昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)Oscheius myriophila的形態(tài)和分子特征

張 喆，張 正，曾永三（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護(hù)系，廣東 廣州 510225）

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)Oscheius myriophila的形態(tài)和分子特征

張 喆，張 正，曾永三
（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物保護(hù)系，廣東 廣州 510225）

2010—2013年在昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)調(diào)查中，從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園采集土樣，利用大蠟螟（Galleria mellonella）誘集，獲得1個(gè)小桿類昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)種群（華農(nóng)種群HN）。該線蟲(chóng)雌蟲(chóng)的形態(tài)符合Oscheius myriophila的原始描述，測(cè)量值中除蟲(chóng)體寬度（70～123 vs 57～70 μm）和口腔寬度（5～8 vs ＜4.5 μm）更寬、尾更長(zhǎng)（138～188 vs 108～135 μm）外，其余特征值均在該種原始描述的范圍內(nèi)；用HN種群的18S和28S rDNA序列進(jìn)行Blast搜尋和比對(duì)，結(jié)果表明該種群18S序列與GenBank中的O. myriophila （AY602176）的相似度高達(dá)99%（1512/1514=99%），28S序列與O. myriophila（U81588）的相似度達(dá)100%（609/609=100%）。分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，HN與GenBank中的多個(gè)O. myriophila種群以高置信度聚在相同的Insectivorus 支系。綜合形態(tài)學(xué)和18S和28S rDNA序列特征，確定華農(nóng)種群HN為Oscheius myriophila。

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)；小桿線蟲(chóng)；Oscheius myriophila；18S rDNA；28S rDNA

張喆，張正，曾永三. 昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)Oscheius myriophila 的形態(tài)和分子特征［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（7）：87-92.

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)隸屬于斯氏線蟲(chóng)科（S t e i n e r n e m a t i d a e）、異小桿線蟲(chóng)科（Heterorhabdidae）和小桿科（Rhabdidae） 線蟲(chóng)。長(zhǎng)期以來(lái)，昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)分類依據(jù)為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征。但是同種的個(gè)體形態(tài)特征往往會(huì)隨營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)等條件的不同而產(chǎn)生差異，給昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的分類鑒定帶來(lái)困難。20世紀(jì)80年代后，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，大大促進(jìn)了昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的分類和鑒定。一些DNA分子標(biāo)記如RAPD （Random Amplification Polymorphic DNA）、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism），18S、28S rDNA基因和ITS（Internal Transcribed Spacer）區(qū)序列已被用于昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)種類的鑒定［1-8］。在2010—2013年進(jìn)行昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)調(diào)查中，我們從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園分離到1個(gè)種群，稱為華農(nóng)種群（HN），并研究了該種群的形態(tài)和分子特征，鑒定了該種群，為該線蟲(chóng)的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1土樣采集

2012年7月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園中的植物園采用5點(diǎn)取樣法在表土下10～20 cm處采集土壤樣品，每點(diǎn)采集3份，每份約1 kg，共15份。然后，混勻土樣并裝入塑料盒，用大蠟螟（Galleria mellonella）誘集土壤中的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)。

1.2昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的誘集

在塑料盒中盛200 g 土壤，并將3頭大蠟螟末齡幼蟲(chóng)埋入土壤中作為活體誘餌，之后將塑料盒子置于20～25℃條件下，5 d后檢查大蠟螟的存活情況，將被線蟲(chóng)寄生致死的大蠟螟尸體收集，轉(zhuǎn)移至線蟲(chóng)收集盤(pán)［9-10］進(jìn)行昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的收集。每個(gè)土樣均設(shè)3次重復(fù)。

1.3線蟲(chóng)收集盤(pán)

