。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備見表1。

表1 儀器與設(shè)備

1.3 試驗方法

1.3.1 凝膠型號的選擇

理論上，蛋白質(zhì)酶解后的氨基酸片斷與水解程度有關(guān)。隨著水解程度的增加，蛋白質(zhì)的分解程度也增加，所得到的氨基酸片斷變小。蛋白質(zhì)酶解程度和氨基酸片斷平均鏈長度的關(guān)系如式（1）所示[6]。

式中：AR為肽段的鏈長度。

蛋白水解物的平均相對分子質(zhì)量與水解度有關(guān)。水解度越大，蛋白質(zhì)肽鍵被切開得越多，肽鏈越短，相對分子質(zhì)量越小[7]。試驗制備的魚蛋白水解產(chǎn)物的水解度為23.15%，可推斷出水解產(chǎn)物平均含有4～7個氨基酸，平均相對分子質(zhì)量在520 Da左右[8]。G-15葡聚糖凝膠的分離范圍為100～1 500 Da，因此選取G-15葡聚糖凝膠作為分離用凝膠。

1.3.2 預(yù)處理及裝柱

此次試驗選用內(nèi)徑為15 mm、高460 mm的中高壓色譜塔。根據(jù)凝膠的膨脹系數(shù)及柱體積稱取適量的凝膠，在沸水浴中煮沸并充分溶脹后，用蒸餾水潤洗3遍。裝柱前，先向凝膠柱中加入約1/4柱高的蒸餾水，排除柱子下端的氣泡，將潤洗好的凝膠緩慢傾倒入柱子中，使凝膠自然沉降。為了避免凝膠分層，盡可能一次性地將攪拌均勻的凝膠注入柱子中，若多次注入，每次傾倒凝膠前先攪起沉降的凝膠，再用上述方法傾倒。裝好的柱子呈現(xiàn)均一的狀態(tài)，無氣泡和分層。裝好的柱子用3～5倍柱體積的蒸餾水對裝好的凝膠柱進行平衡，使凝膠充分沉降[6]。

1.3.3 Sephadex G-15凝膠層析方法

儀器設(shè)定自動體積2 mL，采用280 nm紫外檢測分離產(chǎn)物，蒸餾水為洗脫液，系統(tǒng)自動收集分離樣品?？疾煜疵撍俣群蜕蠘訚舛葘︳~蛋白水解產(chǎn)物分離效果的影響。

1.3.4 洗脫速度的選擇

上樣質(zhì)量濃度為100 mg/mL，探究洗脫速度分別為1.5，2.0和2.5 mL/min對魚蛋白水解產(chǎn)物的分離效果。

1.3.5 上樣濃度的選擇

洗脫速度為2.0 mL/min，探究上樣質(zhì)量濃度分別為75，100和125 mg/mL對魚蛋白水解產(chǎn)物的分離效果。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測定

DPPH·清除率的測定步驟參見表2[9]。

表2 DPPH·清除率測定試驗步驟

各混合液充分振蕩、混勻，避光條件下反應(yīng)30 min，在517 nm下測定吸光度。清除率按式（2）計算。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Collection 2.0.0軟件進行凝膠層析峰的計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 洗脫速度對魚蛋白水解產(chǎn)物分離效果的影響

在上樣質(zhì)量濃度100 mg/mL、上樣體積2 mL條件下，考察洗脫速度對魚蛋白水解產(chǎn)物分離效果的影響，結(jié)果如圖1所示。一般情況下，低流速時凝膠層析的分離效果較好，但流速過慢會導(dǎo)致樣品擴散加劇，影響分離效果。流速過快可能會導(dǎo)致樣品未得到完全分離就在洗脫液沖洗下流出來，也會影響分離和收集效果[5]。由圖1可以看出，魚蛋白水解產(chǎn)物凝膠層析得到3個洗脫峰。當(dāng)洗脫速度為1.5 mL/min時，由于洗脫速度慢、出峰慢，樣品擴散嚴(yán)重，洗脫出的譜帶變寬，峰形不夠尖銳，洗脫出來的峰拖尾嚴(yán)重，分離效果不理想。當(dāng)洗脫速度為2.0 mL/min時，樣品得到較好的分離。當(dāng)洗脫速度為2.5 mL/min時，洗脫出的峰與洗脫速度2.0 mL/min洗脫峰相比，第一個峰和第二個峰的重疊程度高，樣品未完全分離開。因此，選擇洗脫速度2.0 mL/min進行凝膠層析。

