黃瓜‘中國龍’毛狀根誘導(dǎo)體系的建立

林志豪 ，鄧鈺宏 ，趙 靜

（1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 廣州 510642； 2.廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院 廣州 510520）

黃瓜（Cucumis sativus L.）別名胡瓜、青瓜，屬于葫蘆科黃瓜屬草本植物，在國內(nèi)外廣泛種植，同時(shí)它也是重要的設(shè)施蔬菜主栽種類之一，在全球蔬菜供應(yīng)中占有舉足輕重的地位。受抗性基因資源匱乏的限制，傳統(tǒng)黃瓜育種方法很難快速得到具有抗性的優(yōu)良品種。黃瓜基因組測序的完成[1]，為黃瓜遺傳育種提供了重要的基因資源庫。要對此基因?qū)殠爝M(jìn)行挖掘、篩選重要的基因資源，黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化方法顯得尤為重要。

發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物后，通過所含Ri質(zhì)粒的T-DNA在植物細(xì)胞基因組中整合并表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根[2]。毛狀根能在無激素的培養(yǎng)基上生長，合成Ri T-DNA的表達(dá)產(chǎn)物冠癭堿，并能自發(fā)或人工誘導(dǎo)再生植株[3]。利用轉(zhuǎn)基因毛狀根對興趣基因進(jìn)行功能分析，可大大縮短以往依賴于根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化所要的時(shí)間，利于對興趣基因的功能研究，挖掘出可利用的基因資源。目前，利用發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行基因的功能研究在許多植物上都有報(bào)道，如大豆[4]、番茄[5]、苜蓿[6]、高麗參[7]、西洋參[8]等。

利用發(fā)根農(nóng)桿菌對黃瓜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化始于1991年，McInnes等[9]用含Ri T-DNA的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染黃瓜子葉外植體，誘導(dǎo)出毛狀根。隨后發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)黃瓜毛狀根形成的遺傳轉(zhuǎn)化體系得到不斷優(yōu)化和完善。1997年，施和平等[10]研究了乙酰丁香酮對發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化黃瓜的影響，發(fā)現(xiàn)用添加乙酰丁香酮活化培養(yǎng)的菌液感染黃瓜子葉外植體生根更快；次年，該研究團(tuán)隊(duì)用2種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株（R1000和R1601）侵染子葉外植體，成功獲得毛狀根，結(jié)果表明，含不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌誘導(dǎo)黃瓜子葉發(fā)生的毛狀根的形態(tài)和種類不同[11]；2000年他們又對黃瓜毛狀根形成過程中合適的外植體年齡和蔗糖濃度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)10 d苗齡的子葉外植體產(chǎn)生毛狀根的能力最強(qiáng)，外植體毛狀根誘導(dǎo)率為88.89%，隨著外植體年齡的增強(qiáng)，發(fā)根率減弱，直到不發(fā)根；培養(yǎng)基中添加2%、3%或4%的蔗糖可以顯著提高子葉外植體的毛狀根誘導(dǎo)率[12]。馮斌等[13]用發(fā)根農(nóng)桿菌A4對‘津研4號’黃瓜的子葉和下胚軸進(jìn)行誘導(dǎo)，得到了再生植株，轉(zhuǎn)化植株的GUS染色檢測呈陽性，但毛狀根的芽分化率較低，再生率為1.6%。

對于同一物種的不同基因型，其體細(xì)胞胚發(fā)生的難易程度和發(fā)生頻率存在差別[14]，故不同基因型材料毛狀根誘導(dǎo)的適宜方法會(huì)有差異?！袊垺怯糜邳S瓜全基因組測序的品種[1]，前期的初步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用現(xiàn)有的黃瓜毛狀根誘導(dǎo)方法[11，15]，‘中國龍’毛狀根的誘導(dǎo)不穩(wěn)定、誘導(dǎo)率低，甚至出現(xiàn)不能誘導(dǎo)的現(xiàn)象。同時(shí)，以往的黃瓜毛狀根誘導(dǎo)體系中，大都是用 HgCl2為表面消毒劑[11，15]，考慮到 HgCl2的毒性，以及對環(huán)境的污染，探索其他合適的滅菌方法是非常有必要的，于是本文在以往建立起來的黃瓜毛狀根誘導(dǎo)體系的基礎(chǔ)上，從種子滅菌、共培養(yǎng)時(shí)間和菌液濃度3方面進(jìn)行探索，建立一套適合于‘中國龍’的毛狀根誘導(dǎo)體系，可為今后分析黃瓜基因功能、挖掘黃瓜優(yōu)良基因提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株及培養(yǎng)

