乳酸菌基因敲除技術的研究進展

杜勝陽，王斌斌，馮佳，侯斌曉，喬建軍

(天津大學 化工學院制藥工程系，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津，300072)

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乳酸菌基因敲除技術的研究進展

杜勝陽，王斌斌，馮佳，侯斌曉，喬建軍*

(天津大學 化工學院制藥工程系，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津，300072)

乳酸菌是革蘭氏陽性菌，廣泛用于食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)及飼料工業(yè)等行業(yè)。對乳酸菌進行遺傳操作是調(diào)節(jié)、優(yōu)化其代謝途徑的基礎。通過基因敲除技術改造乳酸菌基因組，可以判斷基因組中未知基因所編碼產(chǎn)物的功能，有目的、有選擇地使乳酸菌生產(chǎn)有益的異源基因產(chǎn)物。基因敲除技術已成為當前乳酸菌分子生物學研究的熱點。文中對幾種乳酸菌基因敲除策略研究進展及影響敲除效率的因素進行了綜述，分析存在的問題并初步探討展望了乳酸菌敲除技術的未來發(fā)展趨勢。

基因敲除；乳酸菌；同源重組；單鏈重組；敲除效率

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類能發(fā)酵碳水化合物且主要產(chǎn)物為乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細菌的通稱。目前至少分為18個屬，包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等。乳酸菌代謝相對簡單，具有很好的生物安全性，是公認的安全級微生物(generally recognized as safe, GRAS)，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)及飼料工業(yè)等行業(yè)[1]。

隨著分子生物學的發(fā)展，基因測序技術的改革，以及后基因組時代的到來，人們已經(jīng)完成了對多種乳酸菌基因組的測序，從基因水平上更加清楚地認識、了解它的代謝規(guī)律。乳酸菌基因組中含有大量非必需基因，包括次級代謝產(chǎn)物基因簇、插入序列、冗余序列等。敲除這些非必需基因，可以改造得到最小化基因組的乳酸菌。

隨著合成生物學的發(fā)展，微生物基因組簡化成為研究熱點[2]。乳酸菌的基因組簡化后，能優(yōu)化其代謝網(wǎng)絡，減少副產(chǎn)物，提高了對底物和能量的利用效率，提升代謝網(wǎng)絡的可控制性以及產(chǎn)物的可預測性。目前，基因組簡化的研究在大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等模式微生物中已相繼被報道[3-5]。其中，對大腸桿菌基因敲除系統(tǒng)的研究比較成熟，如高效的Red/ET重組系統(tǒng)。然而基因組簡化的研究在乳酸菌中尚不成熟，更高效的基因敲除系統(tǒng)有待探究。目前，大部分乳酸菌基因敲除技術還是依賴于傳統(tǒng)的同源重組雙交換方法。本文就近年來乳酸菌基因敲除技術取得的進展進行綜述，并探討了影響敲除效率的有關因素，旨在為今后的深入研究提供有價值的參考。

1　乳酸菌基因敲除原理概述

基因敲除技術是20世紀80年代發(fā)展起來的一項重要的分子生物學技術，其原理是利用特定方法使目標基因失活或者缺失，對染色體進行定點修飾改造，從而改變細胞的遺傳特性。運用基因敲除技術，可以改變?nèi)樗峋拇x流向，阻斷不必要次級代謝產(chǎn)物的積累，降低發(fā)酵成本，大幅度提高目的產(chǎn)物的生產(chǎn)水平及純度。另外，基因敲除技術還可用于乳酸菌基因結(jié)構(gòu)與功能研究[6]。

