紫外-等離子體復(fù)合誘變紅曲霉產(chǎn)胞外多糖

蔣汶，張慶慶，湯文晶，程亞運(yùn)

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

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紫外-等離子體復(fù)合誘變紅曲霉產(chǎn)胞外多糖

蔣汶，張慶慶*，湯文晶，程亞運(yùn)

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

以紅曲霉ZL307為出發(fā)菌株，采用紫外結(jié)合常壓室溫等離子體的復(fù)合誘變方法對其進(jìn)行誘變。紫外誘變條件為：照射距離15 cm，功率15 W，時間90 s。等離子體誘變條件為：照射距離3 mm，注入氣體氦氣，氣流量10 L/min，功率200 W，時間180 s。篩選得到具有良好遺傳穩(wěn)定性的菌株ZJ307-3，與原始菌株相比，發(fā)酵周期沒有發(fā)生明顯的改變，7 d時多糖產(chǎn)量達(dá)到550.07 mg/L，提高61.18%。復(fù)合誘變菌株多糖產(chǎn)量較單紫外誘變菌株提高27.58%，較單等離子體誘變菌株提高12.55%。

紅曲霉；胞外多糖；紫外誘變；等離子體誘變

紅曲霉是具有我國傳統(tǒng)特色的絲狀真菌[1]，在我國已有1000多年藥食兩用的歷史。紅曲多糖作為紅曲霉在生長過程中分泌的代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力[2]等多種生物活性。

改良菌種的常用方法有誘變法和分子生物學(xué)法。常用誘變方法有物理誘變(如紫外線、X射線、γ射線、快中子)和化學(xué)誘變(如堿基類似物誘變劑、移碼突變劑、烷化劑)[3]。紫外誘變具有方法簡便、效果好、危險性小的特點(diǎn)[4]，能使堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失[5]是其誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生突變的主要原因。常壓室溫等離子體誘變(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)是近年來利用在大氣壓下產(chǎn)生的，溫度在25～40 ℃之間，具有高活性粒子濃度的等離子體射流的新型誘變技術(shù)[6]，具有操作簡便、設(shè)備簡單、條件溫和、安全性高、誘變快速等優(yōu)良特性。它的主要作用機(jī)理[7]是等離子體中的活性離子能使微生物細(xì)胞壁、膜的結(jié)構(gòu)及通透性發(fā)生改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生顯著變化，最終導(dǎo)致微生物發(fā)生突變。

目前關(guān)于紫外結(jié)合常壓室溫等離子體的復(fù)合誘變方法的研究較少，本文采用紫外-常壓室溫等離子體的復(fù)合誘變方法，對紅曲霉進(jìn)行誘變篩選，以期獲得理想的紅曲霉產(chǎn)胞外多糖菌株。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅曲霉ZL307(MonascusZL307)，安徽工程大學(xué)實驗室保藏菌種；斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨5，MgSO41，KH2PO42.5，NaNO33，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25，蛋白胨15，pH 6.0；無水乙醇、苯酚、H2SO4等,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ARTP-II型常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)，北京思清源生物科技有限公司；TD5Z臺式低速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；HH-4超凈工作臺，金壇市杰瑞爾電器有限公司；QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；LDZ-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；L5紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1菌種選育

出發(fā)菌株→制備孢子懸浮液→稀釋→誘變處理→涂平板→挑取單菌落斜面培養(yǎng)→搖瓶復(fù)篩→測定多糖產(chǎn)量

1.2.2培養(yǎng)條件

菌株斜面活化：30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。種子搖瓶培養(yǎng)：100 mL種子液，30 ℃，150 r/min，3 d。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)：100 mL發(fā)酵液液，30 ℃，150 r/min，7 d。

1.2.3苯酚硫酸法測定紅曲霉胞外多糖產(chǎn)量

1.2.3.1苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[8]

準(zhǔn)確稱量105 ℃烘干至恒重的葡萄糖配制成0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL分別置于具塞比色管中，補(bǔ)加蒸餾水至2.0 mL。各加入體積分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻后，加入濃硫酸5 mL，立即搖勻。置沸水浴中煮沸10 min，冷卻至室溫。以0號管調(diào)零點(diǎn)，在波長490 nm測定吸光值。以葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，490 nm下的吸光值為縱坐標(biāo)，線性回歸求得總糖的曲線方程。

