負載Ad5-HIVgag/env的DC疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性研究

劉超　何小周　劉雪　徐柯　曾毅　馮霞

100124 北京工業(yè)大學生命科學與生物醫(yī)學工程學院病毒與藥理室 (劉超、劉雪、曾毅)；100052 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室 (何小周、徐柯、馮霞)

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·論著·

負載Ad5-HIVgag/env的DC疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性研究

劉超何小周劉雪徐柯曾毅馮霞

100124 北京工業(yè)大學生命科學與生物醫(yī)學工程學院病毒與藥理室 (劉超、劉雪、曾毅)；100052 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室 (何小周、徐柯、馮霞)

目的用Ad5-HIV gag/env負載小鼠樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)，探索其在小鼠體內(nèi)誘導的HIV Gag/Env特異性細胞免疫應(yīng)答。方法貼壁法分離純化BALB/c小鼠DCs，并用細胞因子誘導DC細胞成熟，采用流式細胞術(shù)鑒定其純度。利用重組腺病毒Ad5-HIV gag/env感染DC細胞,制備DC疫苗。用所制備DC疫苗免疫小鼠，在免疫后的不同時間點，用ELISPOT方法檢測小鼠體內(nèi)HIV特異性細胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果成功培養(yǎng)出Ad5-HIVgag/env負載的DC疫苗；免疫熒光以及流式細胞術(shù)檢測到Gag/Env抗原可在DC內(nèi)有效表達；上述DC疫苗免疫小鼠后能誘導高水平HIV特異性細胞免疫反應(yīng)。結(jié)論Ad5-HIV gag/env負載的樹突狀細胞疫苗可以在小鼠體內(nèi)誘導較強的HIV特異性細胞免疫反應(yīng)。

【主題詞】樹突狀細胞疫苗；細胞治療；腺病毒；HIV-1

Fund programs: National Scinence and Technology Major Project of China((2012ZX10001-005)

樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)在人體內(nèi)分布廣泛，是功能最強的抗原提呈細胞(Antigen presen-ting cells, APC)，其對抗原的提呈能力遠高于巨噬細胞等其他免疫細胞，同時，DC也是唯一能激活初始型T細胞的APC，在特異性免疫應(yīng)答過程中起到重要作用。離體的DCs經(jīng)抗原刺激后回輸?shù)襟w內(nèi),能夠遷移到淋巴結(jié)并釋放出多種細胞因子,同時激活T淋巴細胞的分化和增殖[1],誘導產(chǎn)生抗原特異性的細胞毒性T細胞(CTL)，進而對特異性靶細胞進行殺傷，這是將DC疫苗用于細胞治療的理論基礎(chǔ)[2]。使用表達HIV-1抗原的DC疫苗對HIV-1感染者進行免疫治療的研究已取得了初步進展[3]。本研究中，我們使用表達HIVgag/env基因的腺病毒載體疫苗(Ad5-HIVgag、Ad5-HIVenv)感染小鼠骨髓DCs，獲得負載HIV Gag/Env的DCs疫苗(DC-Ad5-HIV gag、DC-Ad5-HIV env),單獨或聯(lián)合免疫小鼠，觀察其誘導產(chǎn)生的HIV抗原特異性細胞免疫反應(yīng)。

1　材料與方法

1.1材料腺病毒載體疫苗rAd5-HIVgag和rAd5-HIVenv均由本實驗室構(gòu)建，委托深圳源興生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)； P24抗體(由美國NIH AIDS Research and Reference Reagent program惠贈)；2G12抗體(購于蘇州杰恩公司)；生物素標記的抗小鼠IgG、生物素標記的抗人IgG、FITC標記的鏈酶卵白素IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PE標記的小鼠CD80、CD11c、CD86抗體購自美國Biolegend公司；重組鼠細胞因子rmGM-CSF、rmIL-4、rmTNF-α購自美國Peprotech公司；ELISPOT試劑盒購自瑞典MabTech公司。

1.2小鼠骨髓細胞采集和分離頸椎脫臼法處死小鼠，無菌操作下取股骨和脛骨，用1 ml注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液，從骨干的一端刺入骨髓腔，將骨髓沖洗到無菌培養(yǎng)皿中。用小鼠淋巴細胞分離液重懸細胞，按說明書離心后吸取中間部分的淋巴細胞層細胞(呈白色薄膜狀)，計數(shù)獲得單核細胞的數(shù)量，調(diào)整細胞濃度接種在培養(yǎng)瓶中，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)2 h。

1.3DC的培養(yǎng)與鑒定去除非貼壁細胞，加入細胞因子rmGM-CSF(40 ng/ml)、rmIL-4(20 ng/ml)、rmTNF-α(10 ng/ml)，37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)7 d后收集懸浮細胞團，即為小鼠的DC。收集貼壁法分離的DCs，按照說明書分別加入PE標記的抗小鼠CD86、CD80和CD11c抗體，利用流式細胞儀檢測DC純度。

