1株H5N6亞型禽流感病毒分子特征分析

余慧燕　鄧斐　王慎驕　霍翔　戴啟剛　祁賢

210009 南京，江蘇省疾病預防控制中心急性傳染病防治所

?

·論著·

1株H5N6亞型禽流感病毒分子特征分析

余慧燕鄧斐王慎驕霍翔戴啟剛祁賢

210009 南京，江蘇省疾病預防控制中心急性傳染病防治所

目的對從某活禽市場環(huán)境中分離出的1株H5N6亞型禽流感病毒(A/environment/Zhenjiang/C13/2013，en/c13)進行全基因組序列測定，以揭示其基因起源和分子遺傳特征。 方法 采用二代測序技術對該分離株進行全基因組測序，MEGA6.0軟件進行序列比對和構建系統(tǒng)發(fā)生樹。 結果 分離株NA基因與近年來中國禽類中流行的H6N6亞型禽流感的NA基因處于同一進化分支，其他7個基因(PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)都與近年來東亞地區(qū)流行的H5N1亞型禽流感的相應基因處于同一進化分支，分離株en/c13的HA蛋白裂解位點為PLREKRRKR↓GLF，是高致病性禽流感病毒的典型分子特征序列。HA蛋白上關鍵受體結合位點226和228位(按照H3亞型的HA蛋白序列排序)氨基酸分別是Gln和Gly，是典型的禽流感病毒受體結合特征。 結論 本研究從環(huán)境中分離到一株新的基因重配禽流感病毒，其中NA基因來源于H6N6禽流感病毒，而其他7個基因則來源于H5N1禽流感病毒。結果提示我國禽流感病毒基因重配頻繁，進化活躍，需要加強對禽流感病毒的持續(xù)監(jiān)測。

【主題詞】禽流感病毒；H5N6亞型；基因重配

Fund programs: Key Provincial Talents Program of Jiangsu Province, China(RC2011084); Natural Science Foundation of Jiangsu Province, China(BK20131450)

甲型(A)流感病毒屬于正黏病毒科，根據(jù)其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨基酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性差異，可將甲型流感病毒可劃分為不同的血清亞型，目前已鑒定出18種HA亞型(H1-H18)和11種NA亞型(N1-N11)[1-3]。甲型流感病毒宿主較為廣泛，可以感染人和多種動物。目前有文獻記載的可以感染人的禽流感病毒主要有H5、H9、H7和H10等亞型[4]。

自2014年以來，中國、老撾、越南等東南亞國家相繼報道在禽類中出現(xiàn)H5N6亞型高致病性禽流感病毒，更為嚴峻的是在中國四川、廣東及云南已發(fā)生3例人感染H5N6高致病性禽流感病毒危重病例[5]。H5N6禽流感病毒已給民眾生計和動物安全構成嚴重威脅，對H5N6禽流感病毒進行跟蹤監(jiān)測具有非?，F(xiàn)實的公共衛(wèi)生意義。2013年，本研究從鎮(zhèn)江市某活禽市場的環(huán)境樣本中分離到一株H5N6亞型禽流感病毒，在全基因組序列基礎上對病毒的基因起源和遺傳特征進行分析。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑: 病毒RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司；ExTaq聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、RNA酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor, RANsin)和隨機引物購自大連寶生物日本TaKaRa公司； Nextera XT DNA Sample Preparation Kit及Illumina MiSeq測序系統(tǒng)購自美國Illumina公司；Qubit? dsDNA HS Assay Kit購自美國Invitrogen公司；High Sensitivity DNA assay kit購自美國Agilent Technologies公司。

1.1.2引物: 依據(jù)A型流感病毒基因片段的核苷酸保守序列設計病毒通用引物：UFLUA-IF、UFLUA-IR用于擴增全基因組；逆轉錄引物：Uni12(M)[6]，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2方法1.2.1病毒分離: 標本由鎮(zhèn)江市疾病預防控制中心提供，接種9-11日齡SPF雞胚，37培養(yǎng)72 h，每天觀察雞胚生長情況。所有操作都在BSL-3級實驗室內完成。1.2.2測序: 提取病毒基因組RNA，以U12反轉錄引物生成單鏈cDNA，通過A型流感病毒通用引物一步法擴增流感病毒基因組8個節(jié)段。將純化的PCR產(chǎn)物定量后，稀釋成0.2 ng/μl，按照Nextera XT DNA Sample Preparation Kit說明構建測序文庫。步驟包括DNA的Tagmentation、PCR擴增、純化、文庫標化及混合。取800 μl混合樣加入MiSeq測序試劑樣品孔進行全基因序列測定。

1.2.3進化樹構建: 采用CLC Genomics workbench(CLC Bio)對測序結果進行拼接整理，將序列用Blast進行同源性檢索。MEGA6.0軟件進行多序列比對，采用鄰近歸并法(Neighbor-Joining)法，構建系統(tǒng)發(fā)生樹，用Bootstrap重復抽樣1000次對進化樹進行驗證。

