皮膚創(chuàng)面愈合過程中上皮間質化機制的研究

霍嘉慧 孫蘇靜 耿志軍 孫曉艷 付小兵

（1.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室，北京 100048；2.天津醫(yī)科大學，天津 300070； 3.解放軍總醫(yī)院，北京 100853）

皮膚創(chuàng)面愈合過程中上皮間質化機制的研究

霍嘉慧1,2孫蘇靜1,3耿志軍1孫曉艷1,3付小兵1,3

（1.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室，北京 100048；2.天津醫(yī)科大學，天津 300070； 3.解放軍總醫(yī)院，北京 100853）

目的：探討β2腎上腺素受體（β2-AR）在皮膚創(chuàng)傷修復上皮間質化（EMT）過程中的作用機制及意義。方法：采用免疫印跡法（Western blot）、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、免疫熒光技術等實驗方法，體外觀察β2-AR激動劑(ISO)和抑制劑(ICI)對上皮細胞間質化標志物（α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、snail）表達的影響及創(chuàng)面皮膚上皮化標志物（E-鈣黏附素）表達的變化。結果：β2-AR可通過介導皮膚創(chuàng)面愈合的EMT過程，促進表皮細胞向間質表型轉化，且運動和遷移能力在該過程中不斷增強。結論：β2-AR是皮膚上皮間質化的關鍵分子，其介導的EMT過程是皮膚創(chuàng)面愈合的生物學基礎。

創(chuàng)面愈合 上皮間質化 表皮細胞

皮膚是人體最大最外層的器官，具有更新快、易受傷、能起屏障作用保護機體等特點。皮膚覆蓋全身，使機體各組織器官免受外傷、紫外線及病原體等的侵襲。皮膚表皮細胞是一類特殊的上皮組織，其最內(nèi)層即基底層細胞具有不斷增殖、分化的潛能，對皮膚創(chuàng)傷的修復具有重要意義。在皮膚創(chuàng)面修復的增殖和重塑階段，上皮間質化發(fā)揮了重要作用，是創(chuàng)面愈合的關鍵步驟，主要表現(xiàn)為創(chuàng)緣細胞向間質表型發(fā)生轉化，加速了細胞的爬行和遷移，從而促進創(chuàng)口關閉，加快傷口愈合和功能重塑。有研究表明，β2腎上腺素受體（β2-AR）介導的STAT3信號通路能夠影響腫瘤的上皮間質化（epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程[1]。且在動物水平，Thaker等[2]也證實了β2-AR與EMT有關。然而，關于β2-AR與創(chuàng)面愈合過程中上皮間質化之間的關系尚未見報道。本研究主要采用免疫印跡法（Western blot）、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、免疫熒光技術等實驗方法體外觀察β2-AR激動劑(ISO)和抑制劑(ICI)對上皮細胞EMT過程的影響及創(chuàng)面皮膚間質化標志物和上皮化標志物表達的變化，探討β2-AR在皮膚創(chuàng)面愈合過程中的作用以及可能涉及的信號通路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 人永生化表皮細胞系（human immortalized keratinocyte, HaCaT細胞）由本實驗室保存。組織樣本收集于解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院收治的燒傷患者，其中創(chuàng)面組織主要為燒傷或創(chuàng)傷后傷口自主修復過程中形成、因手術需要而局部切除的組織?；颊弑救酥榍彝猓搜芯恳勋@得解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準。E-鈣黏附素（E-cadherin, E-cad）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）、波形蛋白(vimentin）和轉錄因子snail一抗購自美國CST,二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Real Master Mix(SYBR Green)購自日本TOYOBO公司；Image Quant凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國GE公司，激光共聚焦系統(tǒng)購自美國Leica公司。

1.2 實驗分組 處于對數(shù)生長期的HaCaT細胞以0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，分別接種于60 mm2的細胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁并完全展開，生長至密度約70%～80%時饑餓處理24 h。實驗共分為3組：ICI+ISO組以10 μmol/L的β2-AR抑制劑ICI孵育細胞1 h后，繼續(xù)以5 μmol/L的β2-AR激動劑ISO孵育細胞3 h；ISO組以等體積Epilife培養(yǎng)基孵育1 h后，繼續(xù)加入5 μmol/L的ISO孵育細胞3 h；空白對照組于相應時間點分別加入等體積Epilife。處理結束后進行后續(xù)實驗。

1.3 劃痕實驗檢測細胞的遷移能力 處理結束后以無菌1 ml Tip頭垂直于培養(yǎng)皿劃一橫穿過皿的直線，PBS輕柔沖洗細胞3次，洗去脫落的細胞后加入新鮮培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下觀察并拍攝劃線區(qū)域細胞生長情況。