線蟲(chóng)收集盤(pán)示意圖見(jiàn)圖1。其設(shè)置參考White［9］的方法。將高1 cm、直徑6 cm的小培養(yǎng)皿倒置于大培養(yǎng)皿（高2 cm，直徑12.5 cm）底部。在小培養(yǎng)皿頂放1張與小培養(yǎng)皿直徑大小一致的圓形濾紙，另加放1長(zhǎng)條形濾紙，然后向大培養(yǎng)皿中注入足量的滅菌水，保證條形濾紙兩端浸在水里，并使圓形濾紙始終保持濕潤(rùn)狀態(tài)。最后將上述螟蟲(chóng)尸體置于濕潤(rùn)的濾紙上，10～15 d后檢查是否有昆蟲(chóng)病原線從大蠟螟尸體中游到水中。當(dāng)線蟲(chóng)達(dá)到一定量后，將水倒入50 mL小燒杯中凈化線蟲(chóng)。同時(shí)重新向培養(yǎng)皿中加入新的滅菌水，進(jìn)行下一次收集，反復(fù)幾次，以收集足夠多的線蟲(chóng)。

圖1 線蟲(chóng)收集盤(pán)示意圖

1.4昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的純化和保存

用無(wú)菌水反復(fù)多次純化收集到的線蟲(chóng)。具體操作：將上述收集的線蟲(chóng)倒入200 mL燒杯，加入足量的無(wú)菌水，靜置約30 min，待線蟲(chóng)沉到燒杯底后，輕輕倒去上層的水，如此重復(fù)4～5次。在8～12℃冰箱中保存凈化好的線蟲(chóng)懸浮液。為延續(xù)線蟲(chóng)種群，每隔3個(gè)月左右用大蠟螟末齡幼蟲(chóng)重新繁殖線蟲(chóng)1次。或用含有0.1%甲醛水溶液的海綿于在8～12℃的冰箱中長(zhǎng)期保存線蟲(chóng)。

1.5昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的繁殖

用大蠟螟繁殖線蟲(chóng)，即將1張始終保持濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙放在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，加入10頭大蠟螟，然后用分離到的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)接種大蠟螟，7 d后檢查線蟲(chóng)的侵染和大蠟螟的死亡情況。

1.6昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)

將待鑒定線蟲(chóng)熱殺死（60℃，3 min），并用FA固定液固定，在LEICA（DM4000B）顯微鏡下進(jìn)行觀察、測(cè)量與描述，并用LEICA （DFC490）相機(jī)拍攝重要形態(tài)特征圖，圖片用Photoshop CS6編輯。

1.7昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)的分子特征

1.7.1線蟲(chóng)DNA的提取 先將單條線蟲(chóng)加入到含20 μL預(yù)冷的含蛋白酶K的WLB液［11］的離心管中，將離心管置于70℃恒溫水浴中至少1 h，之后95℃下溫育15 min，使蛋白酶K失活。然后高速離心（12 000 r/min ） 2 min，取上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增18S的正向引物為18SnF （5' TGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGC 3'），反向引物為18SnR（5' TTACGACTTTTGCCCGGTTC 3'）［12］；擴(kuò)增 28S的正向引物為 D2a（5' ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG 3'），反向引物為D3b（5' TGCGAAGGAACCAGCTACTA 3'）［13］。在25 μL PCR反應(yīng)體系中含有1 μL正向引物，1 μL反向引物，9.5 μL ddH2O，12.5 μL MixTaqDNA聚合酶，1 μL線蟲(chóng)DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min［14］。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖（含Goldview）凝膠電泳檢測(cè)，用0.5×TBE作電泳緩沖液（Tris-base 54.00 g，硼酸27.50 g，EDTA（0.5 M，pH 8.0）20 mL，ddH2O 980 mL），在電壓120 V下電泳20 min，用Kodak GEL LOGIC 200 IMAGING SYSTEM 凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍攝。

1.7.3DNA測(cè)序及序列分析 將PCR產(chǎn)物由六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序部純化后，用3730全自動(dòng)測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）進(jìn)行測(cè)序。所得序列及與其高匹配的GenBank中的線蟲(chóng)序列經(jīng)ClustalW比對(duì)后，再利用 MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析待鑒定線蟲(chóng)與相關(guān)線蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征

