戊型肝炎病毒ORF3蛋白對(duì)人肝細(xì)胞CCL13增殖及細(xì)胞周期的影響

陳琳　梁玉河　楊曉軍　原新慧　劉志武　袁宏　高鵬

730000 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院傳染科(陳琳、原新慧、劉志武、袁宏); 721001 寶雞市人民醫(yī)院胸外腫瘤科(梁玉河); 730000 蘭州， 甘肅省人民醫(yī)院普外2科(楊曉軍、高鵬)

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·論著·

戊型肝炎病毒ORF3蛋白對(duì)人肝細(xì)胞CCL13增殖及細(xì)胞周期的影響

陳琳梁玉河楊曉軍原新慧劉志武袁宏高鵬

730000 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院傳染科(陳琳、原新慧、劉志武、袁宏); 721001 寶雞市人民醫(yī)院胸外腫瘤科(梁玉河); 730000 蘭州， 甘肅省人民醫(yī)院普外2科(楊曉軍、高鵬)

【主題詞】肝炎病毒，戊型；ORF3蛋白；增殖；細(xì)胞周期

Fund programs: Youth Fund of Gansu Provincial Sci.& Tech. (145RJYA247)；National Natural Science Fund of China(81260326)

戊型病毒性肝炎(戊肝)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)感染而引起的急性傳染病，主要經(jīng)消化道傳播。戊肝雖是自限性疾病，但其病死率高于甲型與乙型肝炎，在孕婦中的病死率甚至可高達(dá)20%-30%[1]。近年來(lái)戊肝病例在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2009年戊肝在急性病毒性肝炎中所占比例已由8.85%上升至31.62%[2]。HEV為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)7.5 kb，基因組包含3個(gè)相互重疊的開放讀碼框(ORF)；ORF1編碼與病毒基因組復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白；ORF3編碼一種磷酸化的蛋白，此蛋白可能在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒顆粒裝配及釋放中起重要作用[3-5]。然而，由于病毒在體外的大量復(fù)制難以實(shí)現(xiàn)，使得針對(duì)ORF3編碼蛋白的相關(guān)功能研究受到限制。

在前期研究中，我們成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pDsRed-Monomer-N1-ORF3，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，檢測(cè)ORF3蛋白的表達(dá)及在細(xì)胞中的定位，為HEV ORF3的功能研究奠定了基礎(chǔ)[6]。本研究中，我們進(jìn)一步將真核表達(dá)載體pDsRed-Monomer-N1-ORF3，轉(zhuǎn)染至人張氏肝細(xì)胞Changliver(CCL13)，研究其對(duì)人肝細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及載體:人張氏肝細(xì)胞(Changliver,CCL13)為甘肅省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心凍存復(fù)蘇，最初購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；真核表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-Monomer-N1-ORF3為本室構(gòu)建，構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)[4]。

1.2方法

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：3組CCL13細(xì)胞，包括未轉(zhuǎn)染(Blank)組、空質(zhì)粒(Control)轉(zhuǎn)染組以及ORF3質(zhì)粒(ORF3)轉(zhuǎn)染組，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。加入RPMI1640培養(yǎng)基200 μl。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為接種后1、2、3、4、5、6 d，檢測(cè)前每孔加入培養(yǎng)基180 μl、5 mg/ml MTT 20 μl、37 ℃孵育4 h后吸棄孔內(nèi)上清，每孔加DMSO 150 μl，振蕩10 min，酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀490 nm測(cè)定光吸收值，記錄結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：3組CCL13細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，孵育48 h，離心收集細(xì)胞并用300 μl PBS 重懸，加入1 ml 0 ℃預(yù)冷無(wú)水乙醇振蕩，-20 ℃冰箱過(guò)夜固定。次日1 500 rpm 離心10 min，棄上清，1 ml PBS 重懸，室溫15 min。再次1 500 rpm 離心5 min，棄上清，依次加入100 μl PBS、5 μl RNaseA、300 μl 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混勻后避光溫浴30 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4蛋白印跡法(Western-Blot)檢測(cè)細(xì)胞周期素的表達(dá)：收集融合度70%-80%左右、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三組細(xì)胞(Blank、Control、ORF3)，使用總蛋白提取試劑(含PMSF的RIPA)提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白緩沖液，100 ℃變性5 min 后-80 ℃凍存。取蛋白樣品30 μg進(jìn)行SDS-PAGE，15%分離膠分離蛋白，濃縮膠為4%。PVDF轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2 h，洗膜，加I抗(兔抗人Cyclin Dl、Cyclin E1、CyclinA2、CyclinB1及GAPDH抗體，抗體濃度1∶500-1 000) 4 ℃過(guò)夜，孵育后洗膜，加II抗(羊抗兔IgG II抗，抗體濃度1∶2 000) 4 ℃孵育4 h。用化學(xué)發(fā)光法顯色分析目的蛋白表達(dá)情況，GlyKo Bandscan 5.0軟件系統(tǒng)(Glyko Inc,USA)分析目標(biāo)條帶。

