• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila的形態(tài)和分子特征

    2016-10-08 05:57:16曾永三仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護系廣東廣州510225
    廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年7期

    張 喆,張 正,曾永三(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護系,廣東 廣州 510225)

    昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila的形態(tài)和分子特征

    張 喆,張 正,曾永三
    (仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護系,廣東 廣州 510225)

    2010—2013年在昆蟲病原線蟲調(diào)查中,從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園采集土樣,利用大蠟螟(Galleria mellonella)誘集,獲得1個小桿類昆蟲病原線蟲種群(華農(nóng)種群HN)。該線蟲雌蟲的形態(tài)符合Oscheius myriophila的原始描述,測量值中除蟲體寬度(70~123 vs 57~70 μm)和口腔寬度(5~8 vs <4.5 μm)更寬、尾更長(138~188 vs 108~135 μm)外,其余特征值均在該種原始描述的范圍內(nèi);用HN種群的18S和28S rDNA序列進行Blast搜尋和比對,結(jié)果表明該種群18S序列與GenBank中的O. myriophila (AY602176)的相似度高達(dá)99%(1512/1514=99%),28S序列與O. myriophila(U81588)的相似度達(dá)100%(609/609=100%)。分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,HN與GenBank中的多個O. myriophila種群以高置信度聚在相同的Insectivorus 支系。綜合形態(tài)學(xué)和18S和28S rDNA序列特征,確定華農(nóng)種群HN為Oscheius myriophila。

    昆蟲病原線蟲;小桿線蟲;Oscheius myriophila;18S rDNA;28S rDNA

    張喆,張正,曾永三. 昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila 的形態(tài)和分子特征[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,43(7):87-92.

    昆蟲病原線蟲隸屬于斯氏線蟲科(S t e i n e r n e m a t i d a e)、異小桿線蟲科(Heterorhabdidae)和小桿科(Rhabdidae) 線蟲。長期以來,昆蟲病原線蟲分類依據(jù)為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征。但是同種的個體形態(tài)特征往往會隨營養(yǎng)和培養(yǎng)等條件的不同而產(chǎn)生差異,給昆蟲病原線蟲的分類鑒定帶來困難。20世紀(jì)80年代后,分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,大大促進了昆蟲病原線蟲的分類和鑒定。一些DNA分子標(biāo)記如RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism),18S、28S rDNA基因和ITS(Internal Transcribed Spacer)區(qū)序列已被用于昆蟲病原線蟲種類的鑒定[1-8]。在2010—2013年進行昆蟲病原線蟲調(diào)查中,我們從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園分離到1個種群,稱為華農(nóng)種群(HN),并研究了該種群的形態(tài)和分子特征,鑒定了該種群,為該線蟲的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1土樣采集

    2012年7月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園中的植物園采用5點取樣法在表土下10~20 cm處采集土壤樣品,每點采集3份,每份約1 kg,共15份。然后,混勻土樣并裝入塑料盒,用大蠟螟(Galleria mellonella)誘集土壤中的昆蟲病原線蟲。

    1.2昆蟲病原線蟲的誘集

    在塑料盒中盛200 g 土壤,并將3頭大蠟螟末齡幼蟲埋入土壤中作為活體誘餌,之后將塑料盒子置于20~25℃條件下,5 d后檢查大蠟螟的存活情況,將被線蟲寄生致死的大蠟螟尸體收集,轉(zhuǎn)移至線蟲收集盤[9-10]進行昆蟲病原線蟲的收集。每個土樣均設(shè)3次重復(fù)。