2.1.1形態(tài)測(cè)量值 待鑒定線蟲(chóng)雌蟲(chóng)的形態(tài)測(cè)量值見(jiàn)表1。與Poinar［15］對(duì)小桿屬線蟲(chóng)Rhabditis （Oscheius） myriophila的原始描述相比，蟲(chóng)體寬度（70～123 vs 57～70μm）和口腔寬度（5～8 vs ＜4.5μm）更寬、尾更長(zhǎng)（138～188 vs 108～135μm），其余特征值均在該種原始描述的范圍內(nèi)。

2.1.2形態(tài)特征描述 雌蟲(chóng)：熱殺死后雌蟲(chóng)體直或略向腹面彎曲。表皮光滑，頭頸連貫?？谇婚L(zhǎng)而窄，柱形，清楚。唇口腔壁沒(méi)有明顯骨化，后口腔壁同型。食道前體部柱形，后部稍膨大形成中食道球。食道基球發(fā)達(dá)，卵圓形，具有發(fā)育良好的瓣門(mén)。排泄孔位于后食道基部球附近。雙卵巢，有回折。陰門(mén)在體中部或近中部，為一橫向裂縫，陰唇略突起。尾圓錐狀，漸趨細(xì)（圖2）。

表1 昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)Oscheius myriophila華農(nóng)種群（HN）雌蟲(chóng)形態(tài)測(cè)量值（μm）

侵染性二齡幼蟲(chóng)：熱殺死后蟲(chóng)體直?？谇?、食道形態(tài)與成蟲(chóng)相似。尾圓錐狀，末端細(xì)長(zhǎng)（圖2 E、J）。

雄蟲(chóng)：未見(jiàn)。

待鑒定線蟲(chóng)雌蟲(chóng)和幼蟲(chóng)形態(tài)特征與前人［15-16］對(duì)Oscheius myriophila的描述相符。

2.2分子生物學(xué)特征

2.2.1PCR擴(kuò)增 用18S引物18snF/18snR，28S引物D2a/D3b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到18S擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為1 529 bp，28S的大小為627 bp。

2.2.2DNA序列比對(duì) 將待鑒定線蟲(chóng)種群的18S和28S rDNA序列進(jìn)行Blast搜尋和比對(duì)，結(jié)果表明該線蟲(chóng)種群18S序列與GenBank 中Oscheius myriophila種群（AY602176）的相似度高達(dá)99%（1512/1514=99%）；該線蟲(chóng)種群28S序列與GenBank中Oscheius myriophila種群（U81588）的相似度為100% （609/609=100%）。

圖2 昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)Oscheius myriophila HN種群光學(xué)顯微形態(tài)特征

2.2.3與相近種的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 從基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出，所選的31個(gè)線蟲(chóng)種群分成2個(gè)大支系，其中隸屬于Oscheius屬的所有21個(gè)種群都聚在1個(gè)支系，該支系又分成2個(gè)明顯的小支系，即Insectivorus （食昆蟲(chóng)的） 支系和Dolichurus （長(zhǎng)尾的） 支系。本研究的O. myriophila HN種群與其中9個(gè)種群聚在Insectivorus支系，置信度為100，在這個(gè)支序中，華農(nóng)種群（O. myriophila HN）又與3個(gè)O. myriophila種群（KP756941，RSU13936，U81588）及1個(gè)Oscheius的未知種（AF082994）以100的置信度聚在一起。而另一類昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)——異小桿線蟲(chóng)（Heterorhabditis）則被聚在另一個(gè)大支系中（圖3），說(shuō)明Oscheius和Heterorhabditis的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