試驗(yàn)所用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株為K599，由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Peter Gresshoff教授惠贈(zèng)。在侵染黃瓜子葉前，將活化好的農(nóng)桿菌單菌落接種于YEP培養(yǎng)基中，28℃振蕩暗培養(yǎng)16 h，待用。

1.2 植物材料

試驗(yàn)材料為黃瓜測序品種‘中國龍’，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃三文研究員惠贈(zèng)。

1.3 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基

共培養(yǎng) MS 培養(yǎng)基[16]：KNO31 900 mg·L-1、NH4NO31 650 mg·L-1、MgSO4·7H2O 370 mg·L-1、CaCl2332 mg·L-1、KI 0.83 mg·L-1、H3BO36.2 mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg· L-1、CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1、EDTA-Fe 0.036 71 mg·L-1、KH2PO4170 mg·L-1、肌醇 100 mg·L-1、甘氨酸 2 mg·L-1、鹽酸硫酸素 0.1 mg·L-1、鹽酸吡哆素 0.5 mg·L-1、煙酸 0.5 mg·L-1、蔗糖 3%、植物膠0.3%，pH 調(diào)至 5.5～5.8。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基及繼代培養(yǎng)基：在共培養(yǎng)MS平板培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素，最終配置成含羧芐青霉素（500mg·L-1）的 MS 平板培養(yǎng)基。

1.4 種子滅菌方法

在超凈工作臺(tái)中，將挑選出的飽滿種子用75%（φ，后同）乙醇消毒30 s，再用3個(gè)不同濃度的NaC-lO消毒液（濃度分別為1%、5%、10%）分別滅菌5、10、15、20 min，然后用無菌水漂洗4或5次，種植于已滅菌的墊有MS營養(yǎng)液潤濕的棉花的生長瓶中。每個(gè)生長瓶播10粒種子，每處理設(shè)置12個(gè)重復(fù)。置于24℃暗培養(yǎng)2 d，然后移入光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)8 d，溫度為白天24℃，夜晚24℃，每天12 h光照。

1.5 不同菌液侵染濃度處理

挑取活化后的單克隆菌落，接種到5 mL YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用MS液體培養(yǎng)基稀釋菌液濃度至 OD600值分別為 0.4、0.6、0.8和 1.2，待用。

在超凈工作臺(tái)上，取萌發(fā)10 d的黃瓜無菌苗子葉，用滅過菌的手術(shù)刀在子葉葉柄邊緣處將黃瓜子葉切成2個(gè)外植體。將手術(shù)刀浸入至活化過的、調(diào)好OD600值的菌液中，再將沾有發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的手術(shù)刀在黃瓜子葉表面輕輕地縱向和橫向劃若干刀口，每劃幾刀將手術(shù)刀放至菌液中浸泡，以保證傷口處都有菌液侵染到。然后使其傷口面朝下，接至準(zhǔn)備好的、鋪有濾紙的共培養(yǎng)MS平板培養(yǎng)基中（傷口面接觸濾紙），在26℃、光照條件下培養(yǎng)2 d。將培養(yǎng)好的受感染的黃瓜子葉外植體，傷口面朝上（切面不與培養(yǎng)基接觸），轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的毛根誘導(dǎo)用MS平板培養(yǎng)基，在24℃、遮光條件下暗培養(yǎng)。時(shí)常觀察根毛生長狀況。

1.6 共培養(yǎng)處理時(shí)間處理

用活化好的菌液調(diào)至OD600為1.2左右來侵染黃瓜幼苗，將侵染后的外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，先在26℃、光照條件下分別共培養(yǎng)2 d、3 d，再轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的毛根誘導(dǎo)用MS平板培養(yǎng)基上，在24℃、遮光條件下暗培養(yǎng)。觀察不同共培養(yǎng)時(shí)間對黃瓜毛狀根誘導(dǎo)的影響。

