靈芝酸G誘導Vβ3+CD8+T細胞抗腫瘤活性的研究

余福恒,胡　芳,汪宏良,李仲娟*,李　超,柯蕭韻,陳　敏

(1黃石市東方衛(wèi)生社區(qū)服務中心，湖北 黃石 435000;2湖北理工學院 醫(yī)學院，湖北 黃石 435003)

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靈芝酸G誘導Vβ3+CD8+T細胞抗腫瘤活性的研究

余福恒1,胡芳2,汪宏良2,李仲娟2*,李超2,柯蕭韻2,陳敏2

(1黃石市東方衛(wèi)生社區(qū)服務中心，湖北 黃石 435000;2湖北理工學院 醫(yī)學院，湖北 黃石 435003)

為探討SEA(Staphylococcus Enterotoxin A，SEA)存在下的靈芝酸G(Licochalcone-G，LG)對小鼠CD8+細胞活化及殺傷腫瘤細胞的作用，采用流式細胞技術(shù)分別檢測CD8+細胞表面分子表達及活化后細胞內(nèi)的顆粒酶B(Granzyme B，GrB)和穿孔素(Perforin，Pf)的水平、Caspase-3酶的活性分析腫瘤細胞凋亡。結(jié)果為:SEA組和SEA+LG組經(jīng)過3 d刺激能激活小鼠CD8+細胞Vβ3和Vβ11分別為7.4±0.45，11.5±0.72。體外實驗顯示， SEA組和SEA+LG組的Vβ3+CD8+T細胞內(nèi)GrB % 的水平分別為70.2±8.04，91.6±8.16;Pf % 的水平分別為67.3±6.86，86.4±7.17，與對照組相比有顯著性差異(t=5.24，t=6.43；t=4.31，t=5.47，P<0.01)；SEA組和SEA+LG組的HL-60腫瘤細胞內(nèi)Caspase-3酶的活性分別為37.6±4.81，68.8±6.82，與對照組相比有顯著性差異(t=3.18，t=5.27，P<0.01)；SEA組和SEA+LG組的A20腫瘤細胞內(nèi)Caspase-3酶的活性分別為23.7±3.58，54.1±5.71，與對照組相比有顯著性差異(t=4.23，t=4.88，P<0.01)。SEA依賴的LG能促使小鼠CD8+T細胞Vβ3和Vβ11分子活化，活化的Vβ3+CD8+T細胞內(nèi)分泌大量的GrB和Pf，并通過Caspase-3的信號途徑誘導腫瘤細胞凋亡。

顆粒酶B；靈芝酸G；腫瘤細胞

靈芝酸大多來源靈芝，是一種三萜類化合物[1]。由于分離方法學的限定，靈芝酸的單體成分生產(chǎn)量極少[2-3]，只有極少部分的靈芝酸單體成分的藥理作用被廣泛研究[4-5]。本次研究樣品LG是高效液相色譜法分離出的15種三萜類活性成分之一，希望通過有限的LG樣本，來探討SEA依賴的LG對小鼠CD8+T細胞活化的分子基礎及殺細胞的免疫學機理。

1　材料

1.1試藥

濃度為20 mg/mL LG由日本靈芝研究所友情提供;SEA、A20細胞和HL-60細胞由日本東京女子醫(yī)科大學免疫室友情提供;FITC-Caspase3、PKH-26熒光染料、PE-CD8抗體、磁珠抗體和CD8磁珠抗體購自BD公司;酶標板、PRMI-1 640培養(yǎng)粉購自GIBCO公司;Hanks液、胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司;PE-Granzyme B 和FITC-Perforin抗體購自eBiosource公司。

1.2動物

清潔級 C57BL/6純系小鼠，雄性，8周齡，體重18～22 g(武漢大學實驗動物學部提供，許可證號SCXK(鄂)2008-0004)。小鼠隨機分為溶劑對照組、SEA組和SEA+LG混合組,每組 10只。實驗室飼養(yǎng)1周后，連續(xù)腹腔注射蒸餾水、SEA或SEA+LG混合液3 d，收集小鼠脾臟CD8+T細胞進行試驗。