1.2.3.2胞外多糖的測定

發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心5 min后，過濾除去菌絲體。真空蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的無水乙醇，3 ℃靜置醇沉24 h。3 500 r/min離心10 min后，取沉淀60 ℃烘干至恒重。用蒸餾水溶解，棄去不溶物，定容至50 mL。量取2 mL多糖溶液于10 mL具塞試管中，加入體積分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1 mL，搖勻。迅速滴加濃硫酸5 mL，充分搖勻。沸水浴中反應(yīng)10 min，取出迅速冷卻至室溫，在490 nm處測定吸光值。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖濃度。

1.2.4誘變方法

1.2.4.1孢子懸浮液的制備

取斜面保藏的菌種接種到新的斜面中30 ℃活化培養(yǎng)7 d，取活化后的菌種接種至平板培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)7 d。用無菌生理鹽水將平板培養(yǎng)后的紅曲菌孢子輕輕洗脫，充分振蕩后過濾，制備成均勻的孢子懸液。用血球計數(shù)板測定制備的孢子懸浮液濃度，將孢子懸浮液用無菌生理鹽水稀釋至106～107個/mL備用。

1.2.4.2紫外誘變

取制備的孢子懸浮液15 mL加入無菌培養(yǎng)皿中，在攪拌子作用下置于15 W紫外燈前15 cm處進(jìn)行照射。分別照射0，15，30，45，60，75，90，105和120 s后取出100 μL孢子懸浮液，將對照孢子懸液和誘變孢子懸液分別稀釋至10-4。分別取0.1 mL涂布至平板上，30 ℃避光培養(yǎng)5 d，觀察并記錄菌落數(shù)，計算致死率[9]。

致死率/%=(對照生長菌落數(shù)-各誘變時間生長的菌落數(shù)/對照生長菌落數(shù))×100

從平板上挑取與出發(fā)菌株相比，菌落直徑較大、周邊呈稠厚狀者接種斜面培養(yǎng)基，并進(jìn)行搖瓶復(fù)篩測定多糖產(chǎn)量[8]，計算正突變率。

正突變率/%=(不同誘變時間組正突變株數(shù)目/突變株總數(shù))×100

1.2.4.3等離子體誘變

等離子器照射條件：距離3 mm；注入氣體為氦氣；氣流量10 L/min；照射功率200 W。取制備的孢子懸浮液10 μL涂布于直徑0.5 cm的不銹鋼載片上，處理時間依次為0，60，120，150，180，210，240 s。將載片放入裝有 1 mL生理鹽水的EP活化培養(yǎng)2 h，再以10 倍梯度稀釋至10-4。分別取0.1 mL涂布至平板上，30 ℃避光培養(yǎng)5 d，觀察并記錄菌落數(shù)，計算致死率。從平板上挑取與出發(fā)菌株相比，菌落直徑較大、周邊呈稠厚狀者接種斜面培養(yǎng)基，并進(jìn)行搖瓶復(fù)篩測定多糖產(chǎn)量，計算正突變率。

1.2.4.4紫外與等離子體復(fù)合誘變

取制備的孢子懸浮液15 mL加入無菌培養(yǎng)皿中，在磁力攪拌下置于15 W紫外燈前15 cm處進(jìn)行照射一定時間。取出100 μL孢子懸浮液，將此孢子懸浮液10 μL涂布于直徑 0.5 cm 的不銹鋼載片上，用等離子體處理一定時間。將載片放入裝有1 mL生理鹽水的EP活化培養(yǎng)2 h，再以10 倍梯度稀釋至10-4。取0.1 mL涂布至平板上，30 ℃避光培養(yǎng)5 d，觀察并記錄菌落數(shù)，計算致死率。從平板上挑取與出發(fā)菌株相比，菌落直徑較大、周邊呈稠厚狀者接種斜面培養(yǎng)基，并進(jìn)行搖瓶復(fù)篩測定多糖產(chǎn)量，計算正突變率。