1.4 RT-PCR檢測 HaCaT細胞E-cad、α-SMA、Vimentin和snail基因表達的變化處理結束后，以Trizol直接裂解細胞提取細胞總RNA。RT反應：利用逆轉錄酶MMLV將各1 μg的總RNA逆轉錄為cDNA 10 μl，反應條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 10 min ; 逆轉錄酶失活，85 ℃ 5 min。Real-time PCR:按照Real Master Mix 10 μl、上下游引物各1 μl、2 μl模板cDNA、ddH2O補足20 μl配制反應體系。PCR反應條件:95 ℃，2 min預變性，95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，40個循環(huán)后進行熔鏈分析，結束后導出Excel數(shù)據(jù)，以GAPDH為內(nèi)參基因分析各目的基因表達水平變化。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測 HaCaT細胞E-cad、α-SMA、 Vimentin及snail蛋白表達的變化 處理結束后收集細胞，按常規(guī)步驟提取細胞總蛋白。總蛋白定量后取等量蛋白加入4×上樣緩沖液混勻；沸水浴5 min使蛋白變性后直接上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）；采用濕式轉移法轉印蛋白；5%脫脂奶粉封閉；抗體孵育后進行檢測。其中，E-cad、α-SMA一抗為鼠抗（1∶1 000倍稀釋），二抗為山羊抗鼠IgG-HRP（1∶1 000倍稀釋）；snail和Vimentin一抗為兔抗（1∶1 000倍稀釋），二抗為山羊抗兔IgG-HRP（1∶1 000倍稀釋）。

1.6 免疫熒光法觀察皮膚創(chuàng)面及創(chuàng)緣組織E-cad以及α-SMA表達 創(chuàng)緣及正常皮膚組織行冰凍切片，冰甲醛固定15 min，PBS漂洗3次，每次5 min。0.1%Triton-X 100打孔15 min，PBS漂洗3次，每次5 min。5%山羊血清室溫封閉30 min。在玻片上滴加E-cad、α-SMA抗體（1:100倍稀釋），濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min。繼續(xù)加入熒光標記二抗（1∶100倍稀釋），濕盒內(nèi)室溫避光孵育2 h，PBS漂洗3次，每次5 min，DAPI染核并封片，于熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5.0作圖。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊。SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，證實組間差異有統(tǒng)計學意義，組間兩兩比較采用Dunnett's T檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 細胞劃痕實驗 細胞劃痕實驗結果顯示，ISO組HaCaT細胞較空白對照組爬行能力明顯增強， ICI+ISO組較ISO組和空白對照組細胞遷移能力有所下降。細胞遷移能力：ISO組＞空白對照組＞ICI+ISO組。結果表明，β2-AR具有調控表皮細胞遷移的能力。見圖1。

圖1 劃痕實驗檢測細胞遷移能力（倒置顯微鏡×100）

2.2 RT-PCR檢測E-cad、α-SMA、 Vimentin以及snail基因表達變化 PCR檢測結果顯示，ISO可明顯上調α-SMA、 Vimentin以及snail基因在細胞中的表達；而當添加ICI時，則能明顯抑制ISO的這種效應，證實ICI能特異性地拮抗ISO對β2-AR的激動作用。而E-cad在ISO組表達下調，但在ICI+ISO組表達有回升。這一結果從基因水平證實β2-AR參與了調控表皮細胞EMT的過程。見圖2。

2.3 Western blot檢測E-cad、α-SMA、Vimentin以及snail蛋白的變化 Western blot檢測結果顯示， ISO處理后，E-cad的表達顯著下調，而利用ICI拮抗后，其表達又明顯上調。α-SMA、Vimentin以及snail蛋白的表達水平在ISO處理后則明顯上調，但在ICI進一步處理后，這3種蛋白的表達有所下降。見圖3。

圖2 HaCaT細胞E-cad、α-SMA、Vimentin以及snail基因表達水平的變化

圖3 HaCaT細胞E-cad、α-SMA、Vimentin以及snail蛋白表達水平的變化

2.4 免疫熒光觀察創(chuàng)面及正常皮膚組織中E-cad及α-SMA的表達 免疫熒光結果顯示，正常皮膚組織中E-cad高表達，α-SMA則低表達或不表達。而在皮膚創(chuàng)面組織中α-SMA呈現(xiàn)高表達，而E-cad低表達。證實EMT是皮膚組織創(chuàng)面愈合的關鍵過程。見圖4（封二）。

3 討 論

表皮細胞是皮膚最主要的細胞群，占皮膚細胞的90%以上[3]。當皮膚受損后，包括修復細胞、炎癥細胞、細胞外基質以及細胞因子共同參與并高度調控皮膚創(chuàng)面的修復過程[4]。典型的創(chuàng)面愈合過程包括4個連續(xù)的階段：①止血和凝血；②炎癥；③增殖；④重塑[5]。