2　結果

2.1病毒分離處理好的標本接種雞胚，24-72 h接種的雞胚全部死亡，收獲尿囊液，貯存于-70℃?zhèn)溆?。尿囊液血凝效價為29；熒光RT-PCR檢測，尿囊液甲型流感病毒M基因核酸陽性。分離株命名為A/ environment/ Zhenjiang/ C13/ 2013(en/c13)。

2.2基因來源分析通過2代測序平臺，在標本SPF雞胚接種物中，獲得分離株en/c13的全基因組序列(8基因GenBank序列號分別為KJ938655-KJ938662)。通過BLASTn軟件在線分析，初步確定分離株en/c13為H5N6亞型。為了探究病毒的基因來源，對分離株en/c13的8基因片段序列與參考株的核苷酸同源性進行比較分析，確認8個片段核苷酸最大相似性的參考株(表1)。分離株en/c13 NA基因核苷酸和推導的氨基酸序列與近年來中國流行的H6N6禽流感病毒(如 A/duck/Guangdong/S3073/2010(H6N6)等)的同源性高達98%；而其他7個片段(包括PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)核苷酸和推導的氨基酸序列與近年來東亞地區(qū)流行的H5N1流感病毒[如A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1), A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)等]的同源性都高達95%至99%。

NA基因進化樹上，分離株en/c13與中國流行的H6N6毒株處于一個分支(圖1)；其他7個片段(包括PB2、PB1、PA、HA、NP、M和NS)則與近年來流行的H5N1流感病毒處于一個進化分支上(圖2)。對于HA基因片段進行比對后發(fā)現(xiàn)分離株en/c13與其核苷酸相似性最高的毒株均屬于進化分支clade 2.3.4.4。自2010年以來，clade 2.3.4.4在我國的禽類中已頗為流行，成為H5亞型禽流感病毒的一個新的優(yōu)勢進化分支。

2.3基因分子特征分析在全基因組序列分析的基礎上，對分離株en/c13編碼蛋白關鍵氨基酸位點進行了分析。分離株en/c13 HA蛋白的裂解位點氨基酸序列為PLREKRRKR↓GLF，含有多個堿性氨基酸，具有高致病性禽流感病毒的分子特性。HA蛋白的受體結合區(qū)226位和228位氨基酸沒有發(fā)生突變(分別為Gln和Gly)，理論上對禽消化道上皮細胞α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)受體有親嗜性。NA蛋白276(H→Y)和R294K(R→K)位點沒有發(fā)生突變，保留了病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑的敏感。PB2蛋白的591位、627位和701位氨基酸分別為Gln、Glu和Asp，是典型的禽流感病毒分子特征。此外，NS-1蛋白的C末端具有ESEV基序，是禽流感病毒一個典型毒力分子標記。

圖1　HA 基因進化樹分析Fig.1　Phylogenetic tree for the HA gene

圖2　NA基因進化樹分析Fig.2　Phylogenetic tree for the NA gene

基因節(jié)段Genesegment親緣關系最近的毒株Closestinfluenzavirusrelative核苷酸一致性(%)Nucleotideidentity(%)PB2A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)94.7PB1A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)96.7PAA/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)A/chicken/Vietnam/NCVD-KA423/2013(H5N1)A/duck/Hunan/S4220/2011(H5N1)98.898.898.8HAA/wildduck/Shandong/628/2011(H5N1)96.9NPA/duck/Nanchang/9789/2013(H5N1)A/quail/Nanchang/6631/2013(H5N1)97.997.9NAA/duck/Guangdong/S3073/2010(H6N6)97.7MA/wildduck/Fujian/1/2011(H5N1)A/wildduck/Fujian/2/2011(H5N1)99.099.0NSA/Muscovyduck/Vietnam/LBM634/2014(H5N1)A/muscovyduck/Vietnam/LBM636/2014(H5N1)98.598.5

3　討論

基因重配是甲型流感病毒進化的分子機制之一。不同亞型或者不同宿主來源的流感病毒通過基因重配而產(chǎn)生的子代病毒，具有明顯的選擇優(yōu)勢，也是產(chǎn)生人類流感大流行病毒的一種主要方式[7]。自1996年在我國廣東分離到高致病性H5N1禽流感病毒以來，該病毒對人類和動物健康造成持續(xù)的危害，其遺傳進化也異常活躍[8]。本研究在禽流感環(huán)境監(jiān)測中分離到一株H5N6病毒，基因分析表明該病毒是一株由H5N1和H6N6病毒重配的新病毒。研究結果證實H5N6病毒在我國華東地區(qū)也有流行，應進一步加強該地區(qū)的禽流感監(jiān)測。