    1.3線蟲收集盤

    線蟲收集盤示意圖見圖1。其設(shè)置參考White[9]的方法。將高1 cm、直徑6 cm的小培養(yǎng)皿倒置于大培養(yǎng)皿(高2 cm,直徑12.5 cm)底部。在小培養(yǎng)皿頂放1張與小培養(yǎng)皿直徑大小一致的圓形濾紙,另加放1長條形濾紙,然后向大培養(yǎng)皿中注入足量的滅菌水,保證條形濾紙兩端浸在水里,并使圓形濾紙始終保持濕潤狀態(tài)。最后將上述螟蟲尸體置于濕潤的濾紙上,10~15 d后檢查是否有昆蟲病原線從大蠟螟尸體中游到水中。當(dāng)線蟲達(dá)到一定量后,將水倒入50 mL小燒杯中凈化線蟲。同時重新向培養(yǎng)皿中加入新的滅菌水,進行下一次收集,反復(fù)幾次,以收集足夠多的線蟲。

    圖1 線蟲收集盤示意圖

    1.4昆蟲病原線蟲的純化和保存

    用無菌水反復(fù)多次純化收集到的線蟲。具體操作:將上述收集的線蟲倒入200 mL燒杯,加入足量的無菌水,靜置約30 min,待線蟲沉到燒杯底后,輕輕倒去上層的水,如此重復(fù)4~5次。在8~12℃冰箱中保存凈化好的線蟲懸浮液。為延續(xù)線蟲種群,每隔3個月左右用大蠟螟末齡幼蟲重新繁殖線蟲1次?;蛴煤?.1%甲醛水溶液的海綿于在8~12℃的冰箱中長期保存線蟲。

    1.5昆蟲病原線蟲的繁殖

    用大蠟螟繁殖線蟲,即將1張始終保持濕潤的無菌濾紙放在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,加入10頭大蠟螟,然后用分離到的昆蟲病原線蟲接種大蠟螟,7 d后檢查線蟲的侵染和大蠟螟的死亡情況。

    1.6昆蟲病原線蟲的形態(tài)學(xué)

    將待鑒定線蟲熱殺死(60℃,3 min),并用FA固定液固定,在LEICA(DM4000B)顯微鏡下進行觀察、測量與描述,并用LEICA (DFC490)相機拍攝重要形態(tài)特征圖,圖片用Photoshop CS6編輯。

    1.7昆蟲病原線蟲的分子特征

    1.7.1線蟲DNA的提取 先將單條線蟲加入到含20 μL預(yù)冷的含蛋白酶K的WLB液[11]的離心管中,將離心管置于70℃恒溫水浴中至少1 h,之后95℃下溫育15 min,使蛋白酶K失活。然后高速離心(12 000 r/min ) 2 min,取上清液進行PCR擴增或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.7.2PCR擴增 擴增18S的正向引物為18SnF (5' TGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGC 3'),反向引物為18SnR(5' TTACGACTTTTGCCCGGTTC 3')[12];擴增 28S的正向引物為 D2a(5' ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG 3'),反向引物為D3b(5' TGCGAAGGAACCAGCTACTA 3')[13]。在25 μL PCR反應(yīng)體系中含有1 μL正向引物,1 μL反向引物,9.5 μL ddH2O,12.5 μL MixTaqDNA聚合酶,1 μL線蟲DNA模板。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性 5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸2 min,循環(huán)35次,最后72℃延伸10 min[14]。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖(含Goldview)凝膠電泳檢測,用0.5×TBE作電泳緩沖液(Tris-base 54.00 g,硼酸27.50 g,EDTA(0.5 M,pH 8.0)20 mL,ddH2O 980 mL),在電壓120 V下電泳20 min,用Kodak GEL LOGIC 200 IMAGING SYSTEM 凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍攝。

    1.7.3DNA測序及序列分析 將PCR產(chǎn)物由六合華大基因科技股份有限公司測序部純化后,用3730全自動測序儀(美國ABI公司)進行測序。所得序列及與其高匹配的GenBank中的線蟲序列經(jīng)ClustalW比對后,再利用 MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析待鑒定線蟲與相關(guān)線蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