1.2.4.5誘變菌株的選育

按照最佳的誘變條件，選取誘變后多糖產(chǎn)量較高的紅曲霉菌株連續(xù)傳代5次測定其多糖產(chǎn)量。

1.2.5紅曲霉誘變菌株與原始菌株產(chǎn)胞外多糖曲線的測定

將原始菌株和誘變菌株活化培養(yǎng)14 d，每隔24 h測定1次胞外多糖的產(chǎn)量。

2　結(jié)果與分析

2.1苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

對苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸，得到葡萄糖含量(x)與吸光度(Y)之間的線性回歸方程為：y=14.779x-0.031 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。表明當(dāng)其他條件不變，葡萄糖含量在0.01～0.10 mg/mL范圍內(nèi)變化時，吸光度與葡萄糖含量之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2紫外(UV)誘變

由圖1可知，隨著紫外照射時間的延長，紅曲霉孢子致死率由13%逐漸增加至93%，在75～105 s紅曲霉孢子的致死率為70%到73%，較為穩(wěn)定。而正突變率由7.2%逐漸增加至90 s的14.5%最高值后，90 s后的正突變率又逐漸下降。對致死率曲線進(jìn)行回歸，得到紫外線誘變時間(x)與孢子致死率(Y)之間的回歸方程為：y=-0.004 1x2+1.203 6x+0.138 2 (R2=0.979 3)。當(dāng)紫外功率和照射距離為定值時，紫外線強(qiáng)度一定，誘變時間長短反映了誘變劑量大小。從方程可知，紫外誘變劑量與孢子致死率之間在一定范圍內(nèi)存在復(fù)雜的多項式關(guān)系。

圖1　不同紫外照射時間的致死率和正突變率Fig.1　The death rate and positive mutation rate of different UV irradiation time

隨著照射時間的增加，菌株的突變優(yōu)良可能性就越大，但是菌株的致死率也在不斷上升，突變的優(yōu)良菌株也有可能因此致死，不利于篩選。為了得到有利于生產(chǎn)上應(yīng)用的正突變型菌株，往往采用致死70%～80%的誘變劑量[10]。在75～105 s，紅曲霉菌株的致死率較穩(wěn)定，均保持在70%左右，且菌株的正突變率在此照射區(qū)間內(nèi)也相對較高。為了得到較穩(wěn)定的突變株和獲得較高的正突變率，確定90 s為紅曲霉的最佳紫外誘變時間。

通過紫外誘變90 s，篩選得到5株多糖產(chǎn)量較高的菌株，命名為U1，U2，U3，U4，U5，如圖2所示，發(fā)酵培養(yǎng)后測定其多糖產(chǎn)量分別為425.63，437.81，431.28，427.25、433.62 mg/L，相較于原始菌株分別提高24.73%，28.31%，26.38%，25.21%，27.07%。在此紫外誘變條件下，紅曲霉產(chǎn)胞外多糖的能力產(chǎn)生了有了一定的提高，其產(chǎn)量均值提高26.33%。

圖2　紫外誘變菌株與原始菌株多糖產(chǎn)量的比較Fig.2　Comparison of the UV mutant strain and original strain on polysaccharide production

2.3等離子體(ARTP)誘變

由圖3可知，隨著誘變時間的延長，紅曲霉孢子的致死率曲線呈直線上升，誘變時間達(dá)到180 s后，致死率已增至93%，當(dāng)時間達(dá)到240 s時，致死率已達(dá)到100%。而正突變率由4.2%逐漸增加至180 s的16.5%，180 s后的正突變率又開始下降，不利于篩選優(yōu)良的紅曲霉突變菌株。對致死率曲線進(jìn)行回歸，得到等離子體誘變時間(x)與孢子致死率(Y)之間的回歸方程為：y=-0.002 1x2+0.884 4x+5.048 5(R2=0.988 4)。當(dāng)?shù)入x子流強(qiáng)度和照射距離為定值時，孢子接受等離子體劑量和誘變時間成正比，誘變時間長短反映了誘變劑量大小。從方程可知，等離子體誘變劑量與孢子致死率之間在一定范圍內(nèi)存在復(fù)雜的多項式關(guān)系。

通過與紫外誘變的結(jié)果對比分析可知，在相同的誘變時間下，等離子體誘變條件下的紅曲霉致死率更低，紅曲霉孢子對等離子體的耐受性更好。為了保持較適合的致死率和較高的正突變率，確定180 s為紅曲霉最佳的等離子體誘變時間。

圖3　不同等離子體誘變時間的致死率和正突變率Fig.3　The death rate and positive mutation rate of different ARTP mutation time