經(jīng)典基因敲除技術的理論依據(jù)是同源重組。同源重組依賴于基因同源序列的聯(lián)會，DNA分子間或者分子內(nèi)交換對等的部分，發(fā)生重新組合。根據(jù)同源重組原理，合理設計并通過酶切連接、融合PCR構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的重組載體，然后將其導入宿主細胞中，實現(xiàn)對宿主染色體DNA序列的插入、缺失或者置換突變。乳酸菌中的同源重組是個復雜的過程，通常分為三個階段，即前聯(lián)會體階段、聯(lián)會體形成階段和Holiday 結(jié)構(gòu)(Holiday Juncture Structure)的拆分階段，期間需要RecA、RecBCD、RecF、RecR、RuvAB等重要蛋白參與。

另外，還可以依據(jù)位點特異性重組對乳酸菌進行基因敲除。它的原理是在重組酶催化下，含有特異位點的兩條DNA鏈會發(fā)生重組。依據(jù)特異位點的序列和排列方向，重組以后可能出現(xiàn)3種結(jié)果：整合(integration)、切除(excision)、倒位(inversion)[7]。

位點特異性重組酶主要包括兩大家族，分別為整合酶系和解離酶系。整合酶家族有兩個代表性的重組酶系統(tǒng)分別是Cre/loxP、FLP/FRT重組酶系統(tǒng)。解離酶家族中，常用于乳酸菌的重組酶是lactococcal噬菌體的TP901-1整合酶，它能夠特異性介導attP位點與attB位點間的重組反應。

2　乳酸菌基因敲除策略

乳酸菌中的基因敲除大致可以分為3類：同源單雙交換基因敲除、位點特異性重組、線形DNA重組基因敲除。

2.1利用同源重組單交換雙交換進行敲除

同源重組單雙交換的首要條件是構(gòu)建重組載體，運用PCR將目標基因上游以及下游片段或者不完整的靶基因擴增出來，連接到敲除載體上，然后轉(zhuǎn)化進入宿主細胞，發(fā)生一次或兩次同源重組，以敲除或者破壞基因。

在對目標基因進行敲除過程中，只發(fā)生一次同源重組，稱為同源單交換，如圖1所示。單交換操作簡單、易行，重組發(fā)生后整個質(zhì)粒載體整合進入目標基因內(nèi)部，使目標基因失活。LEENHOUTS等[8-9]稱之為Campbell型整合，在乳酸乳球菌中可通過Campbell型質(zhì)粒進行基因敲除。在對瑞士乳桿菌和戊糖乳桿菌的相關研究中也有單交換失活基因的報道[10-11]。

PTB-部分目標基因圖1　單交換敲除策略示意圖[12]Fig.1　Gene knockout by homologous single crossover

同源重組雙交換就是發(fā)生兩次同源重組，在單交換的基礎上再進行一次交換，它分為缺失型突變和插入型突變。通過缺失型突變可以做到無痕敲除，而插入型突變是將目標基因內(nèi)部插入新的基因序列，使基因失活。除了得到突變型菌株，同源雙交換后，還會產(chǎn)生回復突變得到野生型菌株，如圖2和圖3所示。

AG-抗性基因；L-左同源臂；R-右同源臂圖2　雙交換插入型敲除策略示意圖Fig.2　Inserted knockout by homologous double crossover

CG-反向篩選標記圖3　雙交換缺失型敲除策略示意圖Fig.3　Markerless knockout by homologous double crossover

早在1996年FERAIN等[13]就運用這種經(jīng)典的基因敲除方法，利用不能在乳酸菌中復制的pJDC9質(zhì)粒構(gòu)建重組載體，對植物乳桿菌染色體上的乳酸脫氫酶L-Idh和D-Idh進行敲除，研究了這兩個基因?qū)毎诤铣傻挠绊憽Ｔ贔ERAIN的研究基礎上，LIU[14]在2006年對植物乳桿菌TF103再次進行了敲除，利用載體pBluescript構(gòu)建得到敲除載體，通過同源雙交換成功敲除基因als，阻斷了丙酮酸到乙酰乳酸的代謝通路，促進了乙醇和甘露醇的生成。2014年JIN等[15]構(gòu)建了隔離不穩(wěn)定的敲除載體pCBM32-DSUDs，轉(zhuǎn)化進檸檬明串珠菌中，兩次同源重組后，成功把氯霉素基因插入右旋糖酐蔗糖酶基因(dsrC)中。失活dsrC基因的檸檬明串珠菌喪失了合成右旋糖酐的功能，不再具有粘性缺點。研究同時證明了dsrC在蔗糖分解代謝中的重要作用。

