磷脂酰膽堿組分的二維液相色譜分離

郝　麗，朱苑露，代雅楠，段　蓿，韓欣欣，譚成玉，孔　亮，李　偉

（大連海洋大學(xué)，遼寧大連　116023）

磷脂酰膽堿組分的二維液相色譜分離

郝麗，朱苑露，代雅楠，段蓿，韓欣欣，譚成玉，*孔亮，*李偉

（大連海洋大學(xué)，遼寧大連116023）

建立了以脂質(zhì)體生物色譜-反相高效液相色譜的離線二維色譜分析方法模型，以磷脂酰膽堿（Phosphatidyl choline，PC）為樣品進(jìn)行色譜分析。首先采用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）為流動(dòng)相，流速為0.4 mL/min，以固定相脂質(zhì)體液相色譜柱（Immobilized lliposomes chromatography，ILC）的一維色譜分離。二維色譜分離采用反相C18色譜柱進(jìn)行分離，流速為1 mL/min。磷脂酰膽堿在固定相脂質(zhì)體色譜上僅有1個(gè)保留峰，但在反相C18色譜柱上卻存在著多個(gè)保留峰。因此，由脂質(zhì)體生物色譜-反相高效液相色譜組成的二維分離色譜在闡釋了生物色譜意義的同時(shí)也充分體現(xiàn)了二維色譜的分離優(yōu)越性。

固定化脂質(zhì)體色譜；二維色譜；磷脂酰膽堿

詮釋天然產(chǎn)物組分的關(guān)鍵在于其活性物質(zhì)的闡明。近年來(lái)，在眾多重要活性成分的分離技術(shù)中，色譜法因其良好的分離效果、多變的分離模式成為分離天然產(chǎn)物中活性成分不可或缺的手段。常規(guī)的色譜法大多基于中藥活性成分的物理和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分離，不可避免地存在著分離過(guò)程無(wú)法確定分離成分的藥理信息等缺陷。為此，可以利用生物色譜法來(lái)填補(bǔ)常規(guī)色譜的缺陷。其中，脂質(zhì)體是一種理想的模擬生物膜［1］，能夠在體外模擬活性成分的跨膜運(yùn)輸和吸收過(guò)程，活性成分與脂質(zhì)體的結(jié)合和其被人體吸收具有很好的相關(guān)性［2］。

雖然利用固定相脂質(zhì)體色譜能夠模擬活性成分與生物膜之間的相互作用，體現(xiàn)了活性成分在細(xì)胞膜上的穿透能力，但單純的應(yīng)用固定相脂質(zhì)體色譜分離活性物質(zhì)亦存在著分離度低、分離效果差等不足；反相C18色譜分離具有分辨率高、分離效果好、峰容量高等優(yōu)點(diǎn)［3］。本文將固定相脂質(zhì)體色譜與反相C18色譜各自的分離優(yōu)勢(shì)相互結(jié)合，建立了固定相脂質(zhì)體-反相C18離線二維分離色譜，在更好地體現(xiàn)了活性成分生物特性信息的同時(shí)，也達(dá)到了樣品各組分間良好的分離效果。

1　試驗(yàn)部分

1.1儀器與設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀、Agilent LC型色譜工作站，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；硅膠（5 μm），日本Fuji公司產(chǎn)品；自動(dòng)餾分收集器（SBS-100型自動(dòng)計(jì)滴部分收集器），上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品；Unitary C18型液相色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），華譜新創(chuàng)科技有限公司產(chǎn)品；Lambda35型可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)，美國(guó)PERKINELMER公司產(chǎn)品；TGL-16M型高速臺(tái)式離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水凈化儀，美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；西盟凍干機(jī)，美國(guó)西盟國(guó)際儀器有限公司產(chǎn)品。

蛋黃卵磷脂（PC），日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；磷脂酰膽堿，購(gòu)自美國(guó)sigma科技有限公司；乙腈為色譜純，百靈威科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、異丙醇均為色譜純，山東蜀王實(shí)業(yè)總公司產(chǎn)品；磷酸鹽。緩沖溶液：50 mmol/L的Na2HPO4和NaH2PO4溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2試驗(yàn)條件與方法