A：ORF3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCL13細(xì)胞24 h；B: ORF3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCL13細(xì)胞48 h；C：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCL13細(xì)胞24 h；D：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCL13細(xì)胞48 h圖1　真核表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-Monomer-N1-ORF3成功轉(zhuǎn)染A: 24 h after ORF3 plasmid transfected into CCL13; B: 48 h after ORF3 plasmid transfected into CCL13; C: 24 h after empty plasmid transfected into CCL13; D: 48 h after empty plasmid transfected into CCL13 Fig.1　Eukaryotic expression plasmid pDsRed-Monomer-N1-ORF3 transfected into CCL13 cell

2　結(jié)果

2.1真核表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-Monomer-N1-ORF3及空質(zhì)粒pDsRed-Monomer-N1成功轉(zhuǎn)染CCL13細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下，轉(zhuǎn)染pDsRed-Monomer-N1-ORF3質(zhì)粒(ORF3組)及空質(zhì)粒(對(duì)照組)后24 h、48 h的CCL13細(xì)胞能看到特異性的紅色熒光表達(dá)，說(shuō)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功(圖1)。

2.2ORF3蛋白對(duì)CCL13細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞培養(yǎng)1-6 d，MTT法檢測(cè)對(duì)照組和空白組細(xì)胞增殖速度相近，無(wú)顯著差異；而ORF3組細(xì)胞與空白組細(xì)胞相比較，在培養(yǎng)第1-3天，細(xì)胞增殖速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；從第4天開始至第6天，ORF3組細(xì)胞增殖明顯受抑，兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，P<0.05)。

A：MTT結(jié)果；B: MTT結(jié)果定量分析(*P<0.05)圖2　ORF3蛋白對(duì)CCL13細(xì)胞增殖的影響A: MTT results; B: Quantitative analysis for MTT results(*P<0.05)Fig.2　Effect of ORF3 protein on proliferation of CCL13 cell

2.3ORF3蛋白對(duì)CCL13細(xì)胞周期的影響三組細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞量最多；ORF3組的細(xì)胞周期主要分布于G0/G1期，與空白相比(67.35±5.03% vs 55.34±5.12%，P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)照組(58.63±4.23%)與空白相比(55.34±5.12%)，細(xì)胞周期不同階段的分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.4ORF3蛋白對(duì)CCL13細(xì)胞周期素的影響

與對(duì)照組及空白相比， ORF3組細(xì)胞中細(xì)胞周期素Cyclin Dl及Cyclin E1的表達(dá)減少，而和G2期相關(guān)的細(xì)胞周期素Cyclin A2及CyclinB1的蛋白表達(dá)水平無(wú)差異(圖4)。

A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；B: 定量分析(*P<0.05)圖3　ORF3蛋白對(duì)CCL13細(xì)胞周期的影響A: FCM results; B: Quantitative analysis for FCM results(*P<0.05)Fig.3　Effects of ORF3 protein on cell cycle of CCL13 cell

圖4　ORF3蛋白對(duì)CCL13細(xì)胞周期素的影響Fig.4　Effects of ORF3 protein on the expression of cycling in CCL13 cell

3　討論

病毒為了利于自身復(fù)制往往會(huì)影響宿主的細(xì)胞周期，其中關(guān)于DNA病毒調(diào)控宿主細(xì)胞周期的相關(guān)研究較多。如腺病毒[7,8]、人乳頭瘤病毒(HPV)[9]自身缺乏多聚酶，因此可以編碼一些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，促使細(xì)胞進(jìn)入S期從而利于病毒自身基因組合成。此外，一些較大的DNA病毒，如皰疹病毒則是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯G0/G1期，避免和宿主細(xì)胞進(jìn)行DNA合成的競(jìng)爭(zhēng)而利于病毒自身復(fù)制[10]。近年來(lái)，有關(guān)RNA病毒對(duì)宿主細(xì)胞周期影響的研究也逐漸增多：如隸屬于冠狀病毒家族的感染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞G2/M期阻滯[11]，鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)和嚴(yán)重的SARS病毒能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞阻滯于GO/Gl期。