    2 結(jié)果與分析

    2.1形態(tài)特征

    2.1.1形態(tài)測量值 待鑒定線蟲雌蟲的形態(tài)測量值見表1。與Poinar[15]對小桿屬線蟲Rhabditis (Oscheius) myriophila的原始描述相比,蟲體寬度(70~123 vs 57~70μm)和口腔寬度(5~8 vs <4.5μm)更寬、尾更長(138~188 vs 108~135μm),其余特征值均在該種原始描述的范圍內(nèi)。

    2.1.2形態(tài)特征描述 雌蟲:熱殺死后雌蟲體直或略向腹面彎曲。表皮光滑,頭頸連貫。口腔長而窄,柱形,清楚。唇口腔壁沒有明顯骨化,后口腔壁同型。食道前體部柱形,后部稍膨大形成中食道球。食道基球發(fā)達(dá),卵圓形,具有發(fā)育良好的瓣門。排泄孔位于后食道基部球附近。雙卵巢,有回折。陰門在體中部或近中部,為一橫向裂縫,陰唇略突起。尾圓錐狀,漸趨細(xì)(圖2)。

    表1 昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila華農(nóng)種群(HN)雌蟲形態(tài)測量值(μm)

    侵染性二齡幼蟲:熱殺死后蟲體直??谇弧⑹车佬螒B(tài)與成蟲相似。尾圓錐狀,末端細(xì)長(圖2 E、J)。

    雄蟲:未見。

    待鑒定線蟲雌蟲和幼蟲形態(tài)特征與前人[15-16]對Oscheius myriophila的描述相符。

    2.2分子生物學(xué)特征

    2.2.1PCR擴增 用18S引物18snF/18snR,28S引物D2a/D3b進行PCR擴增,得到18S擴增產(chǎn)物的大小為1 529 bp,28S的大小為627 bp。

    2.2.2DNA序列比對 將待鑒定線蟲種群的18S和28S rDNA序列進行Blast搜尋和比對,結(jié)果表明該線蟲種群18S序列與GenBank 中Oscheius myriophila種群(AY602176)的相似度高達(dá)99%(1512/1514=99%);該線蟲種群28S序列與GenBank中Oscheius myriophila種群(U81588)的相似度為100% (609/609=100%)。

    圖2 昆蟲病原線蟲Oscheius myriophila HN種群光學(xué)顯微形態(tài)特征

    2.2.3與相近種的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 從基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出,所選的31個線蟲種群分成2個大支系,其中隸屬于Oscheius屬的所有21個種群都聚在1個支系,該支系又分成2個明顯的小支系,即Insectivorus (食昆蟲的) 支系和Dolichurus (長尾的) 支系。本研究的O. myriophila HN種群與其中9個種群聚在Insectivorus支系,置信度為100,在這個支序中,華農(nóng)種群(O. myriophila HN)又與3個O. myriophila種群(KP756941,RSU13936,U81588)及1個Oscheius的未知種(AF082994)以100的置信度聚在一起。而另一類昆蟲病原線蟲——異小桿線蟲(Heterorhabditis)則被聚在另一個大支系中(圖3),說明Oscheius和Heterorhabditis的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

    在由28S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出,所選的Oscheius屬的11個種群包括華農(nóng)種群(O. myriophila HN)以高置信度(95)聚在1個支系中,該支系也分成Insectivorus和Dolichurus兩個小支系。華農(nóng)種群(O. myriophila HN)與其中8個種群聚在Insectivorus支系,置信度為88,在此支系中,O. myriophila HN種群又與同種的另一種群(AY602176)以99的置信度聚在一起。 而O. tupilae 和O. guentheri種群則以100的置信度聚在Dolichurus支系(圖4)。

    圖3 基于rDNA 18S序列構(gòu)建的昆蟲病原線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹

    圖4 基于rDNA 28S序列構(gòu)建的昆蟲病原線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 結(jié)論與討論

