黃瓜枯萎病拮抗菌GK-6抗菌物質的產生條件

張雪輝，唐 蕊，魏洪亮

（1.邢臺學院化學工程與生物技術學院 河北邢臺 054001； 2.保定市農業(yè)局 河北保定 071000）

黃瓜枯萎病是由半知菌亞門尖鐮孢菌黃瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.cucumerinumOwen.）所引起的一種在全球范圍內傳播的土傳真菌病害，該病一般可造成黃瓜產量下降10%～30%，嚴重時可致使黃瓜產量下降80%～90%，對黃瓜產量有很大影響[1-2]。近年來隨著黃瓜種植面積的增長，由連作重茬而引起的黃瓜枯萎病日漸嚴重。在實際生產中除了選用抗病品種、結合輪作倒茬和嫁接等栽培管理之外，使用藥劑防治是黃瓜枯萎病防治的重要方法，但當前因缺乏安全有效的藥劑，極易造成農藥殘留，從而危害人畜健康及環(huán)境安全。生物防治是目前研究克服土傳病害的重要方向，主要利用拮抗微生物及其產生的代謝物進行植物病害的預防與治理，又以其安全和高效的特點日益引起人們的關注[3-4]。筆者以從多年種植黃瓜的土壤中分離得到的對黃瓜枯萎病拮抗作用較好的菌株GK-6為試驗材料，通過試驗找出GK-6菌株抗菌代謝物產生的最佳培養(yǎng)條件，為開發(fā)新型生物藥劑提供理論依據，進而為黃瓜的綠色生產保駕護航。

1 材料與方法

1.1 材料

拮抗菌GK-6、黃瓜枯萎病菌菌株均由邢臺學院微生物實驗室提供。

培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）、LB液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 母液制備 將保存的菌種GK-6轉接到LB培養(yǎng)基平板上活化，24h后接種于100mL液體培養(yǎng)基中，然后在28℃、170 rpm振蕩條件下培養(yǎng)24 h,經血球計數板計數得到密度為4.2×108cfu·mL-1的懸浮液，置于4℃冰箱保存，作為母液備用[5]。

1.2.2 培養(yǎng)時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響 將母液按1∶20的比例接種于盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，并分為7組，培養(yǎng)條件設置為28℃下170 rpm振蕩培養(yǎng)，之后分別在8、16、24、32、40、48、56 h 時取出離心，無菌過濾，保留濾液。將牛津杯放置于混有黃瓜枯萎病菌的PDA平板上，每牛津杯中加入20μL濾液，每處理10次重復，在28℃培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈直徑[6-7]。

1.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對發(fā)酵液抑菌活性的影響 將100 mL LB液體培養(yǎng)基用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH 調節(jié) pH 值至 5、6、7、8、9、10 標記后滅菌。每瓶加入5mL母液，在搖床上28℃、170rpm條件下振蕩培養(yǎng)48 h，取出離心過濾，測定濾液抑菌活性，方法同1.2.2。

1.2.4 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響 將5 mL母液分別加入到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，分別在 24、28、30、32、36 ℃和 170 rpm條件下培養(yǎng)48 h，然后取出離心過濾，測定濾液抑菌活性，方法同1.2.2。

1.2.5 接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響 將母液分別以 0、0.5、1、3、5、7、10 mL 的接種量加到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在28℃、170 rpm條件下培養(yǎng)48 h，然后取出離心過濾，測定濾液抑菌活性，方法同1.2.2。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

從圖1可看出，菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性最初隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸提高，培養(yǎng)到40 h時抑菌圈直徑達到最大值28 mm，隨后抑菌活性則開始下降。結果表明，其最佳發(fā)酵時間應為40 h。

圖1 培養(yǎng)時間對菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖2可知，培養(yǎng)基的初始pH對菌株GK-6的抑菌活性影響較大。當pH處于5～7之間時隨著pH的增大，抑菌活性會明顯增強，在pH=7時抑菌圈直徑達到了最大值27.9 mm，pH=8時略有下降，抑菌圈直徑為27.0 mm，當pH處于8～10之間時，抑菌活性明顯下降。結果表明，pH 7～8的弱堿性培養(yǎng)條件是菌株GK-6抗菌物質產生的較適條件。

圖2 初始pH值對菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖3可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的增加，GK-6菌株抑菌活性逐漸增強，溫度到達30℃時抑菌活性最高，達到28.1 mm，之后抑菌活性會隨著溫度的升高而逐漸下降。結果表明，30℃是其抗菌物質產生的最佳溫度。

圖3 培養(yǎng)溫度對菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.4 接種量對菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

從圖4可知，不同的接種量對GK-6抑菌活性影響較大，最初隨著接種量的增加,GK-6發(fā)酵液的抑菌活性增高,當接種量為5 mL時GK-6的抑菌活性達到最高,抑菌圈直徑達28.8 mm,而后隨著接種量增大,抑菌活性反而降低。結果表明，接種量為5 mL，即接種量為5%（φ，下同）時其抑菌活性最強。究開發(fā)階段。

圖4 接種量對菌株GK-6發(fā)酵液抑菌活性的影響

本研究結果表明拮抗菌GK-6產生抗菌物質的最佳培養(yǎng)條件是培養(yǎng)液初始pH 7～8，接種比例為5%時，在30℃，170 rmp振蕩培養(yǎng)40 h。雖然該結果僅僅是通過室內搖瓶培養(yǎng)而得到的，不能直接轉化為實際工業(yè)化生產的參考依據，但仍具有一定的參考價值，為其商品化開發(fā)奠定了一定的基礎[10]。為充分發(fā)揮生防菌的潛力做好準備，對GK-6的特性及其有效使用劑量、使用時間等問題還需進一步研究。

3 討論與結論

連茬和重茬使得黃瓜枯萎病發(fā)生日趨嚴重，特別是保護地栽培表現(xiàn)尤為明顯，成為黃瓜生產中的毀滅性病害。培育和應用抗病品種是防治此病害最經濟有效的措施。但由于枯萎病抗源材料不足，傳統(tǒng)育種方法周期長，抗性品種有限。雖然采用傳統(tǒng)育種方法和細胞工程、基因工程等現(xiàn)代生物技術相結合以選育抗枯萎病新品種在西瓜抗病育種取得了重大突破，但在黃瓜上還需時日。因此，栽培上絕大部分仍是感病品種[8]。在追求食品品質的今天，隨著現(xiàn)代農業(yè)的發(fā)展，生物源農藥的研發(fā)成為熱點。國內外針對黃瓜枯萎病展開的生防菌研究越來越熱，目前在生產上應用的主要有真菌、細菌、放線菌等，其應用主要是活菌制劑和抗生素兩種。世界上成功應用的有芬蘭的一種活體制劑My-costop和我國的由細黃鏈霉菌制成的“5406”[9]。目前生防菌的研究大多數處于待研