在由28S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出，所選的Oscheius屬的11個(gè)種群包括華農(nóng)種群（O. myriophila HN）以高置信度（95）聚在1個(gè)支系中，該支系也分成Insectivorus和Dolichurus兩個(gè)小支系。華農(nóng)種群（O. myriophila HN）與其中8個(gè)種群聚在Insectivorus支系，置信度為88，在此支系中，O. myriophila HN種群又與同種的另一種群（AY602176）以99的置信度聚在一起。 而O. tupilae 和O. guentheri種群則以100的置信度聚在Dolichurus支系（圖4）。

圖3 基于rDNA 18S序列構(gòu)建的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4 基于rDNA 28S序列構(gòu)建的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3　結(jié)論與討論

小桿線蟲(chóng)屬Oscheius由Andrássyd 在1976年建立，其特點(diǎn)是具有短的口腔和沒(méi)有真正的中食道球。Sudhaus［17］、Sudhaus & Hooper［18］將其作為亞屬放在Rhabditis中，并根據(jù)雄蟲(chóng)交合刺和尾形態(tài)分成兩個(gè)類群，即Insectivorus和Dolichurus。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征分析，在采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園植物園土壤中誘集獲得的昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)（華農(nóng)種群HN）雖然未觀察到雄蟲(chóng)，但雌蟲(chóng)形態(tài)與Poinar［15］和董臘梅［16］對(duì)Oscheius myriophila的描述相符；另外，18S 和28S rDNA序列分析也表明華農(nóng)種群（HN）與來(lái)自GenBank中的多個(gè)O. myriophila種群序列相似度高達(dá)99%；分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示華農(nóng)種群與GenBank中的多個(gè)O. myriophila種群以高置信度聚在相同的Insectivorus 支系。因此，結(jié)合形態(tài)和分子特征，將華農(nóng)種群（HN）定為Oscheius myriophila。

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)是目前最具應(yīng)用前景的生物殺蟲(chóng)劑之一，其毒力強(qiáng)、寄主范圍廣，對(duì)各種隱蔽性害蟲(chóng)，尤其是地下害蟲(chóng)防治具有巨大的應(yīng)用潛力。本研究中的華農(nóng)種群（O. myriophila HN）是通過(guò)大蠟螟誘集獲得，在誘集過(guò)程中，我們觀察到該線蟲(chóng)對(duì)大蠟螟末齡幼蟲(chóng)具有很強(qiáng)的致死能力。該種群對(duì)其他農(nóng)業(yè)重要害蟲(chóng)是否具有致病性還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Morphological and molecular characteristics of an entomopathogenic nematode，Oscheius myriophila

ZHANG Zhe， ZHANG Zheng， ZENG Yong-san
（Department of Plant Protection， Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225， China）

During the survey of entomopathogenic nematodes from 2010 to 2013， an entomopathogenic nematode population named Huanong （HN） trapped by using Galleria mellonella was isolated from soil samples collected from botanical garden in campus of South China Agricultural University. Morphological characteristics of the HN population female agreed with the original description of species Oscheius myriophila，and morphometrics of the population fitted into ranges of the original except for a wider body width （70-123 vs 57-70 μm） and stomal width （5-8 vs ＜4.5 μm）， and a longer tail （138-188 vs 108-135 μm）. Blast and alignment of rDNA sequences of the HN revealed identity of 99% （1512/1514=99%） with O. myriophila （AY602176）for 18S and 100% （609/609=100%） with O. myriophila （U81588）for 28S. Molecular phylogenetic analysis indicated that the HN and several populations of O. myriophila from GenBank were clustered into Insectivorus clade with high bootstraps. The HN was identified as Oscheius myriophila based on morphology and analysis of 18S and 28S rDNA sequences.

entomopathogenic nematode；Rhabditid；Oscheius myriophila；18S rDNA；28S rDNA

S476.15

A

1004-874X（2016）07-0087-06

2015-09-28

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B020308010）

張喆（1989-），男，在讀碩士生，E-mail：188295037@qq.com

曾永三（1965-），男，博士，教授，E-mail：zys65@163.com