1.2.1ILC色譜柱的制備

磷脂涂覆法并加以改進(jìn)制備ILC固定相：將3 g硅膠置于20%的鹽酸溶液中回流后，用大量的蒸餾水沖洗至中性。在120℃條件下真空干燥過(guò)夜，備用。取1.5 g的蛋黃卵磷脂并用30 mL的氯仿溶解，加入預(yù)先活化的硅膠3 g，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。加入50×10-12mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，靜置溶脹4 h，裝柱前用PBS緩沖液洗滌，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心3次，除去未固載的卵磷脂。采用pH值7.4的PBS緩沖液（無(wú)NaCl）為勻漿液，在30 MPa的壓力下將預(yù)先制備的脂質(zhì)體固定相裝入不銹鋼柱管中即可。

1.2.2ILC色譜柱固定化磷含量的測(cè)定

利用卵磷脂中磷含量來(lái)表征硅膠表面固定化脂質(zhì)體的含量，其中磷含量的測(cè)定方法采用水中總磷含量的測(cè)定方法。將未溶脹的涂覆硅膠用超純水溶脹4 h，干燥后稱質(zhì)量，于濃硫酸中回流硝化，并用超純水洗滌剩余的硅膠，取硝化液定容后測(cè)定。

1.2.3固定相脂質(zhì)體柱色譜條件

自制I.D.4.6 mm×150 mm脂質(zhì)體色譜柱；流動(dòng)相：50mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：常溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：208 nm。

1.2.4餾分收集

將經(jīng)過(guò)固定相脂質(zhì)體色譜檢測(cè)分離的樣品用自動(dòng)餾分收集器進(jìn)行收集，將每60 s的餾分收集在1根餾分收集管中。將收集后的餾分進(jìn)行凍干濃縮，并以不同時(shí)間段收集的餾分為第二維反相C18色譜分析的樣品，進(jìn)行分析。

1.2.5反相C18色譜條件

反相C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶異丙醇（80∶10∶10）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：常溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：208 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1涂覆法制備ILC色譜柱中磷含量的測(cè)定

采用樣品中總磷含量的測(cè)定方法，以純水作為參比，于882 nm下測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)、以相應(yīng)的磷酸鹽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1。

表1　磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得脂質(zhì)體中的吸光度為0.768，故所測(cè)的樣本質(zhì)量濃度為0.62 mg/L，250 mL中所含磷為0.155 mg，則0.725 g硅膠上吸附的磷為0.155 mg，硅膠上的磷含量為0.214 mg/g。

2.2磷脂酰膽堿在ILC色譜柱上的分離情況

磷脂酰膽堿在ILC色譜柱上的分離圖譜見(jiàn)圖1。

圖1　磷脂酰膽堿在ILC色譜柱上的分離圖譜

由圖1可知，磷脂酰膽堿（PC）在ILC色譜柱上存在保留峰，且只有1個(gè)保留峰a。ILC色譜柱是模擬生物細(xì)胞膜的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，在ILC色譜柱上有保留的成分皆可視為細(xì)胞膜通透性的成分。由此可知，在圖譜上保留時(shí)間長(zhǎng)的組分與脂質(zhì)體的相互作用強(qiáng)，其疏水性強(qiáng)，則與細(xì)胞膜的相互作用也可能就強(qiáng)。磷脂酰膽堿（PC）雖然在ILC上只有1個(gè)保留峰，但其保留時(shí)間長(zhǎng)，可知其與脂質(zhì)體固定相之間存在著相互作用，進(jìn)而可推斷磷脂酰膽堿進(jìn)入到人體之后與人體細(xì)胞膜之間存在著一定的相互作用。由此，利用一維的ILC色譜柱模擬細(xì)胞膜環(huán)境來(lái)判定磷脂酰膽堿的生物特性。但由于生物模擬色譜ILC色譜柱存在著分離效果低的不足，故進(jìn)行第二維色譜分離的分析。

2.3磷脂酰膽堿在反相C18色譜柱上的分離

二維反相色譜分離磷脂酰膽堿的單組分色譜見(jiàn)圖2。

與一維液相色譜分離相比，系統(tǒng)的分辨率顯著提高。圖2中是對(duì)磷脂酰膽堿其中的1個(gè)組分進(jìn)行的反相液相分離結(jié)果，在固定相脂質(zhì)體一維色譜中只分離出了1個(gè)峰，在反相液相色譜中1個(gè)組分分離出了至少8個(gè)峰，體現(xiàn)了反相液相色譜的高分辨率。