2　方法

2.1免疫磁珠法分選小鼠CD8+細胞

取 C57BL/6 小鼠脾臟，玻璃片磨碎200目紗網(wǎng)過濾后溶血，10% FCS PRMI-1 640培養(yǎng)基15 mL離心洗滌3次，0.04%臺盼藍染色計數(shù)活細胞；按磁珠抗體試劑盒說明書操作，將107/mL細胞液用10%的PRMI-1 640細胞培養(yǎng)液重懸，加入適量的生物素標記的雞尾酒抗體(Biotin- Antibody Cocktail包括抗CD4，CD14，CD19，CD123,CD16和TCRγ/δ)混勻，4 ℃孵育 15 min，10%的PRMI-1 640細胞培養(yǎng)液 1 500 r/min離心5 min、洗滌3次后，最終總細胞懸液1 mL置于 Midi MACS分選器中分選[6]，收集CD8+細胞備用。

2.2CD8+T細胞表面亞分子的檢測

用4 ℃預冷的 PBS 收集12 孔細胞培養(yǎng)板中的CD8+T細胞，并用冰冷2% 的流式細胞緩沖液(FACS 液)洗滌2 次，加入純化的鼠IgG 封閉細胞表面 Fc受體，PE標記的抗小鼠CD8單抗和 FITC 標記的抗小鼠Vβ(3.6.11.12)系列單抗同時冰浴30 min 染色， FACS 液洗滌3次，經(jīng)流式細胞儀進行樣本測定，設沒有標記的Vβ+CD8+細胞作對照。

2.3CD8+T細胞GrB和Pf的測定

GrB和Pf的測定按說明書進行。簡而言之，收集溶劑對照組、SEA組和SEA+LG組刺激3 d的Vβ3+CD8+T細胞用2%的流式細胞液洗滌3次，分別用PE-Granzyme B 和FITC-Perforin抗體進行染色，流式細胞儀測定Vβ3+CD8+T細胞內(nèi)的GrB和Pf的表達量。

2.4腫瘤細胞內(nèi)Caspase-3酶的活性檢測

取對數(shù)期HL-60或A20細胞用10% PRMI-1 640洗滌2次，調(diào)整細胞濃度為107個/mL。用紅色熒光PKH-26冰浴染色30 min，洗滌3次后分別與Vβ3+CD8+T細胞一起 37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)3 h， 收集細胞并用FITC 標記的抗小鼠 Caspase-3抗體染色30 min，流式細胞儀測定HL-60或A20細胞Caspase-3酶的活性。

2.5統(tǒng)計學處理

3　結(jié)果

3.1SEA依賴的LG對小鼠體內(nèi)CD8+T細胞表面Vβ+分子的影響

SEA能與機體內(nèi)CD8+T 細胞MHC分子架橋活化，通過SEA 或SEA+LG一起誘導CD8+T細胞β鏈不同結(jié)合區(qū)域的活性表達[7]。10 μg /mL靈芝酸G、1 μg/mL SEA和他們的混合物溶液連續(xù)腹腔注射3 d，收集小鼠脾臟CD8+T細胞，免疫熒光染色后流式細胞儀測定Vβ3、Vβ6、Vβ8、Vβ11和Vβ12的陽性分子表達。不同刺激物對小鼠體內(nèi)Vβ細胞數(shù)量的影響見表1。表1顯示，不同刺激物對小鼠體內(nèi)Vβ6和Vβ8細胞數(shù)量的升高無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。在后面的實驗體系中，為了更加準確評價不同藥物對相同群組小鼠的免疫細胞中不同亞分子的作用，Vβ6會作為實驗中的陰性對照做進一步研究。SEA和LG混合物與對照組相比，可以顯著性升高Vβ3和Vβ11的分子表達(P<0.01)；與SEA組對比，SEA+LG組中Vβ3、Vβ11和Vβ12細胞數(shù)量有顯著性差異(P<0.01)。

表1　不同刺激物對小鼠體內(nèi)Vβ細胞數(shù)量的影響±s,n=10)

注:與對照組相比較，*P<0.01；SEA+LG與SEA組相比較，◆P<0.01。

3.2SEA依賴的LG對小鼠體內(nèi)CD8+T細胞分泌GrB和Pf的影響

不同刺激物對VβCD8+T細胞內(nèi) GrB和Pf的影響結(jié)果見表2。GrB和Pf的分泌是效應T細胞進行細胞免疫的主要途徑[8]，通過分析SEA 或SEA+LG一起體外誘導活化的陰性對照Vβ6、陽性活化細胞Vβ3的CD8+T細胞內(nèi)GrB和Pf水平的變化發(fā)現(xiàn)(表2)，Vβ6+細胞經(jīng)過誘導，細胞內(nèi)GrB和Pf水平并沒有升高；SEA組或SEA+LG組體外誘導Vβ3+CD8+T細胞內(nèi)GrB和Pf的水平與對照組Vβ6+細胞相比有顯著性差異(t=5.24，t=4.31，*P<0.01)；Vβ3+細胞的SEA組與SEA+LG組對比，GrB和Pf的水平均有顯著性差異(t=6.43，t=5.47，**P<0.01)。