皮膚表皮細胞是上皮細胞的一種特殊類型。皮膚表皮由復層扁平上皮構成，最外層為老化的角質細胞層，易脫落形成皮屑；最內(nèi)層為基底層，也稱為生發(fā)層，借基底膜與皮膚真皮層相連，由單層矮柱狀上皮細胞構成，分裂活躍，以補充衰老脫落的角質細胞。EMT這一概念由Green和Hay首先提出[6]，其主要表現(xiàn)為上皮細胞經(jīng)過結構改變后，極性改變，細胞間黏附減少，細胞的運動和遷移能力增強，同時細胞的上皮特性逐漸丟失，而表現(xiàn)出間質的特性。EMT過程的典型表現(xiàn)為肌動蛋白細胞骨架的重組，細胞遷移增強[7]，細胞可獲得更強的運動能力。這一過程廣泛發(fā)生于包括胚胎發(fā)育、創(chuàng)面愈合、組織器官纖維化、實體瘤浸潤轉移等多個病理生理過程中[8]。根據(jù)不同的生物學環(huán)境，EMT分為3種不同的生物學亞型，其中與組織發(fā)育和器官形成相關的EMT過程屬于第Ⅰ型，與皮膚的創(chuàng)面愈合、組織再生以及器官纖維化相關的EMT過程被歸為第Ⅱ型，而與腫瘤侵襲與轉移相關的EMT過程則被定義為第Ⅲ型[9]。3類EMT過程中的特征性信號分子及信號通路均有報道，如成纖維特異性蛋白（FSP-1）、Vimentin等分子主要介導Smads通路和PI3K-AKT通路，且在Ⅰ型和Ⅱ型EMT過程中可逆[10]；而Ⅲ型EMT過程則涉及包括核轉錄因子-κB（NF-κB）通路、轉化生長因子-β（TGF-β）通路在內(nèi)的多條信號轉導路徑，形成復雜的網(wǎng)絡結構，從而導致腫瘤浸潤及轉移。研究表明，實體瘤的周圍細胞間質特性表現(xiàn)增強時則表示該類腫瘤更易于發(fā)生侵襲和轉移，惡性程度更高[11]。

細胞間黏附降低被認為是EMT初級階段的標志之一。本研究結果證實，在上皮間質化過程中，表皮細胞可能在某些分子的調控下使創(chuàng)緣部位的表皮細胞特性發(fā)生改變，使細胞間的黏附降低，從而促進細胞的爬行遷移。此外，在EMT過程中細胞間質化的標志物表達上調[12]，如α-SMA、Vimentin、snail等的表達與E-cad表達趨勢相反。本研究中免疫熒光結果也證實在皮膚創(chuàng)面中間質化的特征標志α-SMA高表達，而正常組織中則為上皮化的特征標志E-cad高表達，該種特征標志的轉變說明EMT是皮膚組織創(chuàng)面愈合的重要過程。

腎上腺素受體(adrenergic receptor, AR)依據(jù)其生物學效應的不同可分為α受體和β受體兩類，研究表明，β2-AR作為上游信號分子能調控腫瘤細胞的遷移過程[13]，其介導的受體信號能夠下調腫瘤細胞的上皮標志物E-cad，同時上調間質標志物（如α-SMA和 Vimentin等）的表達。本研究從基因水平和蛋白水平同時證實，ISO可通過激動β2-AR進而激活下游的信號通路，加速下游EMT過程，繼而促進表皮細胞向間充質轉化，表達間質細胞標志物，增強細胞的遷移能力，最終促進皮膚創(chuàng)面的愈合。且β2-AR特異性抑制劑ICI能夠拮抗ISO的激動作用，使EMT過程向上皮表型轉化，降低細胞間質化的標志物表達。但β2-AR促進EMT過程所涉及的具體信號通路仍有待下一步研究。

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Research of the mechanism of epithelial mesenchymal transition during skin wound healing

Huo Jiahui*△, Sun Sujing, Geng Zhijun, Sun Xiaoyan, Fu Xiaobing.
* Key Research Laboratory of Tissue Repair and Regeneration of PLA, and Beijing Key Research Laboratory of Skin Injury Repair and Regeneration, First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China;△Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Fu Xiaobing ( E-mail: fuxiaobing@vip.sina.com) Sun Xiaoyan ( E-mail: yanzisun1979@sina.com)

Objective: To explore the mechanism and significance of β2-adrenergic receptor (β2-AR) in the procedure of epithelial mesenchymal transition (EMT) during wound healing and tissue regeneration. Methods: The influence of β2-AR agonist (ISO) and inhibitor (ICI) on the expression of markers of mesenchymal transition (α-smooth muscle actin, vimentin, snail) or marker of epithelization (E-cadherin) in epidermis cells during wound healing and tissue regeneration was observed using western blot, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunofluorescence. Results: The epithelial cells gained mesenchymal phenotypic feature, and got stronger ability in movement and migration. β2-AR was a critical molecule which mediated EMT process. Conclusions: β2-AR is a key molecule in the procedure of EMT, and β2-AR mediated EMT is a biological basis of skin wound healing and matrix remodeling.

Wound healing; Epithelial mesenchymal transition; Epithelial cells

2016-08-20）

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 03. 003基金項目：國家自然科學基金資助項目(30901564, 81101883, 81245185, 81372067, 81121004, 81230041)；國家973計劃項目（2012CB518105）

付小兵,研究員，中國工程院院士（E-mail: fuxiaobing@vip.sina.com)孫曉艷，副研究員（E-mail: yanzisun1979@sina.com）