同源重組單雙交換技術是經(jīng)典的基因敲除方法，具有很長的應用歷史。理論成熟、操作簡單，至今仍有較多的學者在研究乳酸菌同源整合載體的構(gòu)建及鑒定[16-17]。但是這種方法工作量大，敲除效率不高，容易產(chǎn)生回復突變，在革蘭氏陽性菌中應用此技術進行基因敲除效率較低。

2.2位點特異性重組敲除

近年來，利用位點特異性重組(site-specific recombination)的基因打靶技術得到了廣泛的應用[18]。位點特異性重組系統(tǒng)由重組酶和特異性識別位點兩部分構(gòu)成，重組酶只能識別催化特異性位點間的重組，所以該反應具有高度的專一性和保守性。目前常用于乳酸菌中的位點特異性系統(tǒng)是Cre/loxP系統(tǒng)和TP901-1/att重組系統(tǒng)。

2.2.1Cre/loxP系統(tǒng)

Cre重組酶是位點特異性重組酶家族中的一員，分子質(zhì)量為38 kDa，能特異性識別DNA序列上的loxP位點。該位點有34個堿基組成，其中包括兩個13 bp的反向重復順序和8bp的間隔區(qū)域。Cre/loxP系統(tǒng)主要應用于基因失活或缺失、基因激活、基因易位等，除此之外還可以用于載體的構(gòu)建。

菌株遺傳穩(wěn)定性是進行遺傳操作時需考慮的一個關鍵因素?；蚯贸呗灾谐Ｒ脒x擇標記基因，從而利于篩選正確的突變體。但如果殘留標記基因，可能導致菌體生長遲緩，而且標記基因的表達可能對上下游基因的表達產(chǎn)生影響。因此，在乳酸菌中常用Cre/loxP系統(tǒng)消除基因組上的標記基因。

Cre/loxP系統(tǒng)介導的重組發(fā)生后，會在基因組中殘留一個loxP位點，當再利用該系統(tǒng)時，會產(chǎn)生不必要的突變。因此，后來發(fā)展了一種可以產(chǎn)生穩(wěn)定迭代重組的突變loxP系統(tǒng)——lox66×lox71Cre系統(tǒng)。當突變的lox66和lox71位點發(fā)生重組時，會產(chǎn)生一個退化的lox72位點，該位點不能被Cre酶識別。2007年Michiel等[19]在傳統(tǒng)敲除的基礎上引入Cre/loxP系統(tǒng)，并使用突變的lox66×lox71位點，成功實現(xiàn)了植物乳桿菌多基因敲除以及篩選標記消除。2014年在Michiel工作的基礎上，QIAO等[20]把非復制型質(zhì)粒pNZ5319轉(zhuǎn)化進入乳酸乳球菌進行同源重組雙交換，然后引入Cre/loxP系統(tǒng)消除篩選標記氯霉素，成功敲除乳酸乳球菌NZ9000胸腺嘧啶合成酶基因thyA，獲得了食品級篩選標記菌株。所以用Cre/loxP系統(tǒng)從基因組上消除標記基因是一種簡潔、有效的方法。

2.2.2TP901-1/att重組酶系統(tǒng)

