大麻素受體1對腎癌細胞786-O增殖及遷移能力的影響

王建豐，徐云澤，黃翼然，張　進

(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科，上海　200127)

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·基礎研究·

大麻素受體1對腎癌細胞786-O增殖及遷移能力的影響

王建豐，徐云澤，黃翼然，張進

(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科，上海200127)

目的探索大麻素受體1(CB1)在腎癌組織中表達及對腎癌細胞系786-O相關生物學功能的影響。方法采用免疫組化實驗方法檢測腎癌組織標本中CB1表達情況；應用CB1拮抗劑AM251處理786-O腎癌細胞株，觀察細胞的增殖及遷移能力的改變。 結果免疫組化結果顯示相對于癌旁組織，腎癌組織中CB1表達量較高；通過CB1拮抗劑AM251處理后，786-O腎癌細胞增值能力明顯下降：25μmol/L組48h和72h抑制率分別為 28.09±2.99和32.83±1.53；50μmol/L組48h和72h抑制率分別為78.59±5.69和88.02±5.34，其IC50在48h和72h分別為(38.20±4.75)μmol/L和(35.30±4.80)μmol/L；經(jīng)過CB1拮抗劑AM251處理后遷移能力發(fā)生顯著下降：與對照組細胞遷移數(shù)目(184.33±11.06)相比，20μmol/LAM251處理組(114±9.64，P=0.001 7)、30μmol/LAM251處理組(41.67±3.51，P=0.001 5)隨著藥物濃度的升高遷移細胞呈明顯減少趨勢。結論CB1可能參與腎癌發(fā)生發(fā)展，為尋找潛在的新的治療靶點提供理論依據(jù)。

癌；腎癌；786-O；大麻素受體1；AM251

大麻素受體(cannabinoidreceptor)早在二十世紀九十年代初就已被人們發(fā)現(xiàn)[1]，早期對大麻素的研究主要集中于精神和神經(jīng)系統(tǒng)領域。近年來，不斷有研究報道大麻素在抗腫瘤方面也具有顯著功效。在胰腺癌、神經(jīng)膠質瘤等相關研究中，大麻素具有不同程度的抗腫瘤作用[2-3]，但是在腎癌方面罕有研究報道。本研究旨在探討大麻素受體1(CB1)在腎癌中表達及對腎癌細胞細胞系786-O的相關腫瘤學生物功能的影響，初步研究其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　實驗方法

1.1腎癌組織免疫組化

1.1.1標本的收集75例標本選自上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科2014年7月至2015年3月間進行腎癌根治患者的手術標本，男50例，女25例，年齡29～82歲，平均年齡為58歲；腎癌的臨床分期采用AJCC第七版腎癌分期，其中T1期33例、T2期24例、T3期17例、T4期1例；術后病理均為透明細胞癌，分級采用Fuhrman分級方法，并在此基礎上分成高分化、低分化兩類，高分化(Ⅰ、Ⅱ、Ⅰ～Ⅱ)39例, 低分化(Ⅱ～Ⅲ,Ⅲ)36例。所有患者術前均無遠處轉移且無其他腫瘤史，術前均未進行化療及靶向治療。

1.1.2免疫組化及結果鑒定首先將收集的患者組織制作成組織芯片，免疫組化染色采用CP法，嚴格按照說明書進行染色。通過脫蠟、敷一抗(采用兔抗人CB1多克隆抗體(英國Abcam公司)1∶300稀釋)、敷生物素二抗及DAB顯色(武漢博士德生物公司)，最后用NikonEclipseE1000采圖攝像系統(tǒng)進行照相。陽性結果為細胞質和細胞核均有比較鮮明的棕黃色染色，以PBS代替一抗進行染色作為陰性對照。本研究中采用兩個指標來共同判斷該指標的表達情況，即表達強度和表達陽性率，同時也采用第三個結合染色強度和陽性率的指標，即染色綜合指數(shù)來判斷該指標的總體表達情況；染色強度：1、1.5、2、2.5、3代表染色由淺到深的5個等級。陽性率：癌或上皮細胞陽性細胞數(shù)所占同類細胞數(shù)的百分比。染色綜合指數(shù)：染色強度×陽性率。