二維反相色譜對(duì)磷脂酰膽堿全部組分的分離色譜見(jiàn)圖3。

圖2　二維反相色譜分離磷脂酰膽堿的單組分色譜

圖3　二維反相色譜對(duì)磷脂酰膽堿全部組分的分離色譜

由圖3可知，與固定相脂質(zhì)體色譜的分離結(jié)果相對(duì)比，反相液相色譜分離結(jié)果中出峰數(shù)達(dá)186個(gè)，峰容量為744個(gè)，經(jīng)過(guò)二維的反相液相色譜分離，圖譜中相互重疊的譜峰較少，譜峰間的分離度更高，為下一步的試驗(yàn)分析提供了有利條件。

2.4二維反相對(duì)磷脂酰膽堿組分的光譜分析

磷脂酰膽堿組分的紫外光譜見(jiàn)圖4，未知物質(zhì)的紫外光譜見(jiàn)圖5。

由圖2的試驗(yàn)結(jié)果中對(duì)磷脂酰膽堿的組分進(jìn)行光譜分析可知，由于磷脂酰膽堿的物質(zhì)結(jié)構(gòu)特殊，其紫外光譜的吸收較弱，幾乎只存在末端吸收，如圖4所示。但在對(duì)圖2中的各個(gè)峰進(jìn)行光譜分析中得到，在7.22 min時(shí)出的峰是b3的光譜圖，與其他峰的光譜圖有所不同，如圖5所示。其最大吸收波長(zhǎng)于234 nm處，尚不知其具體信息，有待進(jìn)一步研究。

圖4　磷脂酰膽堿組分的紫外光譜

圖5　未知物質(zhì)的紫外光譜

3　結(jié)論

本文以磷脂酰膽堿為研究對(duì)象，建立了固定相脂質(zhì)體-反相C18離線二維色譜的分離方法。利用固定相脂質(zhì)體色譜來(lái)模擬細(xì)胞膜磷脂雙分子層的環(huán)境，給出了活性成分的生物信息；且將在與固定相脂質(zhì)體相互作用的組分進(jìn)行了二維反相C18分離，給出了活性成分的化學(xué)色譜信息，充分的體現(xiàn)了固定相脂質(zhì)體-反相C18二維色譜的生物特性及分離特性，為今后在天然產(chǎn)物生物活性成分的分離提供了可能。

［1］盛亮洪，李睿巖，李萍，等.固定化脂質(zhì)體色譜研究中藥復(fù)方的細(xì)胞膜通透性成分及其質(zhì)量控制 ［J］.分析化學(xué)，2004（12）：1 595-1 598.

［2］何麗姍，徐斌，王光忠，等.復(fù)方腦得生有效成分與脂質(zhì)體模擬生物膜相互作用的研究 ［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010（4）：804-806.

［3］唐濤，張維冰，李彤，等.六味地黃丸組分的二維液相色譜分離 ［J］.分析化學(xué)，2010（12）：1 767-1 771.◇

Analysis of the Phosphatidyl Cholines from Halichondria Rugosa Cell Membrane by Off-line Two-dimensional Liquid Chromatography

HAO Li，ZHU Yuanlu，DAI Ya'nan，DUAN Xu，HAN Xinxin，TAN Chengyu，*KONG Liang，*LI Wei
（Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023，China）

In this paper，phosphatidyl cholines（PCs） in Halichondria Rugosa Cell Membrane are analyzed by the model of immobilized liposomes chromatography（ILC） -RP-HPLC（Off-line two-dimensional liquid chromatography） .Research has revealed that PC retained peaks on liposome chromatography stationary phases and separate well on the RP-HPLC C18.Using established PC model the phospholipid compounds of the marine sponge cell membrane is validation.The results show that he main components of cell membrane are carbohydrates，DNA and proteins have been removed by the first dimensional chromatography（ILC），and the PCs can be separated by the second dimensional chromatography（RP-HPLC）quickly.

PCs；ILC；PC

Q545+.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.08.017

1671-9646（2016）08a-0056-03

2016-05-20

海洋局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201005024-3，201205022-7）。

郝麗（1989— ），女，碩士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。

孔亮（1970— ），男，博士，教授，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。

李偉（1964— ），男，博士，教授，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)。