2.2 上樣濃度對魚蛋白水解產(chǎn)物分離效果的影響

在洗脫速度為2.0 mL/min、上樣體積2 mL條件下，考察上樣質(zhì)量濃度對魚蛋白水解產(chǎn)物分離效果的影響，結(jié)果如圖2所示。在凝膠層析試驗中，上樣質(zhì)量濃度過小和過大，均會影響分離效果。由圖2可以看出，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為75 mg/mL時，濃度過小，不利于收集組分。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為100 mg/mL時，分離效果理想，3個分離組分得到很好的分離。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為125 mg/mL時，濃度過高，導(dǎo)致樣品在洗脫柱的洗脫過程中，高濃度樣品向周圍擴散，造成分離出的峰重疊現(xiàn)象[7]，分離效果較差。因此，選取上樣質(zhì)量濃度100 mg/mL進行凝膠層析。

圖1 洗脫速度對魚蛋白水解產(chǎn)物分離效果的影響

圖2 上樣質(zhì)量濃度對魚蛋白水解產(chǎn)物分離效果的影響

通過以上研究，得出魚蛋白水解產(chǎn)物分離純化的最佳操作條件：上樣質(zhì)量濃度100 mg/mL，上樣體積2 mL，蒸餾水洗脫，洗脫速度2.0 mL/min。在此操作條件下魚蛋白水解產(chǎn)物得到3個洗脫峰。

2.3 魚蛋白水解產(chǎn)物分離圖譜及分離組分的蛋白含量

在還原型谷胱甘肽上樣質(zhì)量濃度50 mg/mL、魚蛋白水解產(chǎn)物上樣質(zhì)量濃度100 mg/mL、上樣體積2 mL、蒸餾水洗脫、洗脫速度2.0 mL/min的條件下，將還原型谷胱甘肽和魚蛋白水解產(chǎn)物分別經(jīng)過G-15葡聚糖凝膠層析柱，得到的分離圖譜如圖3所示。魚蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)過葡聚糖凝膠層析分離，按照出峰先后順序分別得到組分Ⅰ，組分Ⅱ和組分Ⅲ。魚蛋白分離組分的蛋白含量及所占的比例由表3所示。

魚蛋白粉經(jīng)過酶解后會斷裂成不同長度的肽段。由圖3可以看出，魚蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)過G-15葡聚糖凝膠洗脫后出現(xiàn)3個洗脫峰，根據(jù)葡聚糖凝膠的分子篩原理，得知組分Ⅲ的相對分子質(zhì)量最小，組分Ⅱ次之，組分Ⅰ相對分子質(zhì)量最大。將還原型谷胱甘肽（MW=307.32，純度＞99%）經(jīng)過洗脫通過G-15葡聚糖凝膠層析柱，得到一個洗脫峰。通過對比還原型谷胱甘肽和魚蛋白水解產(chǎn)物的洗脫峰，可估算出組分Ⅱ和組分Ⅲ的相對分子質(zhì)量小于還原型谷胱甘肽。由表3可見，組分Ⅰ相比與其他兩個組分所占比例較大，為51.70%，組分Ⅱ和組分Ⅲ占的比例分別為13.90%和34.40%。