TP901-1/att重組酶系統(tǒng)是一種能產(chǎn)生穩(wěn)定單拷貝進行染色體整合的位點特異性重組系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中，產(chǎn)生的TP901-1整合酶，會促使兩個特異性結(jié)合位點高頻率重組。這兩個不一樣的結(jié)合位點attB(43bp)和attP(56bp)，分別存在于乳酸乳球菌染色體上和構(gòu)建的整合質(zhì)粒上[21]。當整合載體和基因組整合完成后，載體的兩側(cè)會產(chǎn)生兩個雜合的位點attL和attR，如圖4(B)所示。盡管該系統(tǒng)具有高效性，但仍存在一些缺點，例如作為篩選標記的抗生素抗性基因殘留在染色體上，迭代整合無法完成等。根據(jù)attB和attP位置、排列方向的不同，重組后還會產(chǎn)生敲除和倒位的結(jié)果。類似于Cre/loxP系統(tǒng)在乳酸菌中的應用，TP901-1/att重組酶系統(tǒng)能消除基因組上的標記基因。結(jié)合單交換敲除原理，利用同向的attB和attP，共同敲除目標基因，如圖4(A)所示。

圖A-基因敲除；圖B-基因整合圖4　TP901-1/att重組系統(tǒng)基本原理Fig.4　The site-specific recombination about TP901-1/att

2013年Petersen等[22]構(gòu)建了一種可以重復迭代整合，無標記的特異位點整合技術。通過構(gòu)建含有噬菌體結(jié)合位點attP的非復制型整合載體pKV6，實現(xiàn)位點特異性打靶。該載體上含有一個最小的細菌結(jié)合位點attBmin、一個負篩選標記oroP以及兩個用來去除抗性篩選標記的突變lox66×lox71位點。當轉(zhuǎn)入的噬菌體TP901-1整合酶表達時，pKV6會高效的整合進入乳酸菌染色體，通過表達Cre酶，和負篩選標簽篩選得到loxP重組體。而引入的最小結(jié)合位點attBmin，能夠使后續(xù)的第二輪的整合成功進行。利用這個工具系統(tǒng)，Petersen等成功把木糖相關基因xylABR和xylT整合進入乳酸乳球菌KF147中，使其能夠利用木糖作為碳源。

2.3線形轉(zhuǎn)化敲除法

線形轉(zhuǎn)化敲除是把線性DNA轉(zhuǎn)化進宿主細胞中進行同源重組，是近年來基因敲除方法的熱點之一。最為人所熟知的是Red/ET重組系統(tǒng)，常應用于大腸桿菌中。它主要利用λ噬菌體Red蛋白組合(Redα/Redβ/Redγ)和Rec噬菌體誘導表達的蛋白RecE和RecT[23]。與同源雙交換相比，該方法所需的同源臂僅為35～50 bp、重組效率更高。但是它主要用于革蘭氏陰性菌中，鮮有報道把這個系統(tǒng)應用于乳酸菌中。

目前，能運用于乳酸菌中的線形敲除技術是單鏈重組工程(Single strand DNA Recombination-SSDR)。它通過誘導表達Red/ET重組系統(tǒng)中的Redβ或者RecT重組酶，把單鏈核苷酸整合到細菌染色體中，如圖5所示。

深灰色的點-抗性基因；灰色橢圓-菌體細胞；R-重組酶基因；EP：表達RecT或Redβ的質(zhì)粒；Ss DNA-單鏈DNA圖5　單鏈重組工程示意圖Fig.5　Single strand DNA Recombination

Redβ和RecT表達單鏈DNA結(jié)合蛋白，常被作為重組酶，能促進互補DNA鏈的退火。2012年van Pijkeren等[24-25]在乳酸菌線性重組方面的研究有了突破性的進展，他們在乳酸乳球菌和羅氏乳桿菌中分別構(gòu)建質(zhì)粒pJP005和pJP042誘導表達recT基因，轉(zhuǎn)化單鏈DNA進入細胞，成功突變基因ddl中的幾個堿基，使D-丙氨酰-D-丙氨酸連接酶中的一個氨基酸發(fā)生改變，從而增強菌株對萬古霉素的敏感性。通過MAMA-PCR[26]驗證得到突變體，做到了精確定點突變，此方法不需要抗生素及類似篩選標記。