通過等離子體誘變180 s，篩選得到6株多糖產(chǎn)量較高的菌株，分別命名為A1、A2、A3、A4、A5、A6。如圖4所示，發(fā)酵培養(yǎng)后測定其多糖產(chǎn)量分別為491.01，487.28，491.34，485.79，486.98，489.65 mg/L，相較于原始菌株分別提高43.89%，42.80%，43.99%，42.36%，42.71%，43.49%。在此等離子體誘變條件下，紅曲霉產(chǎn)胞外多糖的能力產(chǎn)生了較為明顯的改善，其產(chǎn)量均值提高43.21%。與紫外誘變相比，等離子體對提高紅曲霉產(chǎn)胞外多糖的能力有著更好的效果。

圖4　等離子體誘變菌株與原始菌株多糖產(chǎn)量的比較Fig.4　Comparison of the ARTP mutant strain and parent strain on polysaccharide production

2.4紫外-等離子體復(fù)合誘變

由表1可知，相較于紫外誘變和等離子體誘變，復(fù)合誘變的致死率明顯升高，均達(dá)到90%以上。當(dāng)紫外誘變105 s，等離子體誘變210 s時，致死率已達(dá)到100%。

表1　不同紫外-等離子體復(fù)合誘變時間的致死率

由表2可知，相較于紫外誘變和等離子體誘變，復(fù)合誘變的正突變率也有較明顯的提升。當(dāng)紫外誘變90 s，等離子體誘變180 s時，正突變率達(dá)到最高值19.3%，而此時菌株的致死率為95%，在所有的復(fù)合誘變條件中較為溫和。因而確定復(fù)合誘變的最佳條件為紫外誘變90 s，等離子體誘變180 s。

表2　不同紫外-等離子體復(fù)合誘變時間的正突變率

通過復(fù)合誘變篩選得到3株多糖產(chǎn)量較高的菌株，分別命名為ZJ307-1，ZJ307-2，ZJ307-3。由圖5可知，其多糖產(chǎn)量分別為545.24，558.65，551.92 mg/L，較原始菌株分別提高59.78%，63.71%，61.74%，紅曲霉產(chǎn)胞外多糖的能力有著較穩(wěn)定的提高。其產(chǎn)量均值較紫外誘變菌株提高28.02%，較等離子體誘變菌株提高12.95%?？芍獙⒆贤馀c等離子體相結(jié)合應(yīng)用于紅曲霉產(chǎn)胞外多糖的誘變是可行的，比單一的誘變手段效果更加明顯。

圖5　誘變菌株與原始菌株的多糖產(chǎn)量比較Fig.5　Comparison of the mutant strain and parent strain on polysaccharide production

將突變菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)測定多糖含量，其遺傳穩(wěn)定性結(jié)果如圖6所示。隨著傳代次數(shù)的增加，誘變菌株ZJ307-1、ZJ307-2的多糖產(chǎn)量均有所下降，產(chǎn)生了回復(fù)突變。ZJ307-3多糖產(chǎn)量出現(xiàn)了小幅波動，但基本維持在550 mg/L左右，遺傳穩(wěn)定性較好，較原始菌株其多糖產(chǎn)量提高61.18%，較紫外誘變菌株多糖產(chǎn)量提高27.58%，較等離子體誘變菌株多糖產(chǎn)量提高12.55%。實驗結(jié)果表明ZJ307-3菌株多糖產(chǎn)量較高，并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖6　誘變菌株遺傳穩(wěn)定性實驗Fig.6　Mutant strain genetic stability experiment

2.5紅曲霉誘變菌株與原始菌株產(chǎn)胞外多糖曲線的測定

由圖7可知，紅曲霉誘變菌株ZJ307-3和原始菌株ZL307表現(xiàn)出相同的產(chǎn)胞外多糖特性。0～7 d，紅曲霉胞外多糖產(chǎn)量不斷升高，至發(fā)酵7 d時，多糖產(chǎn)量達(dá)到341.24 mg/L、550.07 mg/L，隨后開始逐漸下降。原始菌株ZL307在7～9 d胞外多糖產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，10 d后開始較為緩慢的下降。而誘變菌株ZJ307-3在發(fā)酵7 d達(dá)到最高值后，多糖產(chǎn)量開始迅速下降，至發(fā)酵后期多糖產(chǎn)量已接近原始菌株ZL307。誘變菌株ZJ307-3與紅曲霉原始菌株ZL307相比，其發(fā)酵周期并沒有發(fā)生明顯的改變，最優(yōu)產(chǎn)胞外多糖時間為7 d。