1.2腎癌細胞株功能實驗

1.2.1AM251對腎癌細胞株增值活性的影響首先將腎癌細胞786-O培養(yǎng)處于對數(shù)生長期，然后加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，使細胞濃度為2×104/mL，以每孔90μL體積種于96孔板中，待12h后細胞完全貼壁后加CB1拮抗劑AM251。藥物母液濃度為10mmol/L，以首濃度50μmol/L，2倍梯度稀釋藥物8個梯度配置藥物，用排槍每孔加入10μL的不同濃度的藥物，每個濃度設置6個副孔，對照孔加入等量的生理鹽水，混勻后放于細胞培養(yǎng)箱孵育。24、48、72h后用磺酰羅丹明B(SulforhodamineB，SRB)比色法染色：首先每孔加100μL4 ℃預冷10%TCA于4 ℃冰箱固定1h，然后用去離子水洗板5遍，室溫晾干后加SRB染液染色30min，然后用1%冰醋酸沖洗96孔板并室溫晾干，最后每孔加100μL非緩沖Tris-base堿液用酶標儀以560nm波長，用空白孔調零，檢測96孔板吸光度(A)值，同樣實驗步驟重復3次。最后計算細胞抑制率并繪制抑制率曲線。

1.2.2AM251對腎癌細胞株786-O遷移能的影響取處于對數(shù)生長期的腎癌細胞用無血清的1640混成5×105/mL的細胞懸液，分別取適量的細胞懸液加入AM251藥物，配成不同濃度藥物下的細胞懸液，并等量接種于transwell小室(直徑6.5mm，孔徑8.0μm)，每孔100μL細胞懸液，下室加600μL含血清的1640培養(yǎng)基，分別配成與上室同樣的藥物濃度，最后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后經(jīng)90%乙醇固定、0.1%結晶紫染色、擦拭風干后于倒置顯微鏡下觀察拍照，每次取400倍3個視野進行細胞計數(shù)并拍照，分別統(tǒng)計實驗組和對照組的遷移細胞數(shù)目。同樣的實驗步驟進行3次。

2　結　果

2.1腎癌組織免疫組化免疫組化結果顯示，CB1受體在腎癌組織及癌旁組織均有表達(圖1)，并且腫瘤組織表達高于癌旁組織(P<0.05,表1)。經(jīng)過統(tǒng)計分析，腫瘤組織中CB1的表達與性別、腫瘤分期等無明顯相關性(P>0.05)。

圖1　CB1在癌和癌旁中的免疫組化染色

P<0.05。

2.2AM251對腎癌細胞增殖的影響細胞增殖實驗結果顯示CB1受體抑制劑AM251可以顯著抑制腎癌細胞株786-O的增殖活力(圖2)。重復實驗3次。結果顯示12.5μmol/L組、25μmol/L組、50μmol/L組在不同時間其抑制率有明顯差異(P<0.05),藥物作用72h后抑制率趨于穩(wěn)定(表2)，48h、72h時間段的IC50分別為(38.20±4.75)μmol/L和(35.30±4.80)μmol/L。

表2不同濃度AM251在不同時間段對786-O的抑制率

時間分組6.25(μmol/L)12.5(μmol/L)25(μmol/L)50(μmol/L)24h7.11±6.248.17±4.9215.16±3.1040.92±1.5948h5.11±2.908.83±3.0028.09±2.9978.59±5.6972h3.21±1.717.08±1.3432.83±1.5388.02±5.34

圖2AM251作用于786-O48、72h的濃度梯度抑制曲線

2.3AM251對腎癌細胞遷移能力的影響細胞遷移實驗結果顯示，CB1拮抗劑AM251能夠明顯抑制腎癌細胞786-O的遷移能力(圖3A)。實驗組中，20μmol/L組(114±9.64，P=0.001 7)及30μmol/L組(41.67±3.51，P=0.0015)與對照組(184.33±11.06)相比，遷移細胞數(shù)目明顯減少，相對遷移率明顯隨著濃度升高而降低(圖3B)。

圖3　AM251對腎癌細胞株786-O遷移能力的改變

A：不同藥物濃度作用后顯微鏡所見(×400)；B：遷移能力(以加藥組遷移細胞數(shù)目/未加藥組遷移細胞數(shù)目來表示，Ctrl組為未加藥組，其余為不同濃度加藥組)。

