慢性乙型肝炎治療前X區(qū)變異與聚乙二醇干擾素α-2a治療療效的關(guān)系研究

靳麗　李明慧　張丹　屈曉晶　張英　齊天林　曹衛(wèi)華　張璐　路遙　華文浩　張書鳳　萬鋼　劉順愛　謝堯

100015 北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院(靳麗、謝堯)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院肝病中心肝病二科(李明慧、張丹、屈曉晶、張英、齊天林、曹衛(wèi)華、張璐、路遙、華文浩、張書鳳、萬鋼、劉順愛)

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·病毒病診斷與治療·

慢性乙型肝炎治療前X區(qū)變異與聚乙二醇干擾素α-2a治療療效的關(guān)系研究

靳麗李明慧張丹屈曉晶張英齊天林曹衛(wèi)華張璐路遙華文浩張書鳳萬鋼劉順愛謝堯

100015 北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院(靳麗、謝堯)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院肝病中心肝病二科(李明慧、張丹、屈曉晶、張英、齊天林、曹衛(wèi)華、張璐、路遙、華文浩、張書鳳、萬鋼、劉順愛)

目的探討慢性乙型肝炎治療前X區(qū)變異與聚乙二醇干擾素α-2a治療療效的相關(guān)性。方法收集HBeAg陽性慢乙肝患者，給予聚乙二醇干擾素α-2a治療，收集基線及治療12周后的患者血清。12周后根據(jù)HBVDNA下降水平分為三組：DNA應(yīng)答組、DNA部分應(yīng)答組、DNA無應(yīng)答組。對患者基線血清進(jìn)行全序列擴(kuò)增、克隆、測序。通過logistic回歸分析確定與聚乙二醇干擾素α-2a治療療效相關(guān)的變異位點(diǎn)，取P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果共對29例患者進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析，DNA應(yīng)答組7人、DNA部分應(yīng)答組9人、DNA無應(yīng)答組13人。各組間基線ALT水平比較(χ2=10.732，P=0.005),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。年齡、性別、HBVDNA、HBsAg、HBeAg、HBeAb比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共獲得306條序列，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及結(jié)合臨床應(yīng)答，得到X區(qū)核苷酸變異位點(diǎn)共16個(gè)，進(jìn)一步進(jìn)行多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)ntG1386A、ntG1437A、ntG1515A有利于干擾素抗病毒治療；ntC1383A、ntT1425C、ntG1512A不利于干擾素抗病毒治療。氨基酸水平分析發(fā)現(xiàn)V5M、G22S和D48N是干擾素治療的有利因素，V30L和A47T是不利因素。結(jié)論基線X區(qū)變異與聚乙二醇干擾素α-2a治療療效可能相關(guān)。

【主題詞】肝炎，乙肝，慢性；聚乙烯二醇類；干擾素α-2a；突變

Fund programs: National Natural Science Fundation of China(81071344);Beijing Science and Technology Commission Major Project (12110000391200)

目前干擾素是慢性乙型肝炎(慢乙肝)有效的抗病毒治療方法之一。然而，使用干擾素后，并不是所有患者都能取得完全病毒學(xué)應(yīng)答，部分患者體內(nèi)病毒仍然能復(fù)制并引發(fā)疾病，這是由于病毒本身具有一些能抵抗干擾素作用的機(jī)制。盡管已經(jīng)有大量研究表明HBV能夠抵抗干擾素抗病毒的作用，但具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。X區(qū)位于nt1374-1838，共465 bp，編碼一個(gè)154個(gè)氨基酸的功能蛋白(HBx)。X區(qū)與增強(qiáng)子Ⅱ(nt1636-1744)及BCP(nt1751-1769)重疊，這兩個(gè)區(qū)域均與前C/C 基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。HBx對干擾素α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有影響[1,2]。本研究旨在發(fā)現(xiàn)X區(qū)與干擾素α治療療效相關(guān)的變異位點(diǎn)，以進(jìn)一步指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

1　對象與方法

1.1研究對象慢乙肝初治患者(1)ALT升高3個(gè)月以上；(2)HBVDNA>1.0E+2IU/ml，HBsAg陽性，HBeAg陽性6個(gè)月以上；(3)排除肝硬化/肝癌，不合并妊娠；(4)不合并其他病毒感染，如HCV、HIV等。對入組患者給予聚乙二醇干擾素α-2a 180 μg 每周一次/皮下注射抗病毒治療。對患者進(jìn)行12周的抗病毒治療后，根據(jù)HBV DNA的下降程度，將入組患者分為三組：DNA應(yīng)答組 (治療12 W后HBVDNA<1.0E+2 IU/ml);DNA部分應(yīng)答組(治療12 W后HBVDNA下降>2 log，但未轉(zhuǎn)陰)；DNA無應(yīng)答組 (治療12 W后HBVDNA與基線比較未下降)。本研究已通過北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過。