表2　不同刺激物對VβCD8+T細胞內(nèi) GrB和Pf的影響

注:與陰性對照組相比較，*P<0.01；SEA+LG與SEA組相比較，**P<0.01。

3.3 Vβ3+CD8+T細胞對腫瘤細胞殺傷活性的影響

CD8+T細胞內(nèi)GrB和Pf是機體抗腫瘤免疫的主要方式，CD8+T細胞內(nèi)GrB和Pf的含量增多，與腫瘤內(nèi)死亡酶Caspase-3的活性具有高度相關(guān)性[9]。不同刺激物對腫瘤細胞死亡的影響結(jié)果見表3。表3顯示，SEA組與SEA+LG組的Vβ3+CD8+T細胞混合培養(yǎng)3 h，腫瘤細胞HL-60和A20 Caspase-3酶活性與對照組相比有顯著性差異(t=3.18，t=4.23，*P<0.01)。SEA組與SEA+LG組對比分析，腫瘤細胞HL-60 和A20 Caspase-3酶活性有顯著性差異(t=5.27，t=4.88，**P<0.01)。

表3　不同刺激物對腫瘤細胞死亡的影響( ±s,n=10)

注:與陰性對照組相比較，*P<0.01；SEA+LG與SEA組相比較，**P<0.01。

4　討論

SEA不僅能與TCR的β鏈架橋促使T細胞的增殖活化，還可以使活化T細胞分泌細胞因子，是機體免疫應答的重要體現(xiàn)[10]。本次研究是通過SEA依賴的LG對T細胞刺激和誘導，篩選出了SEA依賴的LG對T細胞活化的亞分子Vβ3、Vβ11和Vβ12，而對Vβ6和Vβ8沒有活化作用，明確了SEA依賴的LG免疫活化的分子基礎。

近年來，靈芝酸A-C和Mf的體內(nèi)抗腫瘤活性一直被研究和關(guān)注[11]。我們的團隊也證實了靈芝酸G的抗腫瘤活性與免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子有關(guān)[12]。本次研究在活化分子Vβ3的基礎上，與陰性對照分子Vβ6在細胞毒性上做了進一步對照研究，通過SEA依賴的LG對Vβ3和Vβ6 T細胞的刺激和誘導，體外考察這2類細胞的顆粒酶和穿孔素的活性，與單純SEA誘導相比有顯著性差異(P<0.01)，這說明SEA依賴的LG在抗腫瘤方面的作用是顆粒酶和穿孔素的途徑。本實驗還通過Vβ3和Vβ6在體外與HL-60和A20腫瘤細胞混合培養(yǎng)3 h后，考察了腫瘤細胞內(nèi)Caspase-3酶的活性。發(fā)現(xiàn)陰性對照細胞Vβ6對腫瘤細胞沒有殺傷作用，Vβ3對2種腫瘤細胞均有殺傷作用，與單純SEA誘導相比有顯著性差異(P<0.01)。

本次研究結(jié)果揭示SEA依賴的LG能誘導小鼠體內(nèi)CD8+T細胞亞分子的活化，促使Vβ3 T細胞產(chǎn)生大量的GrB和Pf，誘導腫瘤細胞凋亡。這些結(jié)果為LG成為抗腫瘤藥物提供了科學的依據(jù)。

[1]Gao JJ,Nakamura N,Min BS,et al.Quantitative determination of bitter principles in specimens of ganoderma lucidum using high-performance liquid chromatography and its application to the evaluation of ganoderma products [J].Chemical & Pharmaceutical Bulletin，2004，52(6)：688-695．

[2]Wang XM,Yang M,Guan SH,et al.Quantitative determination of six majortriter penoids in Ganoderma lucidum and related species by high performance liquid chromat ography[J].Pharm Biomed Anal,2006,41(3):838-844.

[3]Yang M,Wang X,Guan S,et al.Analysis of triterpenoids in ganoderma lucidum using liquid chromatography coupled with electrospray lonization mass spectrometry[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2007,18 (5):927-939.

[4]Keypour S,Rafati H,Riahi H,et al.Qualitative analysis of ganodericacids Ganoderma lucidum from Iran and china by RPHPLC and electrospryionisat ion-mass spectronetry(ESI -MS)[J].Food Chemistry,2010,119(4):1704-1708.