相對于經(jīng)典的同源雙交換敲除，單鏈重組有更多的優(yōu)勢。它操作簡單，重組效率高，不受酶切位點限制，所需同源臂較短，50 bp左右即可，可以直接采用PCR 方法擴增獲得。但是這種方法中的重組酶recT在不同菌株中的表達效果不同，不是所有的乳酸菌都適用于這種方法。

3　影響敲除效率的因素

乳酸菌作為革蘭氏陽性菌，含有一層較厚的細胞壁，對其進行遺傳操作比較困難，所以其重組效率一般較低。但是可以通過優(yōu)化相關因素提高其敲除效率，例如利用溫敏復制子、引入反向篩選標記等。

3.1溫敏敲除系統(tǒng)

相對于利用普通非復制型載體進行基因整合，利用溫敏敲除系統(tǒng)具有更高的效率。在溫敏敲除系統(tǒng)中，敲除載體的復制子為溫敏型復制子，轉(zhuǎn)化進入宿主細胞后，在低溫下可以讓載體復制，高于特定溫度時載體丟失，達到消除載體的目的。利用溫敏敲除系統(tǒng)，載體在低溫復制時，會得到大量拷貝，從而提高二次重組效率。1992年MAGUIN等[27]對廣譜型復制子pWV01突變得到了一種突變質(zhì)粒pVE6002，并把這個溫敏復制子應用于敲除載體的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)其具有較高的敲除效率。Biswas等[28]在1993年構(gòu)建了大腸桿菌-乳酸菌穿梭敲除質(zhì)粒pGhost5，它在37 ℃時不能復制, 但在28 ℃時能滾環(huán)復制。研究表明用這個載體，發(fā)生雙交換時的剪切效率提高了100～1000倍。這兩個載體的發(fā)現(xiàn)，極大促進了乳酸菌基因敲除的進展，并沿用至今。最近，Steele等[29]利用pGhost5溫敏敲除系統(tǒng)成功敲除掉乳酸乳球菌LM0230的ilvE基因，證明了它在氨基酸代謝中的重要作用。2015年，LANGA等[30]則利用pWV01衍生溫敏質(zhì)粒pVE6007(repA+)和敲除載體pORI28(repA-)，共同敲除短乳桿菌pdh30基因，以研究pdh30在甘油代謝中的作用。通過高效液相色譜分析pdh30突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)基因pdh30參與3-羥基丙酸的生物合成。

溫敏型質(zhì)粒是溫敏敲除系統(tǒng)中很有效的遺傳工具，而且其宿主譜較廣，適用于許多革蘭氏陽性菌。應用溫敏敲除系統(tǒng)，先在復制溫度下培養(yǎng)，促進轉(zhuǎn)化子的生長繁殖，提高重組效率，重組完成后，改變溫度使質(zhì)粒丟失，通過抗性篩選，得到突變株。但是這個系統(tǒng)遺傳學不穩(wěn)定，而且一般需要高溫條件篩選，限制了大部分乳酸菌的生長。

3.2反向篩選標記

運用同源雙交換的方法敲除基因，發(fā)生第二次重組的效率較低，后期篩選困難。針對該問題，學者們研究發(fā)現(xiàn)，采用合適的負篩選標記利于篩選到正確的突變菌株。反向篩選標記能使陽性克隆對一些特殊培養(yǎng)條件敏感，從而促進載體序列丟失和同源重組的發(fā)生，提高了篩選效率。同時，利用反向篩選標記還可避免引入抗性基因，達到無痕敲除的目的。