1.4DC-Ad5-HIVgag和DC-Ad5-HIVenv制備及鑒定采用100 MOI的Ad5-HIVgag/env分別感染DCs，吸附2 h后，然后在含成熟因子的DC培養(yǎng)基中，其中含rmGM-CSF(40 ng/ml)、rmIL-4(20 ng/ml)、rmTNF-α(20 ng/ml),繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)細胞，即為DC-Ad5-HIVgag、DC-Ad5-HIVenv。利用間接免疫熒光法和流式細胞術(shù)檢測DC細胞中Gag/Env蛋白的表達情況。

1.5DC疫苗免疫BALB/C小鼠雌性BALB/C小鼠、4-6周齡，隨機分為7組，每組20只。將收獲的DC-Ad5-HIVgag和DC-Ad5-HIVenv 疫苗單獨或聯(lián)合經(jīng)肌肉注射免疫,免疫劑量為2×105細胞/只。另外分別設(shè)置Ad5-HIVgag組、Ad5-HIVenv組作為陽性對照組，以及DC-Ad5-LMP2組作為表達無關(guān)抗原的腺病毒負載的DC對照組，單純DC作為陰性對照組。分別在免疫后1周、2周、3周、4周檢測各組小鼠的細胞免疫應(yīng)答水平。

1.6酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)實驗在免疫后不同時間點分離小鼠脾淋巴細胞，分別用HIV Gag和Env特異性多肽刺激脾細胞，按照MabTech試劑盒說明書操作檢測小鼠的HIV Gag和Env特異性細胞免疫應(yīng)答。

1.7統(tǒng)計學方法特異性細胞免疫應(yīng)答強度用每百萬個淋巴細胞中斑點形成細胞數(shù)(Spots Forming Cells/million splencytes)計量；利用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學軟件分析結(jié)果并繪制圖表。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1細胞形態(tài)觀察貼壁培養(yǎng)法分離、純化、誘導得到的原代DCs具有典型的樹突狀細胞形態(tài)，細胞表面具有樹枝狀突起。

2.2成熟DC表面標志的表達利用流式細胞技術(shù)檢測通過貼壁法純化DCs的細胞純度，結(jié)果顯示，帶有CD86、CD80及CD11c表面標記的陽性細胞占總細胞比率的百分數(shù)分別為92.1%，94.7%和82.3%，見圖1。

2.3目的抗原在樹突狀細胞中的表達我們分別采用了間接免疫熒光方法和流式細胞技術(shù)檢測目的基因在DC細胞中的表達，免疫熒光結(jié)果顯示，目的抗原均在細胞內(nèi)有表達。見圖2。利用流式細胞技術(shù)對其進行分析，結(jié)果顯示，Ad5- HIVgag負載的DCs中表達Gag蛋白的細胞占總細胞比率為88%、Ad5- HIVenv負載的DCs中表達Env蛋白細胞比為85.3%。

圖1　DCs 流式細胞術(shù)純度檢測Fig.1　The purity result of DCs by flow cytometry

圖2　間接免疫熒光檢測樹突狀細胞疫苗中Gag和Env抗原表達(200×)Fig.2　Expression of Gag and Env in DC vaccines detected by indirect immunofluorescencec assay(200×)

圖3　ELISPOT方法檢測免疫后不同時間點小鼠體內(nèi)HIV Gag或Env特異性細胞免疫反應(yīng)結(jié)果Fig.3　HIV Gag or Env specific cellular immune responses in mice at various time points post immunization by ELISPOT assay

2.4ELISPOT方法檢測細胞免疫水平DC疫苗以肌肉注射的方式免疫BALB/C小鼠，在免疫后的不同時間點，分別用Gag和Env特異性多肽刺激小鼠脾淋巴細胞，檢測小鼠體內(nèi)Gag和Env特異性細胞免疫水平，見圖3。結(jié)果顯示，DC-Ad5-HIVgag和DC-Ad5-HIVenv單獨免疫或聯(lián)合免疫均能誘導相應(yīng)的HIV Gag和Env特異性CTL應(yīng)答。其中DC-Ad5-HIVgag單獨免疫組誘導的HIV Gag特異性細胞免疫反應(yīng)高峰在免疫后3 W，顯著高于免疫后2 W 及1 W(P<0.05)，之后逐漸下降。DC-Ad5-HIVenv疫苗單獨免疫組誘導的Env 特異性細胞免疫反應(yīng)隨著時間的推移逐漸增加至免疫后4 W達高峰，各時間點的免疫反應(yīng)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DC-Ad5-HIVgag和DC-Ad5-HIVenv聯(lián)合免疫組誘導的HIV Gag特異性細胞免疫反應(yīng)水平與DC-Ad5-HIVgag疫苗單獨免疫組相當，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；聯(lián)合免疫組誘導的HIV Env特異性細胞免疫反應(yīng)水平與DC-Ad5-HIVenv疫苗單獨免疫組相比，在免疫后第1、2周兩者水平相當，免疫后3周開始單獨免疫組水平超過聯(lián)合免疫組，至免疫后4周兩者差距最大,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3　討論