    小桿線蟲屬Oscheius由Andrássyd 在1976年建立,其特點是具有短的口腔和沒有真正的中食道球。Sudhaus[17]、Sudhaus & Hooper[18]將其作為亞屬放在Rhabditis中,并根據(jù)雄蟲交合刺和尾形態(tài)分成兩個類群,即Insectivorus和Dolichurus。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征分析,在采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園植物園土壤中誘集獲得的昆蟲病原線蟲(華農(nóng)種群HN)雖然未觀察到雄蟲,但雌蟲形態(tài)與Poinar[15]和董臘梅[16]對Oscheius myriophila的描述相符;另外,18S 和28S rDNA序列分析也表明華農(nóng)種群(HN)與來自GenBank中的多個O. myriophila種群序列相似度高達(dá)99%;分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示華農(nóng)種群與GenBank中的多個O. myriophila種群以高置信度聚在相同的Insectivorus 支系。因此,結(jié)合形態(tài)和分子特征,將華農(nóng)種群(HN)定為Oscheius myriophila。

    昆蟲病原線蟲是目前最具應(yīng)用前景的生物殺蟲劑之一,其毒力強、寄主范圍廣,對各種隱蔽性害蟲,尤其是地下害蟲防治具有巨大的應(yīng)用潛力。本研究中的華農(nóng)種群(O. myriophila HN)是通過大蠟螟誘集獲得,在誘集過程中,我們觀察到該線蟲對大蠟螟末齡幼蟲具有很強的致死能力。該種群對其他農(nóng)業(yè)重要害蟲是否具有致病性還有待進一步研究。

    [1] 丘雪紅,韓日疇. 昆蟲病原線蟲資源概況和分類技術(shù)進展[J]. 昆蟲學(xué)報,2007,50(3):286-296.

    [2] Adams B J,Burnell A M,Powers T O. A phylogenetic analysis of Heterorhabditis (Nemata:Rhabditidae)based on internal transcribed spacer 1 DNA sequence data[J]. Journal of Nematology,1998,30(1):22-39.

    [3] Hashmi G,Glazer I,Gaugler R. Molecular comparisons of entomopathogenic nematodes using randomly amplified. polymorphic DNA (RAPD)markers[J]. Fundamental and Applied Nematology,1996,19(4):399-406.

    [4] Joyce S A,Burnell A M,Powers T O. Characterization of Heterorhabditis isolates by PCR amplification of segment of mtDNA and rDNA genes[J]. Journal of Nematology,1994,26(3):260-270.

    [5] Nasmith C G,Speranzini D,Jeng R,et al. RFLP analysis of PCR-amplified ITS and 26S ribosomal genes of selected entomopathogenic nematodes(Steinernematid,Heterorhabditidae)[J]. Journal of Nematology,1996,28:15-25.

    [6] Nguyen K B,Maruniak J,Adams B J. Diagnostic and phylogenetic utility of the rDNA internal transcribed spacer sequences of Steinernema[J]. Journal of Nematology,2001,33(2-3):73-82.

    [7] Reid A P,Hominick W M. Restriction fragment length plymorphisms within the ribosomal DNA repeat unit of British entomopathogenic nematodes(Rhabditida:Steinernematidae)[J]. Parasitology,1992,105:317-323.

    [8] Stack C M,Easwaramoorthy S G,Metha U K,et al. Molecular characterisation of Heterorhabditis indica isolates from India,Kenya,Indonesia and Cuba[J]. Nematology,2000,2(5):477-487.

    [9] White G F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures[J]. Science,1927,66:302-303.

    [10] Bedding R A,Akhurst R J. A sample technique for the determination of insect parasitic Rhabditid nematodes in soil[J]. Nematologica,1975,21:109-110.

    [11] Williams B D,Schrank B,Huynh C,et al. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites[J]. Genetics,1992,131:609-624.

    [12] Kanzaki N,F(xiàn)utai K. A PCR primer set for determination of phylogenetic relationships of Bursaphelenchus species within the xylophilus group[J]. Nematology,2002,4:35-41.