[5]Tang W,Liu JW,Zhao WM,et al.Ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lung cancer cells[J].Life Sciences,2006,80(3):205-211.[6]Omoe K,Nunomura W,Kato H,et al.High affinity of interaction between superantigen and TCR Vβ molecules induces a high level and prolonged expansion of superantigen-reactive CD4+Tcells[J].Journal of Biological Chemistry,2010,285(4):30427-30435.

[7]李仲娟，楊朝令，李茉,等.超抗原的最新研究進展[J].熱帶醫(yī)學雜志,2012,12(12):1532-1535.

[8]楊海超，董天秀，郭存麗,等.肝細胞癌患者Treg細胞對CD8+T淋巴細胞顆粒酶表達的影響[J].臨床與基礎研究,2013,18(9):613-615.

[9]Li ZJ,Omoe K,Shinagawa K,et al.Interaction between superantigen and T-cell receptor Vβelement determines levels of superantigen-dependent cell-mediated cytotoxicity of CD8+T cells in induction effector phases[J].Microbiology & Immunology,2009,53(8):451-459.

[10]Uchiyama T,Imanishi K,Kato H,et al.Staphylococcal superantigens and the diseasethaay cause.In:Alouf J,Popoff M,Eds[M].The Comprehensive Courcebook of Bacterial Protein Toxins.3rded.New York,USA:Elsevier Ltd,2006:830-843.

[11]Liu RM,Zhong JJ.Ganoderic acid Mf and S induce mitochondria mediated apoptosis in human cervical carcinoma HeLa cells[J].Phytomedicine International Journal of Phytotherapy & Phytopharmacology,2011,18(5):349 -355.

[12]李仲娟，楊朝令，胡芳,等.靈芝酸G對小鼠巨噬細胞免疫活性的研究[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2013,34(13):1640-1641.

(責任編輯吳鴻霞)

Study on Antitumor Activity of Vβ3+CD8+T Cells Induced by Ganoderma Lucidum G

YuFuhen1,HuFang2,WangHongliang2,LiZhongjuan2*,LiChao2,KeXiaoyun2,ChenMin2

(1Huangshi Dong Fang Community Health Service Center,Huangshi Hubei 435000;2School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Objective： To explore the effect of Staphylococcus Enterotoxin A(SEA) dependent ganoderic acid Licochalcone-G (LG) on CD8+cell activation and killing tumor cells in mouse.Method：The levels of intracellular Granzyme B(GrB) and Perforin (Pf),after surface molecules on CD8+cells were expressed and activated,detected by flow cytometry.Apoptosis of tumor cells was analyzed by the detection of Caspase-3 Enzyme activity.Result：After SEA group and SEA+LG group had been stimulated for 3 days,Vβ3 and Vβ11 of CD8+cells in mouse could be activated,and were 7.4±0.45 and 11.5±0.72 respectively.There were significant difference compared with the control group(t=5.24，t=6.43；t=4.31，t=5.47，P<0.01).GrB activity in HL-60 tumor cells of SEA group and SEA+LG group of were 70.2±8.04 and 91.6±8.16 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=5.24，t=6.43，P<0.01) Pf activity in A20 tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 67.3±6.86 and 86.4±7.17respectively,and had significant difference compared with the control group(t=4.31，t=5.47，P<0.01).HL-60 Caspase-3 Enzyme activity in tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 37.6±4.81 and 68.8±6.82 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=3.18，t=5.27，P<0.01).Caspase-3 Enzyme activity in A20 tumor cells of SEA group and SEA+LG group were 23.7±3.58 and 54.1±5.71 respectively,and had significant difference compared with the control group(t=4.23，t=4.88，P<0.01).Conclusion：SEA dependent on LG can prompt Vβ3 and Vβ11 of CD8+cells in mouse to be activated.Large amount of GrB and Pf were excreted in activated Vβ3+CD8+T cells and induced tumor cell apoptosis through Caspase-3 signaling pathway.

Granzyme B；LG；tumor cell

2016-04-23

湖北省科技項目(項目編號:2011Cdc116);黃石市科技項目(黃科農(nóng)〔2012〕1號);教育部46批留學歸國啟動資金支持(46-1)。

余福恒,主管技師，本科。

李仲娟，副教授，博士, 研究方向：細胞分子學。

10.3969/j.issn.2095-4565.2016.04.013

R967

A

2095-4565(2016)04-0054-04