DC是已知唯一能夠激活初始T 淋巴細胞，也是已知最強的抗原遞呈細胞。特異性抗原負載的DC回輸?shù)襟w內(nèi)后，能夠激活T 淋巴細胞反應(yīng)，誘導產(chǎn)生HIV-1 抗原特異性CTL，并促進其殺傷作用[3]。DC已經(jīng)在多種病毒性傳染病的免疫治療中進行應(yīng)用研究并取得一定效果[4]。研究表明，不同的抗原負載方式,對DC 的活化效率不同,產(chǎn)生CLT 的活性不相同。目前抗原負載存在多種手段,常用的策略有抗原肽導入DC[5]及病毒載體攜帶抗原基因感染DC[6]兩種方式。有研究表明，采用抗原肽導入DC存在的問題主要是半衰期較短,而且轉(zhuǎn)導效率較低；病毒載體攜帶抗原基因感染DC,可使基因在DC內(nèi)穩(wěn)定表達,從而使DC獲得持續(xù)而大量的抗原刺激。而腺病毒具有安全性好、無遺傳毒性、轉(zhuǎn)導效率高、可以高水平的表達外源基因，并且還具備載體包裝容量大、病毒制備工藝成熟等特點。使用腺病毒為載體,感染DC細胞制備樹突狀細胞疫苗將是一個很好的策略。

本研究采用貼壁培養(yǎng)法分離、純化DCs，7 d后獲得純度較高的DCs。腺感染病毒后，通過間接免疫熒光及流式細胞技術(shù)可檢測到目的抗原Gag和Env在細胞中有較高水平表達。將獲得的DC疫苗免疫BALB/c小鼠可以誘導機體產(chǎn)生抗原特異性CTL應(yīng)答。DC-Ad5-HIVgag疫苗單獨或與DC-Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合免疫誘導的HIVGag特異性細胞免疫反應(yīng)水平相當，但都明顯低于直接用Ad5-HIVgag疫苗免疫的效果。DC-Ad5-HIVenv疫苗單獨或與DC-Ad5-HIVgag疫苗聯(lián)合免疫及直接用Ad5- HIVenv疫苗免疫誘導的HIV Env特異性細胞免疫反應(yīng)水平在免疫后前3周內(nèi)差異不大(P> 0.05)，但免疫后4周差異顯著(P<0.05)，以DC-Ad5-HIVenv單獨免疫組最高，DC-Ad5-HIVenv與DC-Ad5-HIVgag疫苗聯(lián)合免疫組最低。以Ad5-HIVgag和Ad5-HIVenv分別負載DC獲得的DC疫苗免疫小鼠后跟單獨用相應(yīng)的腺病毒載體疫苗免疫產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相比相分別出現(xiàn)降低和升高的趨勢，產(chǎn)生這種差異的原因還不清楚，有必要進一步在小鼠或恒河猴體內(nèi)進行深入研究，為更合理的應(yīng)用艾滋病疫苗提供依據(jù)。

[1]Wei F, Sun Q， Wong TS, et al. Eliciting cytotoxic T lymphocytes against human laryngeal cancer-derived antigens: evaluation of dendritic cells pulsed with a heat-treated tumor lysate and other antigen-loading strategies for dendritic-cell-based vaccination[J]. J Exp Clin Cancer Res,2016, 35(1): 1-9. doi: 10.1186/s13046-016-0295-1.

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Immunogenicity of dendritic cells pulsed with Ad5-HIVgag/env in mice

LiuChao,HeXiaozhou，LiuXue,XuKe,ZengYi,FengXia

LaboratoryofVirologyandPharmocology,CollegeofLifeScienceandBioengineering,BeijingUniversityoftechnology,Beijing100022,China(LiuC,LiuX,ZengY)；StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandContral,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(HeXZ,XuK,FengX)

FengXia,Email:fengxia621@126.com;ZengYi,Email:zengy@public.bta.net.cn

Objective To evaluate HIV Gag/Env specific cellular immune responses induced in mice immunized with mouse dendritic cells pulsed with Ad5-HIVgag/env. MethodsBALB/c mouse DCs were generated by culture of adherent bone marrow cells in the presence of several cytokines. The purity of matured DCs was determined by flow cytometry.DCvaccineswere prepared by loading them with replication-deficient recombinant adenovirus Ad5-HIVgag or Ad5-HIVenv. BALB/c mice were immunized by intramuscular injection of above DC vaccines alone or in combination, at different time points post immunization HIV specific cellular immune responses detected by ELISPOT assay.ResultsMouse DC vaccines loaded with Ad5-HIVgag/env were generated successfully. Expression of HIV Gag or Env antigens in DC vaccines could be detected by immunofluorescence assay and flow cytometry; and high levels of HIV-specific cellular immune responses were induced in mice immunized with above DC vaccines ConclusionsDendritic cells loaded with Ad5-HIVgag/env could elicit potent HIV specific cellular immune responses in mice.

Dendritic cell vaccine；Cell therapy；Adenovirus；HIV-1

馮霞，Email: fengxia621@126.com；曾毅，Email: zengyi@public.bta.net.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.008

國家科技重大專項(2012ZX10001-005)

2016-03-17)