    [13] Nunn G B. Nematode molecular evolution[D]. University of Nottingham,UK,1992.

    [14] Ye W,Giblin-Davis R M,Braasch H,et al. Phylogenetic relationships among Bursaphelenchus species(Nematoda: Parasitaphelenchidae)inferred from nuclear ribosomal and mitochondrial DNA sequence data. Molecular Phylogenetics and Evolution,2007,43:1185-1197.

    [15] Poinar Jr G O. Entomophagous nematodes[M]. In Franz J M(ed.). Biological plants and health protection. Verlag,Stuttgart,1986:95-122.

    [16] 董臘梅. 重茬桃杏果園非植物線蟲鑒定及小桿線蟲Rhabditis(Oscheius)myriophila應(yīng)用初探[D]. 福州:福建農(nóng)林大學(xué),2008.

    [17] Sudhaus W. Redescription of Rhabditis (Oscheius)tipulae(Nematoda:Rhabditidae)associated with leatherjackets,larvae of Tipula paludosa(Diptera:Tipulidae)[J]. Nematologica,1993,39:234-239.

    [18] Sudhaus W,Hooper D J. Rhabditis(Oscheius)guentheri sp. n.,an unusual species with reduced posterior ovary,with observations on the Dolichura and Insectivora groups(Nematoda:Rhabditidae)[J]. Nematologica,1994,40:508-533.

    (責(zé)任編輯 楊賢智)

    Morphological and molecular characteristics of an entomopathogenic nematode,Oscheius myriophila

    ZHANG Zhe, ZHANG Zheng, ZENG Yong-san
    (Department of Plant Protection, Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225, China)

    During the survey of entomopathogenic nematodes from 2010 to 2013, an entomopathogenic nematode population named Huanong (HN) trapped by using Galleria mellonella was isolated from soil samples collected from botanical garden in campus of South China Agricultural University. Morphological characteristics of the HN population female agreed with the original description of species Oscheius myriophila,and morphometrics of the population fitted into ranges of the original except for a wider body width (70-123 vs 57-70 μm) and stomal width (5-8 vs <4.5 μm), and a longer tail (138-188 vs 108-135 μm). Blast and alignment of rDNA sequences of the HN revealed identity of 99% (1512/1514=99%) with O. myriophila (AY602176)for 18S and 100% (609/609=100%) with O. myriophila (U81588)for 28S. Molecular phylogenetic analysis indicated that the HN and several populations of O. myriophila from GenBank were clustered into Insectivorus clade with high bootstraps. The HN was identified as Oscheius myriophila based on morphology and analysis of 18S and 28S rDNA sequences.

    entomopathogenic nematode;Rhabditid;Oscheius myriophila;18S rDNA;28S rDNA

    S476.15

    A

    1004-874X(2016)07-0087-06

    2015-09-28

    廣東省科技計劃項目(2011B020308010)