2008年SOLEM等[31]發(fā)現(xiàn)了一個可用于乳酸菌的反向標記基因oroP，它編碼一種專屬的乳清酸運輸?shù)鞍?transporter)。oroP基因的存在，會使細胞對5-氟乳清酸敏感，所以它可以作為質(zhì)粒丟失時的篩選標記。Solem構(gòu)建了一個含有反向篩選標記基因oroP的載體pCS1966，對乳酸乳球菌IL-1403進行改造，成功把磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(tpiA)前的啟動子換成不同的人工合成啟動子。他們的研究表明載體pCS1966是種高效的遺傳操作工具，而且反向篩選標記基因oroP可廣泛應用于乳酸菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等多種微生物中。

另一種常運用于乳酸菌中的反向篩選標記基因是upp基因，它廣泛存在于原核生物和某些低等真核生物細胞中，表達產(chǎn)物為尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(UPRT)[32]。UPRT能把5-氟尿嘧啶轉(zhuǎn)化成5-氟單磷酸脫氧尿嘧啶，從而使胸腺嘧啶核苷酸合成酶喪失活性，導致細胞死亡。利用這個特性，upp基因可用作反向篩選標記。早期的研究表明刪除upp基因不會影響乳酸菌的嘧啶代謝和生物學特性[33]。2014年Song等[34]應用以溫敏復制子pWV01和反向篩選標記upp構(gòu)建的敲除載體，成功得到干酪乳桿菌ATCC393和乳酸乳球菌MG1363upp基因突變菌株，并發(fā)現(xiàn)除了有5-氟尿嘧啶抗性，它在各方面與野生菌株無明顯不同。2014年Zhang等[35]人利用溫敏質(zhì)粒pKSV7，先構(gòu)建upp缺失菌株LL3 Δupp，然后用upp做反向篩選標記，無痕敲除解淀粉芽孢桿菌的基因amyA基因一個47 kb大小的基因簇bae和rocR基因，在很大程度上提高了聚谷氨酸的產(chǎn)量。

upp作為負篩選標記應用廣泛，但仍有一些缺陷，許多微生物基因組中都含有upp基因，因此在使用前需改造得到upp突變菌株，然而在某些菌中，upp有可能參與重要代謝，在缺失upp后，有可能會影響菌株生長。

3.3電轉(zhuǎn)化方法優(yōu)化

通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化方法，提高轉(zhuǎn)化效率，使得重組載體更容易轉(zhuǎn)化進入乳酸菌細胞，隨之可提高重組的效率。因為乳酸菌是革蘭氏陽性菌，被一層致密的厚細胞壁包裹著，所以轉(zhuǎn)化乳酸菌細胞時一般使用電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法需要先去細胞壁，操作繁雜且轉(zhuǎn)化效率低，所以轉(zhuǎn)化乳酸菌更常用省時簡便的電轉(zhuǎn)化法。影響電轉(zhuǎn)化效率的因素較多，如電擊的電壓、乳酸菌所處的生長周期、電擊緩沖液等。

Gerber等[36]先優(yōu)化了電轉(zhuǎn)乳酸乳球菌IL1403的具體步驟，最后使轉(zhuǎn)化效率達到106CFU/μg DNA，然后再構(gòu)建以pCR-Blunt IITopo載體衍生的pSG3和pSG7重組質(zhì)粒，把它們電轉(zhuǎn)化進入乳酸乳球菌后，重組效率是每微克質(zhì)粒DNA產(chǎn)生大約10個陽性克隆，成功敲除掉基因copA和copB。2012年Spath等[37]發(fā)現(xiàn)利用非甲基化的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌時，轉(zhuǎn)化效率得到極大的提高，在此基礎上進行的同源重組，效率提高明顯。

由于不同種乳酸菌菌株的差異性，具體的電轉(zhuǎn)化優(yōu)化條件需要在實驗過程中去摸索，比如兩株不同的乳酸菌最適電壓可能存在很大差異。當電轉(zhuǎn)化達到一個理想的效果，再進行基因敲除，也會使敲除效率得到提高。