圖7　紅曲霉誘變菌株與原始菌株產(chǎn)胞外多糖曲線Fig.7　Extracellular polysaccharides production curve of the Monascus mutant strain and parent strain

2.6紫外-等離子體復(fù)合誘變紅曲霉產(chǎn)胞外多糖的相關(guān)討論

CARMEN等人[11]認(rèn)為，胞外多糖是微生物在胞內(nèi)合成后，分泌到細(xì)胞外的一類多糖，如莢膜多糖和生物被膜多糖[12]。當(dāng)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的存在時，ARTP 產(chǎn)生的活性粒子并不能夠直接作用于細(xì)胞內(nèi)的生物大分子[13]。Rebenkov 等人[14]認(rèn)為常壓室溫等離子體可以改變細(xì)胞膜的通透性。推測將紫外線與ARTP相結(jié)合應(yīng)對紅曲霉進(jìn)行復(fù)合誘變，能充分利用紫外線對遺傳物質(zhì)的直接作用，改變紅曲霉的遺傳特性；同時結(jié)合ARTP對細(xì)胞整體特性的誘變效應(yīng)，改變紅曲霉細(xì)胞膜的通透性，從而提高了紅曲霉胞外多糖的產(chǎn)量。將紫外與等離子體結(jié)合誘變紅曲霉，對提高其胞外多糖的產(chǎn)量是可行的。

3　結(jié)論

本文以紫外和等離子體作為主要的誘變手段，探討紫外-等離子體復(fù)合誘變紅曲霉的可能性及最佳條件，以期獲得理想的紅曲霉菌株。實驗結(jié)果表明：

將紫外與等離子體結(jié)合，對紅曲霉進(jìn)行復(fù)合誘變，以提高其胞外多糖的產(chǎn)量是可行的。這與沈小靜[15]應(yīng)用于篩選紅霉素高產(chǎn)菌株、章麗[16]應(yīng)用于篩選四羥基環(huán)孢菌素衍生物高產(chǎn)菌株的研究結(jié)果相一致。復(fù)合誘變中紫外誘變條件為：照射距離15 cm，功率15 W，時間90 s。等離子體誘變條件為：照射距離3 mm，注入氣體氦氣，氣流量10 L/min，功率200 W，時間180 s。

通過復(fù)合誘變篩選得到具有良好遺傳穩(wěn)定性的菌株ZJ307-3。與原始菌株相比，其發(fā)酵周期沒有發(fā)生明顯的改變，7d時多糖產(chǎn)量達(dá)到550.07 mg/L，提高61.18%。張建[17]將紫外與微波結(jié)合應(yīng)用于灰樹花的誘變，多糖產(chǎn)量提高42.58%；祝子坪[18]將激光-紫外應(yīng)用于桑黃菌的誘變，多糖產(chǎn)量提高36.88%。與已報道的研究結(jié)果相比，本文采用的紫外-等離子體的復(fù)合物理誘變方法更有優(yōu)勢。

復(fù)合誘變菌株的多糖產(chǎn)量，較單紫外誘變菌株提高27.58%，較單等離子體誘變菌株提高12.55%。與單一紫外誘變與等離子體誘變相比，紫外-等離子體復(fù)合誘變可以得到更好的效果。

物理誘變采用輻射中的各種射線為誘變源[19]對生物靶進(jìn)行誘變，具有突變譜寬、操作簡單的特點(diǎn)。然而物理誘變的實驗操作通常需要一定儀器設(shè)備的支持，同時誘變處理的條件受到儀器設(shè)備自身的限制。物理誘變的回復(fù)率也較高，雖然本文所得的復(fù)合誘變菌株穩(wěn)定性尚佳，但后續(xù)是否有變化仍有待進(jìn)一步的實驗觀察。

[1]李雪梅,沈興海,段震文,等.紅曲霉代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].中草藥,2011,42(5):193-200.

[2]汪鵬榮.一株高產(chǎn)胞外多糖紅曲霉發(fā)酵和提取工藝及抗氧化活性研究[D].金華:浙江師范大學(xué),2012.