    張喆(1989-),男,在讀碩士生,E-mail:188295037@qq.com

    曾永三(1965-),男,博士,教授,E-mail:zys65@163.com

    国产精品人妻久久久影院| 日韩一本色道免费dvd| 中文字幕久久专区| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲成人一二三区av| 亚洲国产最新在线播放| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 一级爰片在线观看| 日本黄色片子视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 七月丁香在线播放| 午夜福利网站1000一区二区三区| 色94色欧美一区二区| 久久这里有精品视频免费| 韩国av在线不卡| av在线播放精品| 极品人妻少妇av视频| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品人妻久久久久久| 韩国av在线不卡| 精品少妇内射三级| 亚洲精品乱久久久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 少妇人妻 视频| 欧美三级亚洲精品| 国产伦理片在线播放av一区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 日韩电影二区| 久久久久久久大尺度免费视频| av不卡在线播放| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 一级二级三级毛片免费看| 国产视频首页在线观看| 日本色播在线视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产成人一区二区在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 婷婷色av中文字幕| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 97超视频在线观看视频| 日韩伦理黄色片| 一区在线观看完整版| 欧美精品一区二区免费开放| 国产精品久久久久久久电影| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 如何舔出高潮| 精品人妻熟女av久视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美bdsm另类| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美人与善性xxx| 国产乱人偷精品视频| 国产成人aa在线观看| 99久久综合免费| √禁漫天堂资源中文www| 97超视频在线观看视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产极品天堂在线| 在线观看免费日韩欧美大片 | 成年女人在线观看亚洲视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产亚洲欧美精品永久| av福利片在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久女婷五月综合色啪小说| 赤兔流量卡办理| 免费少妇av软件| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲精品456在线播放app| 欧美丝袜亚洲另类| 一区二区三区乱码不卡18| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲久久久国产精品| 99久久精品一区二区三区| videos熟女内射| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 国产探花极品一区二区| 人妻 亚洲 视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本91视频免费播放| 内地一区二区视频在线| 亚洲人与动物交配视频| 日本欧美国产在线视频| 在线观看免费高清a一片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费黄色在线免费观看| 成人无遮挡网站| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久久久人妻| 另类精品久久| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲综合精品二区| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜老司机福利剧场| 精品久久久精品久久久| 精品一区二区三区视频在线| 老司机亚洲免费影院| 最近中文字幕高清免费大全6| 精品久久国产蜜桃| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 欧美精品一区二区免费开放| 免费观看av网站的网址| 九草在线视频观看| 尾随美女入室| 赤兔流量卡办理| 国产色婷婷99| 老熟女久久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 性色av一级| 免费黄色在线免费观看| 青春草国产在线视频| 成人二区视频| 超碰97精品在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 国产乱人偷精品视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 丝袜脚勾引网站| 免费在线观看成人毛片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本欧美国产在线视频| 亚洲国产最新在线播放| 91精品国产国语对白视频| 久久99热这里只频精品6学生| 偷拍熟女少妇极品色| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一级a做视频免费观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 桃花免费在线播放| 色婷婷av一区二区三区视频| 少妇人妻 视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 69精品国产乱码久久久| 日本午夜av视频| av福利片在线| 草草在线视频免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日韩伦理黄色片| 少妇被粗大猛烈的视频| 深夜a级毛片| 一区在线观看完整版| 最新中文字幕久久久久| 亚洲怡红院男人天堂| 人人妻人人澡人人看| 亚洲欧美精品专区久久| 国产精品福利在线免费观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 波野结衣二区三区在线| 亚洲成人av在线免费| 人体艺术视频欧美日本| 欧美三级亚洲精品| 男女边摸边吃奶| 五月伊人婷婷丁香| 日韩精品有码人妻一区| 一级毛片 在线播放| 亚洲欧洲日产国产| 成人漫画全彩无遮挡| 男男h啪啪无遮挡| 婷婷色综合www| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲精品第二区| 最近的中文字幕免费完整| a级毛色黄片| 高清毛片免费看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日本91视频免费播放| 久热这里只有精品99| 国产精品99久久久久久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 老女人水多毛片| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费黄频网站在线观看国产| 少妇精品久久久久久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美日韩在线观看h| 日本色播在线视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品国产乱码久久久久久小说| 99久久精品热视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜激情久久久久久久| 激情五月婷婷亚洲| 一级二级三级毛片免费看| 偷拍熟女少妇极品色| 久久6这里有精品| 亚洲高清免费不卡视频| 一级毛片我不卡| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精品456在线播放app| 