3.4其他因素

利用重組載體打靶時，同源臂的長度是影響重組效率的一項重要因素。LELOUP等[38]發(fā)現(xiàn)在沙克乳桿菌中，同源臂長度1 kb以內(nèi)，重組效率隨同源臂長度增加呈線性增長，大于1 kb后，再增加同源臂長度，重組效率無明顯增高。同樣GERBER等[36]也在乳酸乳球菌IL1403中做了相關研究，得到相同的結(jié)果。

另外，利用單鏈DNA進行重組時，也存在一些因素影響重組效率，例如單鏈DNA的濃度、單鏈的類型、修飾末端等。vanPijkeren等[39]通過優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌中，使用滯后鏈的重組效率比用前導鏈高25倍，提高寡核苷酸的濃度到500 μg并用硫代磷酸修飾末端后，重組效率提高了10倍。

4　結(jié)論與展望

大部分乳酸菌以益生特性著稱，作為一種重要的工程菌應用于醫(yī)藥食品行業(yè)[40]。在分子生物學中，基因敲除技術是生物育種的重要技術支持，也是對乳酸菌進行遺傳改造的重要方法。目前常用于乳酸菌的敲除策略是傳統(tǒng)的同源重組雙交換敲除，但它具有重組效率低、耗時較長、工作繁雜等缺點。隨著現(xiàn)代技術手段的進步，學者們通過優(yōu)化重組載體和轉(zhuǎn)化效率，在提高敲除效率方面取得了進步。另一方面，在乳酸菌中對單鏈重組工程方面的研究也取得了不錯的進展，可以更加高效便捷的敲除基因，盡管在適用性方面有一定的限制，但這些研究都為未來乳酸菌基因敲除技術的發(fā)展奠定了基礎。

隨著分子生物學的發(fā)展，近年來新興的基因敲除技術成為研究熱點。其中，CRISPR/Cas技術[41]未來極有可能應用于乳酸菌中。應用該系統(tǒng)WANG 等[42]已經(jīng)成功無痕敲除同樣是革蘭氏陽性菌的貝氏梭狀芽胞桿菌基因spo0A。van Pijkeren等[43]已嘗試把CRISPR/Cas系統(tǒng)和單鏈重組系統(tǒng)結(jié)合起來應用于乳酸菌中。MILLEN[44]等的研究從遺傳水平上表明CRISPR/Cas系統(tǒng)在乳酸菌細胞內(nèi)的有效性，及廣闊的應用前景。除此之外，RNA干擾(RNAi)[45]、TALENS[46](Transcription Activator-like (TAL) Effector Nucleases)、鋅指核酸酶基因打靶技術[47](Zinefinger-nucleases,ZFNs)等高效靶向基因修飾技術都有待應用于乳酸菌中，這將極大的提高基因敲除效率，使乳酸菌的遺傳操作更加便捷。

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Advances on gene knockout technology of lactic acid bacteria

DU Sheng-yang，WANG Bin-bin，F(xiàn)ENG Jia，HOU Bin-xiao，QIAO Jian-jun*

(Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072,China)

Lactic acid bacteria(LAB)are Gram-positive bacteria that have been widely used in food, medicine, light industry, feed industry and many other industries. The genetic manipulation of LAB is the foundation of gene regulation and metabolism. We can identify the function of the unknown genes in the genome and assure the application of its encoding product through the gene knockout technology. Besides, the heterologous gene products of LAB can be obtained more purposefully and selectively. Currently, gene knockout has become a newly-developed molecular biological technology in LAB. This article mainly summarized the advances of gene knockout technology of LAB and its efficiencies. The existing problems were analyzed and the development trend of gene knockout of LAB was preliminary discussed.

gene knockout; lactic acid bacteria; homologous recombination; single-strand DNA recombineering; knockout efficiency

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601044

碩士研究生(喬建軍為通訊作者，E-mail：jianjunq@tju.edu.cn)。

國家自然科學基金項目(31270142)；國家科技支撐計劃(2014BAD02B00)

2015-05-18，改回日期：2015-06-20