1.2序列擴(kuò)增、克隆與測序治療前及12周分別檢測患者ALT、HBVDNA(深圳匹基公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑，檢測下限100 IU/ml)、HBsAg、HBeAg、HBeAb(HBsAg、HBeAg、HBeAb含量采用美國雅培Abbott Architect i2000試劑檢測)。收集患者基線12及之后的系列血清，保存于-20℃冰箱。用QIAmp DNA Blood Mini kit(德國Qiagen公司)提取基線血清HBVDNA。正向引物為5＇TGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAA3＇，反向引物為5＇AGTTGCATGGTGCTGGTGMRCASA3＇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，50個(gè)循環(huán)；72℃終末延伸10 mim。用TianGen凝膠回收試劑盒(德國Qiagen公司)純化回收PCR產(chǎn)物。純化回收的DNA與pCR2.1 vector連接，轉(zhuǎn)化，鑒定陽性克隆后擴(kuò)增，送至北京Invitrogen公司進(jìn)行測序。

1.3序列比對用VectorNTI進(jìn)行序列拼接，在GenBank中選擇X04615為參考序列，用ClustalX2進(jìn)行序列比對。最終選取nt1374-1838為序列研究區(qū)域。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SAS9.2對各組間X區(qū)核苷酸位點(diǎn)突變進(jìn)行頻數(shù)和頻率統(tǒng)計(jì)，組間差異進(jìn)行卡方或Fisher檢驗(yàn)?；颊吲R床資料用SPSS17.0進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。對影響干擾素治療療效的因素用SPSS17.0進(jìn)行Logistic回歸分析。取P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1患者人口學(xué)和基線臨床資料比較共對29例患者進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析，DNA應(yīng)答組7人、DNA部分應(yīng)答組9人、DNA無應(yīng)答組13人?；颊呷丝趯W(xué)和基線臨床資料比較見表1。其中，DNA應(yīng)答組患者ALT水平偏高，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.732，P=0.005)。年齡、性別、HBVDNA、HBsAg、HBeAg、HBeAb各組間比較未發(fā)現(xiàn)有顯著差異。

2.2X區(qū)核苷酸變異位點(diǎn)比較測序獲得306條序列，其中DNA應(yīng)答組115條序列、DNA部分應(yīng)答組59條、DNA無應(yīng)答組132條。在X區(qū)發(fā)現(xiàn)可能與干擾素治療療效相關(guān)的核苷酸變異位點(diǎn)共16個(gè)(表2)，其中7個(gè)(nt1386、nt1437、nt1441、nt1480、nt1482、nt1494、nt1605)可能有利于干擾素治療HBVDNA清除，其余9個(gè)(nt1383、nt1425、nt1461、nt1512、nt1515、nt1518、nt1634、nt1667、nt1721)則可能不利于干擾素治療。

表1　患者人口學(xué)和基線臨床資料統(tǒng)計(jì)±s)

表2　X區(qū)核苷酸重要突變位點(diǎn)

注：*括號內(nèi)為突變頻率(%)；A:丙氨酸D:天冬氨酸G:甘氨酸H:組氨酸L:亮氨酸N:天冬酰胺R:精氨酸S:絲氨酸T:蘇氨酸V:纈氨酸Y:酪氨酸

Note：* Mutation frequency is shown in brackets(%)；A:alanineD: aspartic acidG:glycineH:histidine L:leucineN:asparagineR:arginine S:serineT:threnineV:valineY:tyrosine

根據(jù)治療12周后HBV DNA是否消失重新分組：分為DNA消失組及DNA未消失組，首先進(jìn)行單因素logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的位點(diǎn)，再進(jìn)行多因素分析。多因素logistic回歸分析(表3)發(fā)現(xiàn)nt1386、nt1437和nt1515突變是干擾素抗病毒治療的獨(dú)立有利因素，nt1383、nt1425和nt1512是不利因素。

2.3X區(qū)氨基酸變異位點(diǎn)比較用MEGA5.1將X區(qū)核苷酸轉(zhuǎn)換為氨基酸，進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)核苷酸水平突變有的造成氨基端位點(diǎn)改變，有的則未造成改變(見表2)。進(jìn)一步進(jìn)行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，V5M、G22S和D48N對干擾素治療清除HBV DNA有利，V30L和A47T不利于治療(表4)?？梢奨區(qū)氨基酸水平變異對干擾素治療療效也有影響

3　討論

在HBeAg陽性慢乙肝初治患者中,雖然影響干擾素治療的因素有很多，如ALT水平、性別、年齡、HBV DNA含量以及干擾素治療史等[3]，但本研究僅發(fā)現(xiàn)高ALT水平與干擾素治療療效相關(guān)。HBx是HBV復(fù)制所需的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可通過下列機(jī)制影響干擾素的療效：如HBx通過表達(dá)時(shí)會(huì)STA1甲基化，從而影響下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]，HBx可通過激活PKR抑制HBV復(fù)制[5]，HBx能激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB等[6]。HBx過表達(dá)時(shí)會(huì)上調(diào)蛋白磷酸酶A2(PP2A),通過抑制鳥氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)的活性來抑制STAT1甲基化，從而影響下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]；④HBx是TLR刺激干擾素產(chǎn)生的一種抑制劑，在啟動(dòng)子水平抑制MxA的表達(dá)，并抑制細(xì)胞蛋白酶體活性[9]；⑤HBx能激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和ERKs等，同時(shí)可上調(diào)TNF-α的表達(dá)[10]。因此我們推測X區(qū)與干擾素作用發(fā)揮具有相關(guān)性。