1.7 毛狀根rolC基因的PCR擴(kuò)增

利用Roger和Bendich的CTAB法[17]提取所獲得毛狀根的DNA，再利用文獻(xiàn)報(bào)道rolC基因引物[8]，擴(kuò)增毛狀根中的rolC基因，上游引物rolC-F：ATGGCGGAATTTGACCTATG，下游引物 rolC-R：TTAGTTCCATCTGCCCATCC。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為 20 μL，其中包括 10 μL Taq DNA 聚合酶，0.6 μL 10 μmol·L-1PCR 引物，和約0.2 μg DNA。用PTC-100型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，共 30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸 10min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌條件對于黃瓜‘中國龍’種子萌發(fā)的影響

摒棄對人畜有劇毒的滅菌劑升汞，試驗(yàn)采用75%的乙醇與不同濃度的次氯酸鈉相結(jié)合的方法對‘中國龍’進(jìn)行種子滅菌。結(jié)果表明，當(dāng)次氯酸鈉濃度低時(shí)，種子出現(xiàn)長菌的情況；提高次氯酸鈉的濃度，可以減少種子長菌的情況，但會(huì)抑制種子的萌發(fā)。統(tǒng)計(jì)各處理?xiàng)l件下能正常萌發(fā)的無菌苗的比例，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)次氯酸鈉濃度為1%時(shí)，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)長菌情況，萌發(fā)率在73%到89%之間；而當(dāng)次氯酸鈉濃度提高到10%時(shí)，種子長菌的情況減少，但黃瓜種子可能由于受到傷害，萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)率僅在78%到85%之間；當(dāng)次氯酸鈉濃度為5%，滅菌時(shí)間為5 min或10 min時(shí)，黃瓜種子的萌發(fā)率最高，均為96%。因此，先使用75%的乙醇處理種子30 s，再用5%的次氯酸鈉滅菌5～10 min，是獲取黃瓜‘中國龍’無菌幼苗的較好的滅菌方式。

圖1 不同滅菌條件對黃瓜萌發(fā)的影響

2.2 不同菌液濃度對黃瓜‘中國龍’毛狀根誘導(dǎo)的影響

菌液的OD600值反映了菌液的濃度，不同OD600值的菌液對于黃瓜毛狀根誘導(dǎo)的影響差異顯著。如表1可知，當(dāng)OD600值小于0.8時(shí)，毛狀根誘導(dǎo)率較低，在21.24%～57.69%之間。OD600值為1.2時(shí)，黃瓜毛狀根誘導(dǎo)率大大提高，為70.83%。故本試驗(yàn)中，菌液的OD600值在1.2左右時(shí)，是適合侵染的菌液濃度。

表1 不同濃度菌液對黃瓜毛狀根誘導(dǎo)的影響

2.3 不同共培養(yǎng)時(shí)間對于黃瓜‘中國龍’毛狀根誘導(dǎo)的影響

共培養(yǎng)時(shí)間是用菌液侵染外植體后，讓發(fā)根農(nóng)桿菌在沒有加抗生素的環(huán)境下與外植體共同生長的時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的過程利于菌液的侵染，共培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)，外植體容易長出毛狀根，而受到農(nóng)桿菌的污染較少，污染率僅為5.26%（表2）。但當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間超過2 d，農(nóng)桿菌的生長旺盛，后期難以抑制（圖版-a～b），農(nóng)桿菌的污染率達(dá)到了84.85%（表 2）。

表2 不同共培養(yǎng)時(shí)間對外植體農(nóng)桿菌污染的影響

2.4 黃瓜‘中國龍’毛狀根的誘導(dǎo)、生長狀況及鑒定

以黃瓜‘中國龍’子葉為外植體，在上述優(yōu)化條件下，可獲得大量毛狀根（圖版-c～g）。

以T-DNA上的rolC基因?yàn)闄z測對象，隨機(jī)選取7條從不同外植體上誘導(dǎo)出的毛狀根來抽取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在誘導(dǎo)獲得的毛狀根中都擴(kuò)增出期望大小的rolC基因片段，該片段與從發(fā)根農(nóng)桿菌K599的Ri質(zhì)粒DNA中擴(kuò)增出的特異性片段大小相同，而非轉(zhuǎn)化毛狀根的DNA未擴(kuò)增出任何DNA條帶（圖2），表明發(fā)根農(nóng)桿菌上的Ri T-DNA已整合到黃瓜的毛狀根基因組中，獲得的毛狀根為轉(zhuǎn)基因根。