表3 魚蛋白分離組分蛋白含量

圖3 魚蛋白水解產(chǎn)物和還原型谷胱甘肽凝膠層析圖譜

2.4 魚蛋白酶解產(chǎn)物及分離組分的DPPH·清除能力研究

將魚蛋白水解產(chǎn)物及分離純化得到的組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ分別進行DPPH·清除能力的測定，結(jié)果如圖4所示。將測定數(shù)據(jù)進行擬合分析，得到各組分的DPPH·清除能力的IC50值，結(jié)果見表4。

由圖4可以看出，魚蛋白酶解產(chǎn)物和3個分離組分的DPPH·清除能力均隨著濃度的增大而增強。從圖4（a）中可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0～7.5 mg/mL時，隨著魚蛋白水解產(chǎn)物濃度的增加，其DPPH·清除率呈現(xiàn)顯著性增加（p＜0.05）；當(dāng)魚蛋白水解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為2.1 mg/mL時，DPPH·清除率達到47.0%。由圖4（b）可見，當(dāng)組分Ⅰ質(zhì)量濃度為0.8～5.0 mg/mL時，其DPPH·清除率呈現(xiàn)顯著性增加；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時，組分Ⅰ的DPPH·清除率為51.1%。組分Ⅱ的DPPH·清除能力由圖4（c）所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～7.9 mg/mL時，組分Ⅱ的DPPH·清除率顯著性增強；當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，組分Ⅱ的DPPH·清除率為33.6%。組分Ⅲ的DPPH·清除能力由圖4（d）所示，組分Ⅲ的DPPH·清除率在0.4～3.7 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)顯著增加，當(dāng)其DPPH·清除率為55%時，組分Ⅲ的質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL。

由表4可見，魚蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)過G-15葡聚糖凝膠層析，組分Ⅰ和組分Ⅲ的DPPH·清除率明顯提高，組分Ⅱ的DPPH·清除率相比魚蛋白酶解產(chǎn)物變化不大。組分Ⅲ的DPPH·清除率最大，組分I次之，組分Ⅱ的DPPH·清除能力略低于魚蛋白水解產(chǎn)物的DPPH·清除能力，但均低于還原型谷胱甘肽和抗壞血酸的DPPH·清除能力。

圖4 魚蛋白水解產(chǎn)物及分離組分濃度對DPPH·清除能力的影響

表4 水解產(chǎn)物和分離組分的DPPH·清除能力測定結(jié)果 mg/mL

魚蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH·清除作用是其可以向DPPH·提供電子或氫供體的疏水氨基酸暴露，使得魚蛋白水解產(chǎn)物具有清除DPPH·的能力[10]。魚蛋白水解產(chǎn)物提供電子或氫原子給自由基后，自身成為自由基中間體，中間體達到穩(wěn)定態(tài)的時間和穩(wěn)定態(tài)的穩(wěn)定程度直接影響最終的自由基清除能力，還原型谷胱甘肽和抗壞血酸的DPPH·清除能力遠高于魚蛋白水解產(chǎn)物，原因可能是魚蛋白水解產(chǎn)物提供氫原子給自由基后，形成穩(wěn)定中間體的速度較慢，時間較長[11]。

3 結(jié)論

此次試驗選擇G-15葡聚糖凝膠作為柱材料分離純化魚蛋白水解產(chǎn)物，通過改變凝膠層析色譜的上樣濃度和洗脫速度，確定G-15葡聚糖凝膠層析分離純化魚蛋白水解產(chǎn)物的條件：上樣質(zhì)量濃度100 mg/mL，上樣體積2 mL，蒸餾水洗脫，洗脫速度2.0 mL/min。魚蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)過G-15葡聚糖凝膠層析，按相對分子質(zhì)量大小得到3個分離組分：組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ。3個分離組分的蛋白含量依次為83.70%，49.20%和36.91%，峰面積分別占51.70%，13.90%和34.40%。組分Ⅰ和組分Ⅲ的DPPH·清除率明顯提高，組分Ⅱ的DPPH·清除率相比魚蛋白酶解產(chǎn)物變化不大。