基因點突變是流感病毒進化的另一種重要機制[3]。禽流感病毒若要突破種屬障礙成功跨種感染人，一些重要蛋白的關鍵氨基酸位點要發(fā)生相應的突變。分離株en/c13的HA蛋白的裂解位點含有多個堿性氨基酸，具有高致病性禽流感病毒的分子特征，表明該病毒對家禽具有較大的危害。HA蛋白與宿主細胞表面受體的結合是感染發(fā)生的關鍵一步[9]。與HA蛋白結合的細胞受體有兩類：α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)和α2-6半乳糖苷唾液酸(SAα2-6Gal)。禽類消化道主要表達SAα2-3Gal受體，而人呼吸道上皮細胞主要表達SAα2-6Gal受體，因此禽流感病毒跨物種感染人的首要前提是HA蛋白受體結合特性的轉變。HA蛋白受體結合區(qū)的一些關鍵氨基酸位點在受體親嗜性轉變中起著關鍵作用，本研究中分離株en/c13的HA蛋白受體結合區(qū)的226和228位點沒有發(fā)生突變，理論上對SAα2-6Gal受體的結合能力較弱，是典型的禽受體特征。此外，分離株en/c13的PB2蛋白627位點沒有發(fā)生突變，表明該病毒在人體內復制能力較差。雖然分離株en/c13不具備感染人的某些分子特征，但病毒未來進化變異趨勢值得關注，除了基因重配，持續(xù)的點突變也可能增強H5N6病毒對人體的感染能力，從而可能產(chǎn)生引起人類新的流感大流行毒株。

[1]Tong S, Zhu X, Li Y, et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(10): e1003657.dio:10.1371/journal.ppat.1003657.

[2]Tong S, Li Y, Rivailler P, et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats[J]. Proc Natl Acad Sci Acad USA, 2012, 109:4269-4274. doi:10.1073/pnas.1116200109.

[3]祁賢, 湯奮揚. H7N9禽流感病毒的生物學特征及進化趨勢[J].江蘇預防醫(yī)學, 2014, 25:47-50.doi:10.13668/j.issn.1006-9070.2014.02.017.

[4]De Vries E, Guo H, Dai M, et al. Rapid Emergence of Highly Pathogenic Avian Influenza Subtypes from a Subtype H5N1 Hemagglutinin Variant[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21:842-846.doi:10.3201/eid2015.141927.

[5]Pan M, Gao R, Lv Q,et al. Human infection with a novel highly pathogenic avian influenza A (H5N6) virus: Virological and clinical findings[J]. J Infect,2015,06.009.0163-4453.dio:10.1016/j.jinf.2015.06.009.

[6]Hoffmann E, Stech J, Guan Y, et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A virus [J]. Arch Virol.2001,146:2275-2289.doi:10.1007/s007050170002.

[7]Kawaoka Y, Krauss S, Webster RG. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics[J]. J Virol.1989,63:4603-4608.

[8]Guan Y, Poon LL, Cheung CY,et al. H5N1 influenza: a protean pandemic threat[J]. Proc Natl Acad Sci Acad USA,2004,101:8156-8161.doi:10.1073/pnas.0402443101.

[9]Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368: 1888-1897.doi:10.1056/NEJMoa1304459.

Molecular characterization analysis of one H5N6 subtype influenza virus

YuHuiyan,DengFei,WangShenjiao,HuoXiang,DaiQigang,QiXian

DepartmentofAcuteInfectiousDiseaseControlandPrevention,JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China

QiXian,Email:qixiansyc@hotmail.com

ObjectiveOne H5N6 subtype avian influenza virus, A/environment/ Zhenjiang/C13/2013, was isolated from environment in Zhenjiang in 2013 during epidemiological surveillance and was identified by HA/HI test and specific RT-PCR test. H5N6 AIV was subjected to genome sequencing to investigate the genomic composition. MethodsThe next-generation sequencing (NGS) Illumina MiSeq Platform was used to obtain complete genome sequence information from influenza virus isolates. MEGA6.0 software was used to align the eight fragments of the virus. The phylogenetic and molecular characteristics of the isolate were analyzed by Neighbor-Joining method. ResultsBlast searches demonstrated that the NA gene belonged to the same clade with H6N6 viruses currently circulating in China, whereas the other seven genes were found to be more similar to those of eastern Asian H5N1 AIV strains gene. The amino acid motif of cleavage site between HA1 and HA2 was PLREKRRKR↓GLF, which was the typical characteristics of the HPAIVs. The receptor binding site in the viral HA gene possesses the residues Gln 226 and Gly 228 (H3 numbering), indicating an avian-like receptor binding specificity. ConclusionOne H5N6 subtype avian influenza virus was isolated from environment, phylogenetic analysis showed that the NA gene belonged to the same clade with H6N6 viruses. The other seven genes belonged to H5N1 subtype. It suggests that strengthen the continuous surveillance of avian influenza A viruses is necessary.

Avian influenza virus; H5N6 subtype; gene reassortment

祁賢，Email：qixiansyc@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.006

江蘇省醫(yī)學重點人才基金(RC2011084)；江蘇省自然科學基金(BK20131450)

2015-08-25)