99热这里只有精品一区| 精品久久久噜噜| 人妻一区二区av| 久久人妻熟女aⅴ| av免费观看日本| 亚洲美女视频黄频| 一级毛片 在线播放| 22中文网久久字幕| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久精品免费免费高清| 不卡视频在线观看欧美| 精品国产露脸久久av麻豆| a级毛片在线看网站| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲国产av新网站| 综合色丁香网| 99九九在线精品视频 | av有码第一页| 女人久久www免费人成看片| 国产精品一区二区在线观看99| 国产成人精品久久久久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 最近中文字幕2019免费版| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 三级国产精品欧美在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品久久久久久久久亚洲| av网站免费在线观看视频| 男人舔奶头视频| 国产精品成人在线| 亚洲国产精品专区欧美| 97在线视频观看| 高清不卡的av网站| 久久国内精品自在自线图片| 超碰97精品在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美精品一区二区大全| 欧美日韩精品成人综合77777| 2018国产大陆天天弄谢| 国产黄片视频在线免费观看| 午夜91福利影院| 晚上一个人看的免费电影| 午夜免费男女啪啪视频观看| av天堂中文字幕网| 伦理电影大哥的女人| 女性生殖器流出的白浆| 国产成人精品无人区| 少妇人妻一区二区三区视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av天堂久久9| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲国产色片| 国产一级毛片在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲精品一二三| 五月开心婷婷网| 三级国产精品欧美在线观看| 少妇丰满av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 欧美三级亚洲精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 又大又黄又爽视频免费| 午夜久久久在线观看| 人人澡人人妻人| 亚洲av免费高清在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 观看免费一级毛片| 伦精品一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 婷婷色麻豆天堂久久| 日本wwww免费看| 国产亚洲最大av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 在线 av 中文字幕| 晚上一个人看的免费电影| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美日本中文国产一区发布| 日本黄大片高清| 69精品国产乱码久久久| 午夜久久久在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲av福利一区| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产乱人偷精品视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产免费福利视频在线观看| 街头女战士在线观看网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久人妻| 在线播放无遮挡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 桃花免费在线播放| 午夜91福利影院| 免费看av在线观看网站| 18+在线观看网站| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av成人精品一二三区| 综合色丁香网| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲三级黄色毛片| 五月开心婷婷网| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品一区在线观看国产| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲av二区三区四区| 少妇人妻久久综合中文| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲国产精品成人久久小说| 一级爰片在线观看| 成人免费观看视频高清| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美国产精品一级二级三级 | 内射极品少妇av片p| 久久99精品国语久久久| 激情五月婷婷亚洲| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 交换朋友夫妻互换小说| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 日日啪夜夜撸| 18禁在线播放成人免费| 国产中年淑女户外野战色| 一级爰片在线观看| 色网站视频免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 丰满迷人的少妇在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 男女无遮挡免费网站观看| 永久免费av网站大全| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日本av手机在线免费观看| 久久精品久久久久久久性| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩av免费高清视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 在线观看人妻少妇| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| av在线播放精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 一本久久精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久久久久久久久免费av| 99热网站在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品国产一区二区久久| 国产成人a∨麻豆精品| 国产爽快片一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 久久久久久久久大av| 人妻少妇偷人精品九色| 精品亚洲成a人片在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 少妇人妻 视频| 婷婷色综合www| 十八禁高潮呻吟视频 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 免费少妇av软件| 日本-黄色视频高清免费观看| 色哟哟·www| a 毛片基地| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品一二三| 久久精品国产自在天天线| 丰满少妇做爰视频| 国产乱人偷精品视频| 免费看光身美女| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜91福利影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 免费观看av网站的网址| 男女边吃奶边做爰视频| 日本黄色片子视频| av天堂中文字幕网| 国产男女内射视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 99久久精品一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 丰满乱子伦码专区| 国产乱来视频区| 两个人免费观看高清视频 | 久久青草综合色| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲成人av在线免费| 