3　討　論

腎癌，全稱腎細胞癌(renalcellcarcinoma)，是起源于腎實質泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，為常見的泌尿系腫瘤。據(jù)最新的國外統(tǒng)計資料顯示，腎及腎盂腫瘤發(fā)生率占所有新發(fā)腫瘤的3%～5%，每年的死亡人數(shù)高達14 080人[4]。對于早期的腎臟腫瘤，絕大多數(shù)可通過手術等方式治愈，但是一旦出現(xiàn)轉移，預后較差。事實上，約有30%的RCC患者初次就診就已經(jīng)發(fā)生轉移，而且轉移性RCC放化療效果不佳，治療有效率低于20%[5]。目前，晚期腎癌的治療主要以靶向治療為主，美國及歐洲共同批準的有sorafenib、sunitinib、bevacizumad、pazopanib等7種靶向藥物，能顯著提高晚期腎癌患者的預后[6]。但是，在臨床的應用中，靶向藥物在使用一段時間后基本上都會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，因此，尋找和研究新的分子機制和治療靶點仍然是該領域的重要課題。

大麻素受體(CB)是一種G蛋白耦聯(lián)受體，主要介導Δ-9四氫大麻素(Δ-9-tetrahydrocannabinol，THC)對精神系統(tǒng)的作用[7]。1990年人們首次發(fā)現(xiàn)大麻素受體，包括大麻素受體1(CB1)和大麻素受體2(CB2)[8]，研究發(fā)現(xiàn)，CB1受體主要分布在中樞和外周，可能參與食欲及脂肪代謝的調節(jié)；CB2受體主要分布于外周，與免疫應答和炎癥反應等有關。CB1受體及內源性四氫大麻素分子(endocannabinoids)例如N-arachidonoylethanolamide(AEA)及2-arachidonoylglycerol(2-AG)在人類的精神神經(jīng)系統(tǒng)領域已被廣泛研究[9]，近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)內源性和合成大麻素具有明顯的抗腫瘤作用，已有報道在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、肺癌等大麻素受體明顯表達，且具有不同程度的抗腫瘤作用[10-13]。但是，不同腫瘤組織中大麻素受體的表達量與腫瘤的惡性程度及預后之間的關系不一致，有的甚至出現(xiàn)相反的結論[14-15]。2009年CHUNG等[14]對399例前列腺癌腫瘤組織標本的研究發(fā)現(xiàn)：大麻素CB1受體表達水平Gleason評分可作為評估前列腺癌患者預后的獨立因素；高表達CB1受體與腫瘤惡性程度高及預后差密切相關。但在肝癌中，CB1受體高表達預后好[15]。所以，大麻素對不同腫瘤作用仍然需要各個領域的進一步探索。大麻素在腎癌方面的研究罕有報道，僅有的研究也只是闡述CB1受體在腎癌的不同病理類型組織中表達量的差異，沒有進一步的實驗證明大麻素對腎癌具體是否有抗腫瘤作用。 據(jù)此，我們將繼續(xù)研究大麻素受體的表達與腎癌之間的關系，探索大麻素受體1在腎癌的發(fā)生發(fā)展中作用。