表3　X區(qū)核苷酸和氨基酸變異多因素Logistic回歸分析結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)nt1386、nt1437和nt1515突變有利于干擾素治療HBV DNA清除,nt1383、nt1425和nt1512突變不利于干擾素治療。這些核苷酸突變均位于轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(nt1200-1645)中，其主要功能是促進(jìn)病毒mRNA出核和抑制mRNA剪接[7]。干擾素抗HBV的機(jī)制也主要在RNA水平，因此推測轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件在干擾素治療中起重要作用;其某些位點(diǎn)的突變可能增加HBV對干擾素治療的抑制作用，有的突變則有利于干擾素治療。

此外HBx是一個(gè)具有去泛素化作用的酶，能抑制干擾素調(diào)節(jié)元件IRF3和IRF7的泛素化，其N端具有主要的去泛素活性[2]?；贖Bx在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中的作用將其分為兩個(gè)區(qū)域：N端負(fù)性調(diào)節(jié)區(qū)域(aa1-50)和C端反式激活區(qū)(aa51-154)。我們的研究發(fā)現(xiàn)氨基酸位點(diǎn)改變(V5M、G22S、V30L、A47T、D48N)均位于N端負(fù)性調(diào)節(jié)區(qū)域，且V30L、A47T、D48N位于B細(xì)胞免疫表位(aa29-48)中,可能提示在免疫水平N端與干擾素治療療效關(guān)系更為密切。有研究發(fā)現(xiàn)HBx5的突變可上調(diào)NF-κB的活性[8]，發(fā)揮間接的抗病毒作用，可能與我們的研究結(jié)果一致。G22S、V30L、A47T、D48N則未見與干擾素治療有關(guān)的研究報(bào)道，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證?；谝陨戏治觯覀兊难芯刻崾局委熐癤區(qū)變異與聚乙二醇干擾素α-2a治療療效有一定的相關(guān)性，但由于本研究所獲得的序列條數(shù)較少，結(jié)果具有有限的臨床指導(dǎo)使用價(jià)值。本課題組下一步將在此研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步對其進(jìn)行驗(yàn)證。

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Study on the relationship between X region mutations of chronic hepatitis B and curative effect of pegylated interferon α-2a

JinLi,LiMinghui,ZhangDan,QuXiaojing,ZhangYing,QiTianlin,CaoWeihua,ZhangLu,LuYao,HuaWenhao,ZhangShufeng,WanGang,LiuShunai，XieYao

LiverCenterofBeijingDitanHospital,PekingUniversityTeachingHospital,Beijing100015,China(JinL,XieYao);SecondDivisionofLiverDiseasesCenter,BeijingDitanHospital,CapitalMedicalUniversityBeijing100015,China(LiMH,ZhangD,QuXJ,ZhiangY,QiTL,CaoWH,ZhangL,LuY,HuaWH,ZhangSF,WanG,LiuSA)

XieYao，Email：xieyao00120184@sina.com;LiuShunai,Email：liusa1031@sina.com

Objective To study the relationship between X region mutations of chronic hepatitis B and curative effect of pegylated interferon α-2a. MethodsPatients with chronic hepatitis B (e antigen positive) were enrolled, treated with pegylated interferon α-2a. Enrolled patients serum specimens of base line and after 12 weeks treatment were collected. After 12 weeks, depending on the HBV DNA falling degree,patients were divided into three groups: DNA response group, DNA partial response group, DNA non-response group. Then HBV full genome in the serum (baseline) was amplificated, cloned and sequenced. Analysis the relationship of X region mutations and pegylated interferon α-2a treatment-related effect by logistic regression.P<0.05 was considered statistically significant. Results29 patients data was analyzed,which including T patients from DNA response group, 9 palients from DNA partial response group and 13 palients from DNA non-response group. At baseline, the difference of ALT was statistically significant(χ2=10.732，P=0.005). Among three groups, the differences of age, gender, HBVDNA, HBsAg and HBeAg, HBeAb were not statistically significant. Total of 306 sequences were obtained. The number of X region nucleotide mutation sites, according to statistically significant and clinical response,was 16.Multivariate logistic regression analysis showed ntG1386A, ntG1437A and ntG1515A were in favor of interferon antiviral therapy;but ntC1383A,ntT1425C and ntG1512A are risk factors unfavorable for interferon antiviral therapy. Amino acid level analysis found that V5M, G22S and D48N were favorable factors for interferon treatment, but V30L and A47T were negative factors for interferon treatment. ConclusionsX region mutations may be correlated with therapeutic effect of pegylated interferon α-2a.

Hepatitis B, Chronic；Polyethylene glycols; Interferon alfa-2a；Muation

謝堯，Email：xieyao00120184@sina.com； 劉順愛，Email：liusa1031@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.013

國家自然科學(xué)基金(81071344);北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重大項(xiàng)目(D121100003912001)

2016-03-09)