[3]李鴻梅,苗琇巖,魏明,等.紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變選育高產(chǎn)多糖羅耳阿太菌[J].食品工業(yè)科技,2014,35(20):244-247；262.

[4]劉延國.側(cè)耳菌紫外誘變選育及發(fā)酵玉米秸稈營養(yǎng)價值的評定[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[5]劉輝,張慶慶,呂聞聞.復(fù)合誘變選育高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株[J].安徽工程大學(xué)學(xué)報,2011,26(3):1-3.

[6]LU Y,WANG L,MA K,et al.Characteristics of hydrogen production of anEnterobacteraerogenesmutant generated by a new atmospheric and room temperature plasma (ARTP)[J].Biochemical Engineering Journal,2011,55(1):17-22.

[7]張雪.Rahnellasp.R3的誘變及其低溫乳糖酶的分離純化與性質(zhì)研究[D].無錫:江南大學(xué),2014.

[8]張建峰.紅曲多糖高產(chǎn)菌株的誘變篩選及其提取純化免疫活性研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[9]張帝,張慶慶,湯文晶,等.He-Ne激光對紅曲霉ZL307的誘變育種[J].安徽工程大學(xué)學(xué)報,2013,28(4):4-7.

[10]王麗寧,趙妍,張寶粉,等.利用原生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)選育耐高溫香菇菌株[J].微生物學(xué)通報,2014,41(7):1 350-1 357.

[11]IGLESIAS-de la cruz C,RUIZ-TORRES P,DELMORAL RG,et al.Age-related progressive renal fibrosis in rats and its prevention with ACE inhibitors and taurine[J].American Journal of Physiology-renal Physiology,2000,278(1): 122-129.

[12]郭守東.微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2010.

[13]張雪,張曉菲,王立言,等.常壓室溫等離子體生物誘變育種及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化工學(xué)報,2014,65(7):2 676-2 684.

[14]RYBENKOV VV,VOLOGODSKII AV,COZZARELLI NR.The effect of ionic conditions on dna helical repeat,effective diameter and free energy of supercoiling[J].Nucleic Acids Research,1997,25(7):1 412-1 418.

[15]沈小靜,張萍,石彥鵬.常壓室溫等離子體結(jié)合紫外誘變篩選紅霉素高產(chǎn)菌株[J].中國獸藥雜志,2015,49(1): 19-23.

[16]章麗,戴夢,鄭桂珍,等.等離子體-紫外復(fù)合誘變選育四羥基環(huán)孢菌素衍生物高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)雜志,2014,34(1):68-71.

[17]張建.物理法誘變灰樹花液體發(fā)酵米糠麩皮產(chǎn)多糖的研究[D].鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué),2010.

[18]祝子坪.桑黃菌的物理誘變與發(fā)酵研究[D].鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué),2007.

[19]汪杏莉,李宗偉,陳林海,等.工業(yè)微生物物理誘變育種技術(shù)的新進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報,2007(2):114-118.

Research on screening and breeding ofMonascuson the production of extracellular polysaccharides by UV-ARTP composite mutagenesis

JIANG Wen,ZHANG Qing-qing*, TANG Wen-jing, CHENG Ya-yun

(Biochemical Engineering College, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000, China)

The parent strainMonascusZL307 was mutated by UV-ARTP composite mutagenesis. The UV mutation conditions were as follows: the distance was 15 cm and the time of irradiation was 90 s with a 15 W ultraviolet lamp. The ARTP mutation conditions were as follows: the distance was 3 mm, the injected gas was helium with a rate of 10 L/min, the irradiation power was 200 W and the time was 180 s. ZJ307-3, a higher production of polysaccharide strain，was obtained. The genetic stability of this strain was well. There were no significant changes during its fermentation period. Its polysaccharide production reached 550.07 mg/L on day 7. Its polysaccharide production was 61.18% higher than that of parent strain. The polysaccharide production of the composite mutant strain was 27.58% higher than that of the UV mutant strain and 12.55% higher than that of the ARTP mutant strain.

Monascus; extracellular polysaccharide; UV mutagenesis; ARTP mutagenesis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601012

碩士研究生(張慶慶教授為通訊作者，E-mail:zhangqq@ahpu.edu.cn)。

安徽高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項目(KJ2009A034)；蕪湖市重點(diǎn)科技項目(蕪科計字[2009]190號)

2015-08-13，改回日期：2015-10-09