至于HEV ORF3蛋白的功能研究，王晶晶等[12]在肝癌細(xì)胞系Huh7中的研究證實(shí)：ORF3蛋白可以阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，抑制Huh7細(xì)胞的增殖活性；趙振宇等[13]在肝癌細(xì)胞系HePG2中細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒表達(dá)HEV-ORF3蛋白后，發(fā)現(xiàn)HEV-ORF3蛋白可通過(guò)PI-3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活NF-κB，使其從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，提示HEV感染人體后的肝細(xì)胞損傷可能與NF-κB活化后的炎癥反應(yīng)有關(guān)。但是，這些研究選用的都是肝癌細(xì)胞系，不能完全代表HEV在正常肝細(xì)胞中的情況。

CCL13是在人正常肝細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上經(jīng)一定的處理而能連續(xù)傳代，且保留有正常肝細(xì)胞特征和超微結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞。已有學(xué)者在對(duì)丙型肝炎病毒的功能研究中采用CCL13細(xì)胞并取得滿意效果[14]，因此我們認(rèn)為在對(duì)HEV的研究中，CCL13肝細(xì)胞株是一種非常理想的細(xì)胞株。

在本研究中，我們采用本室構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-Monomer-N1-ORF3，成功轉(zhuǎn)染CCL13，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ORF3蛋白可以使CCL13細(xì)胞增殖受抑；通過(guò)細(xì)胞周期檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)ORF3組的細(xì)胞周期主要分布于G0/G1期；Western-Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ORF3組細(xì)胞中細(xì)胞周期素Cyclin Dl及Cyclin E1的表達(dá)減少，這正是細(xì)胞周期停滯于G0/G1期的原因。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與前述王晶晶等在肝癌細(xì)胞系Huh7中的研究結(jié)果相符[12]，我們由此推斷HEV可能也是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，從而促進(jìn)其自身的復(fù)制，而達(dá)到在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活的目的，這種功能可能是由0RF3蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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Effects of hepatitis E virus open reading frame 3 protein on the proliferation and cell cycle of Chang liver cells

ChenLin,LiangYuhe,YangXiaojun,YuanXinhui,LiuZhiwu,YuanHong,GaoPeng

DepartmentofInfectiousDisease,TheFirstAffiliatedHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China(ChenL,YuanXH,LiuZW,YuanH);DepartmentofThoracicOncologySurgery,ThePeople′sHospitalofBaojiCity,Baoji721000,China(LiangYH);DepartmentofGeneralSurgery,GansuProvincialHospital,Lanzhou730000,China(YangXJ,GaoP)

YangXiaojun,Email:yangxjmd@aliyun.com

ObjectiveTo study the effect of hepatitis E virus Open Reading Frame 3 protein on the proliferation and cell cycle of Chang liver cells (CCL13). MethodsThe pDsRed-Monomer-N1-ORF3 recombinant plasmid was transfected into CCL13 cells via lipofectamine 2 000 reagent, then assayed cell proliferation by MTT assay; Flow cytometric was used to detect cell cycle after dying with PI; and the cell cycle proteins expression were detected by western-blotting. ResultspDsRed-Monomer-N1-ORF3 recombinant plasmid was successfully transfected into CCL13 cells, Expression of ORF3 can inhibit the proliferation activity of CCL13 cells from the 3rdday (P<0.01), and prevent the cell cycle in G0/G1 phase; Western Blot showed expression of cell cycle proteins cyclin D1 and cyclin E1 were decreased in ORF3 group compared with the control group; However, the expression of cyclin A2 and cyclin B1 had no significantly difference in three groups. ConclusionsHEV-ORF3 can inhibits the proliferation activity of CCL13 cells by inhibition expression of cell cycle proteins cyclin D1 and cyclin E1.

Heptitis E; ORF3; Proliferation; Cell cycle

楊曉軍， Email: yangxjmd@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.009

甘肅省青年科技基金計(jì)劃(145RJYA247)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81260326)

2016-01-24))