本研究關注的重點是大麻素受體1在腎癌中表達情況及其對腎癌細胞株786-O增殖及遷移能力的影響。2010年西班牙學者LARRINAGA等[16]研究大麻素受體(CB1及CB2受體)在腎癌組織中的表達，結果顯示：20例透明細胞癌中，CB1受體蛋白表達下調；CB2受體蛋白無表達。我們采用免疫組化的方法檢測75例腎癌組織標本中CB1表達情況，結果顯示CB1受體在腎癌組織標本中有較高的表達量，顯然我們的研究結果與前期西班牙學者報道是具有差異的。我們猜測可能與以下因素有關。首先，是否與腫瘤樣本的選擇有關：我們選取的腎癌腫瘤組織包括了透明細胞癌的低、中、高病理分級標本，而西班牙學者文章中無腫瘤的分期分級相關數(shù)據(jù)；其次，CB1受體表達是否存在人種的差異，類似的情況在乳腺癌中也有報道。由于乳腺癌，尤其是三陰性乳腺癌(雌激素受體、孕激素受體、HER均不表達)的病理亞型及預后在不同種族之間存在明顯差異。WILLIAMS等[17]研究表明：與美國人乳腺癌(三陰性乳腺癌)患者相比，越南人乳腺癌(三陰性)組織中EGFR和P-cadherin表達明顯下降，其表達存在明顯的差異。同樣，我們所收集的組織標本均來自中國人的腎癌組織，而西班牙學者的文章中未注明標本的來源。這些問題需要進一步研究。此外，在此基礎上，我們進一步利用CB1受體拮抗劑AM251作用于腎癌細胞株786-O，發(fā)現(xiàn)AM251能不同程度的抑制腎癌細胞的增值活力和遷移能力，這進一步說明了CB1受體可能參與腎癌的發(fā)生發(fā)展及轉移。MCKALLIP等[18]研究用大麻素(Δ-9-tetrahydrocannabinol，THC)作用于乳腺癌小鼠模型，結果顯示大麻素能夠顯著增加小鼠肺中轉移結節(jié)的數(shù)量，從而說明大麻素具有促進乳腺癌轉移的作用。CARPI等[19]研究者報道了AM251對皮膚黑色素瘤細胞A375的抗腫瘤作用，結果發(fā)現(xiàn)AM251能顯著的抑制黑色素瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞的凋亡發(fā)生，進一步的Westernblot說明AM251能夠下調抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin，上調促凋亡蛋白BAX；而且發(fā)現(xiàn)其也可以造成A375的G2/M期阻滯。同樣，我們的研究也證明了CB1受體拮抗劑AM251能夠抑制腎癌細胞786-O的增殖和遷移，而有關CB1在腎癌發(fā)生發(fā)展的分子機制仍需要進一步的探索。

綜上所述，本研究通過大麻素受體拮抗劑AM251作用于腎癌細胞株786-O，揭示了大麻素受體1在腎癌增殖、遷移等發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找新的腎癌抗腫瘤靶點提供新的認知。當然，本研究只是淺顯的探討了大麻素受體1在腎癌細胞株786-O中的作用，其具體的作用機制及體內的作用效果仍需要進一步研究和探索。

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(編輯王瑋)

Effects of cannabinoid receptor 1 on the proliferation and migration of 786-O cell of renal carcinoma

WANG Jian-feng, XU Yun-ze, HUANG Yi-ran, ZHANG Jin

(DepartmentofUrology,RenjiHospital,MedicalSchoolofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China)

ObjectiveToexplorertheexpressionofcannabinoidreceptor1 (CB1)onrenalcarcinomaanditseffectsonrenalcarcinomacellline786-O.MethodsTheCB1expressioninrenalcarcinomawasdetectedwithimmunohistochemicalmethod.The786-OcelllinewastreatedwithCB1antagonistAM251.Thechangesofcellproliferationandmigrationwereobserved.ResultsImmunohistochemicalresultsshowedthatCB1washighlyexpressedinrenalcarcinoma.AftertreatmentofCB1antagonistsAM251,theproliferationof786-Ocelllinewasinhibited.Theinhibitionrateof25μmol/Lgroupat48hand72hwas28.09±2.99and32.83±1.53,thatofthe50μmol/Lgroupat48hand72hwas78.59±5.69and88.02±5.34,respectively.TheIC50at48hand72hwas(38.20±4.75)μmol/Land(35.30±4.80)μmol/L.AftertreatmentofCB1antagonistsAM251,thecellmigrationabilitysignificantlydeclined.Comparedwiththecontrolgroup(184.33±11.06),the20μmol/Lgroup(114±9.64, P=0.001 7)and30μmol/Lgroup(41.67±3.51, P=0.001 5)hadgreatlydecreasednumberofmigrationcells.Withtheincreaseofdrugconcentration，thenumberofmigrationcellswasfewer.ConclusionCB1mayparticipateinthedevelopmentofrenalcarcinoma.Thismayprovidesomeinformationforthedevelopmentofpotentialnewtherapeutictargets.

cancer；renalcellcarcinoma；786-O；cannabinoidreceptor1；AM251

2016-01-27

2016-03-28

上海市衛(wèi)生系統(tǒng)先進適宜技術推廣項目(No.2013SY024);上海市自然科學基金(No.13ZR1425100)

張進，副教授，碩士生導師.

E-mail：med-zhangjin@vip.sina.com

王建豐(1991-)，男(漢族)，碩士在讀.研究方向：腎癌的臨床與基礎研究.E-mail:wjf_0509@sina.com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.08.014