圖2 毛狀根rolC基因的電泳檢測

3 討論與結(jié)論

以往所建立黃瓜毛狀根誘導(dǎo)體系中，大多采用升汞（HgCl2）進(jìn)行種子消毒[10-12]。升汞具有殺菌力強(qiáng)，滲透性好的特點(diǎn)，但對人畜有劇毒，且升汞滅菌后，較難徹底地清除殘留的汞。本試驗(yàn)利用乙醇和次氯酸鈉相結(jié)合的方法，探索了用不同濃度次氯酸鈉（1%、5%和 10%）分別滅菌 5、10、15、20 min，觀察種子污染和萌發(fā)的情況。結(jié)果表明，低濃度的次氯酸鈉無法徹底進(jìn)行種子的表面消毒，種子出現(xiàn)長菌污染的情況；而高濃度的次氯酸鈉則會(huì)傷害種子，導(dǎo)致種子萌發(fā)率降低。而在5%次氯酸鈉中消毒5～10 min的效果較好，污染少且萌發(fā)率高。所以本試驗(yàn)最終采用75%的乙醇先處理種子30 s，再用5%的次氯酸鈉滅菌5～10 min的種子消毒方法。

菌液濃度對誘導(dǎo)效果表現(xiàn)出一定的影響，過高或過低的菌液濃度都不利于毛狀根的誘導(dǎo)。徐明芳等[19]在研究大苞栝樓毛狀根誘導(dǎo)體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)其毛狀根的誘導(dǎo)率與菌液濃度在一定范圍內(nèi)呈線性上升關(guān)系，而隨著菌液濃度的增大又呈現(xiàn)非線性下降關(guān)系，認(rèn)為這是因?yàn)樵谝欢ň簼舛确秶鷥?nèi)，菌細(xì)胞越多越能增加感染的位點(diǎn)，有更多的菌株的質(zhì)粒能夠整合在外植體的基因組中，菌液濃度過高后對外植體細(xì)胞有損傷，毛狀根誘導(dǎo)率反而下降，菌液OD600值為0.7是大苞栝樓最適的發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化濃度。同樣，王麗等[20]在研究龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件時(shí)發(fā)現(xiàn)菌液OD600為0.6時(shí)，毛狀根誘導(dǎo)效果較好，而高于0.6后誘導(dǎo)效率急劇降低。本試驗(yàn)中，分析了菌液OD600從0.2到1.2時(shí)，‘中國龍’的毛狀根誘導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)菌液濃度過低起不到感染的目的，毛狀根誘導(dǎo)率低，當(dāng)OD600值在1.2左右時(shí)毛狀根誘導(dǎo)率比較合適。

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌侵染外植體后，在不含任何抗生素的條件下，讓農(nóng)桿菌和外植體共同生長的過程。研究發(fā)現(xiàn)共培時(shí)間的長短影響著毛狀根誘導(dǎo)率，這是因?yàn)榘l(fā)根農(nóng)桿菌的T-DNA與外植體整合需要一定的時(shí)間。共培養(yǎng)時(shí)間不夠，則不能完成T-DNA的轉(zhuǎn)移與整合，不能誘導(dǎo)毛狀根，不利于農(nóng)桿菌將發(fā)根基因誘導(dǎo)到外植體基因中，而共培養(yǎng)時(shí)間過長又會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌大量繁殖，給以后的除菌帶來困難，農(nóng)桿菌除不凈就會(huì)使外植體失活，直接影響誘導(dǎo)率。孫敏等[20]在研究共培養(yǎng)時(shí)間對發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)長春花發(fā)根時(shí)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)2 d時(shí)的毛狀根誘導(dǎo)率最高，達(dá)50.70%，從第3天開始，誘導(dǎo)率不斷下降。同樣，在龍葵上的研究結(jié)果也表明共培養(yǎng)2 d毛狀根誘導(dǎo)率最高[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明黃瓜‘中國龍’在毛狀根誘導(dǎo)過程中，如果共培養(yǎng)超過2 d，發(fā)根農(nóng)桿菌會(huì)過度生長，對外植體生產(chǎn)毒害，難以誘導(dǎo)毛狀根。

以黃瓜基因組測序品種‘中國龍’為材料，建立其毛狀根誘導(dǎo)體系，可為充分利用該品種進(jìn)行黃瓜的遺傳改良、挖掘黃瓜基因資源提供技術(shù)支撐。（本文圖版見彩插10）