97超视频在线观看视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 少妇人妻 视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 色视频www国产| 日本黄色日本黄色录像| av免费在线看不卡| 国产精品熟女久久久久浪| 久久这里有精品视频免费| 亚洲精品日韩av片在线观看| 午夜91福利影院| 男人添女人高潮全过程视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产亚洲最大av| 韩国av在线不卡| 成人午夜精彩视频在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产在线男女| 黄片无遮挡物在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 精品亚洲成国产av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 午夜免费鲁丝| 国产在线一区二区三区精| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品久久国产蜜桃| 欧美日韩亚洲高清精品| 女性生殖器流出的白浆| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 精品酒店卫生间| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲精品日本国产第一区| 99久久精品一区二区三区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美一级a爱片免费观看看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 成人影院久久| 99热这里只有精品一区| 国产成人精品无人区| 综合色丁香网| 日本91视频免费播放| 久久久亚洲精品成人影院| 18禁在线播放成人免费| 欧美日韩av久久| 黄色一级大片看看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 下体分泌物呈黄色| 国产在线免费精品| 高清av免费在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲图色成人| 91久久精品电影网| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 精品视频人人做人人爽| 美女主播在线视频| 亚洲av免费高清在线观看| kizo精华| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产视频内射| 成人毛片60女人毛片免费| 一级毛片久久久久久久久女| 成人美女网站在线观看视频| 五月伊人婷婷丁香| 下体分泌物呈黄色| 看十八女毛片水多多多| av天堂久久9| 欧美一级a爱片免费观看看| av免费观看日本| 大香蕉97超碰在线| 18+在线观看网站| 极品人妻少妇av视频| 少妇熟女欧美另类| av天堂中文字幕网| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 99热6这里只有精品| 女性生殖器流出的白浆| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产免费一级a男人的天堂| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产色婷婷99| 国产熟女午夜一区二区三区 | 91精品伊人久久大香线蕉| 精品亚洲成a人片在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 一级毛片我不卡| 99国产精品免费福利视频| 国产成人精品婷婷| 亚洲国产成人一精品久久久| 美女大奶头黄色视频| videossex国产| 在线精品无人区一区二区三| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产69精品久久久久777片| av网站免费在线观看视频| 六月丁香七月| 伦精品一区二区三区| 国产男女内射视频| 久久久a久久爽久久v久久| 深夜a级毛片| 欧美日韩av久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日本爱情动作片www.在线观看| av专区在线播放| 99热网站在线观看| 一级av片app| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲成人手机| 亚洲性久久影院| 国产男女内射视频| videos熟女内射| 日韩精品有码人妻一区| 性色av一级| 日韩一本色道免费dvd| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 一级a做视频免费观看| 丁香六月天网| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲成人一二三区av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 简卡轻食公司| 男女免费视频国产| 一本大道久久a久久精品| 亚洲av二区三区四区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 18+在线观看网站| 一级a做视频免费观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久久久网色| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲在久久综合| 99热全是精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品一区二区三区视频在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产一区二区三区综合在线观看 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品偷伦视频观看了| 51国产日韩欧美| 成人毛片a级毛片在线播放| av国产久精品久网站免费入址| 久久久久久久久久久免费av| 校园人妻丝袜中文字幕| 人妻一区二区av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产日韩欧美在线精品| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 免费看日本二区| 免费观看a级毛片全部| 国产69精品久久久久777片| 国产精品国产三级专区第一集| a 毛片基地| 日韩欧美 国产精品| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久av网站| 久久ye,这里只有精品| 在线永久观看黄色视频| 高清在线国产一区| 两个人免费观看高清视频| 大片电影免费在线观看免费| 极品少妇高潮喷水抽搐| 两人在一起打扑克的视频| av线在线观看网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 好男人电影高清在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 美女视频免费永久观看网站| 国产av又大| 悠悠久久av| 日韩有码中文字幕| 飞空精品影院首页| 麻豆国产av国片精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| av一本久久久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久久久精品国产欧美久久久 | 免费黄频网站在线观看国产| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 欧美日韩一级在线毛片| 97在线人人人人妻| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 新久久久久国产一级毛片| 一级片'在线观看视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 狂野欧美激情性xxxx| 成年人午夜在线观看视频| 美女大奶头黄色视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲伊人久久精品综合| 嫩草影视91久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看|