細(xì)胞鐵死亡的分子調(diào)控機(jī)制及臨床應(yīng)用策略*

孫 杰 戴振航 沈義凱 彭 瀾 吳藝舟

1 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心，江蘇省南京市 211166；2 南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院； 3 南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系

細(xì)胞鐵死亡(Ferroptosis)具有獨(dú)特的形態(tài)特征、基因表達(dá)和嚴(yán)密的調(diào)控系統(tǒng)，是一種完全不同于凋亡、自噬和壞死的新型死亡模式。形態(tài)學(xué)特征主要表現(xiàn)在線粒體體積變小、雙層膜更為致密、外膜破裂、嵴減少。生化特征主要表現(xiàn)在鐵和活性氧的積累、蛋白激酶活化、胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)體(Cystine/glutamate antiporter system，System Xc)被抑制、胱氨酸攝取量減少、谷胱甘肽(GSH)合成減少、NAPDH被氧化等[1-3]。鐵死亡信號(hào)通路中最重要的是鐵離子和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。其中，ROS將鐵死亡分成上游ROS的產(chǎn)生和下游ROS發(fā)揮作用執(zhí)行鐵死亡兩個(gè)部分。本文將從ROS和鐵含量的變化兩個(gè)方面具體闡述鐵死亡的發(fā)生機(jī)制。

1 ROS積累調(diào)控鐵死亡

正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞中存在著谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidases，GPXs)能夠催化過(guò)氧化氫和氫過(guò)氧化物的分解，將其轉(zhuǎn)化為H2O和相應(yīng)的醇，這一過(guò)程必須有谷胱甘肽(GSH)作為必要的輔助因子進(jìn)行參與。GPXs家族包括GPX1～GPX8多個(gè)成員，其中GPX4在鐵死亡的進(jìn)程中有著更為重要的作用[4]。如果GPX4活性或表達(dá)量降低，將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量積累升高，誘發(fā)鐵死亡。在GPX4活性中心中有一種名為硒代半胱氨酸(Selenocysteine，Sec)的氨基酸，其需要Sec tRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)才能進(jìn)入到GPX4中發(fā)揮作用。而Sec tRNA的成熟需要異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(Isopentenyl transferase)將異戊烯焦磷酸(IPP)中的異戊烯基轉(zhuǎn)移到Sec tRNA。因此可以通過(guò)IPP的形成途徑即甲羥戊酸通路，調(diào)節(jié)IPP的產(chǎn)量，進(jìn)而調(diào)節(jié)GPX4的活性，誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。此外，小分子化合物RSL3對(duì)BJeLR細(xì)胞的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GPX4是RSL3的靶蛋白，RSL3通過(guò)直接作用于GPX4從而造成ROS的累積誘發(fā)鐵死亡[5]。此外，其他的一些化合物如DPI7、DPI10等同樣可以直接作用于GPX4，具體機(jī)制有待研究。

由于GSH是GPXs進(jìn)行抗氧化反應(yīng)必需的輔助因子，對(duì)GSH合成的調(diào)節(jié)也是鐵死亡中重要的機(jī)制。GSH是由細(xì)胞內(nèi)的甘氨酸、谷氨酸與胱氨酸共同合成，其中胱氨酸來(lái)源是關(guān)鍵。目前已研究證實(shí)有以下幾種，第一種方式：調(diào)節(jié)System Xc。System Xc是在神經(jīng)細(xì)胞膜表面廣泛分布的氨基酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，將谷氨酸轉(zhuǎn)移到胞外并將胱氨酸轉(zhuǎn)入胞內(nèi)。 因此System Xc對(duì)胱氨酸的攝取可以影響到GSH的生成量，進(jìn)而改變GPX4的活性。erastin、sulfasalazine等鐵死亡誘導(dǎo)劑通過(guò)抑制System Xc減少胱氨酸的攝取，從而誘導(dǎo)鐵死亡。System Xc是由SLC7A11和SLC3A2組成的異二聚體。研究發(fā)現(xiàn)SLC7A11是抑癌基因p53的新靶點(diǎn)，p53可以通過(guò)下調(diào)SLC7A11的表達(dá)進(jìn)而抑制System Xc攝取胱氨酸合成GSH，致使GSH依賴性的GPXs活性降低，細(xì)胞抗氧化能力降低，活性氧升高，引起細(xì)胞鐵死亡[4]。第二種方式：調(diào)節(jié)β-巰基乙醇。β-巰基乙醇可以不通過(guò)System Xc促進(jìn)胱氨酸的吸收，因此也是一條作用于GSH含量的鐵死亡通路。第三種方式：調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)或者甲硫氨酸。胱氨酸的來(lái)源除上述兩種以外，還存在著一種細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化。在細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下，甲硫氨酸可以通過(guò)硫轉(zhuǎn)移途徑轉(zhuǎn)化為胱氨酸，從而促進(jìn)GSH形成及GPXs活性的增強(qiáng)。

以外，在缺血的神經(jīng)組織中5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)表達(dá)明顯升高。5-LOX是一個(gè)促進(jìn)脂質(zhì)ROS生成的物質(zhì)，其抑制劑zileuton被證明能夠抑制鐵死亡從而保護(hù)神經(jīng)組織[6]。 左旋谷氨酰胺是谷氨酰胺分解代謝過(guò)程中關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，也被證實(shí)可以進(jìn)一步誘導(dǎo)ROS生成并促進(jìn)鐵死亡。

2 鐵累積調(diào)控鐵死亡

鐵是人體中必不可少的微量元素，在細(xì)胞的氧化、供能等方面都有著不可或缺的作用。鐵離子在參與線粒體的氧化磷酸化過(guò)程中，細(xì)胞不僅僅會(huì)產(chǎn)生ATP，也會(huì)產(chǎn)生一定量的ROS。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子的存在還可加速飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。因此，細(xì)胞內(nèi)鐵攝入的增加和鐵儲(chǔ)存的減少都有可能造成細(xì)胞的鐵過(guò)載，進(jìn)而引發(fā)鐵死亡。銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin，CP)和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ferroportin，F(xiàn)PN)負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)鐵離子向胞外輸出。在蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage, SAH)后早期腦損傷中，CP和FPN可抑制鐵向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，使得細(xì)胞內(nèi)鐵含量增加，進(jìn)而誘發(fā)鐵死亡。

二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(Divalent metal transporter 1, DMT1)是鐵代謝中向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的蛋白。三價(jià)鐵離子可與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)結(jié)合，從而轉(zhuǎn)運(yùn)到外周組織附近。可由細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Transferrin receptor 1，TFR1)介導(dǎo)經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞并儲(chǔ)存于內(nèi)體中，在酶促作用下被還原為二價(jià)鐵離子，并被DMT1介導(dǎo)從內(nèi)體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中。鐵蛋白(Ferritin)由鐵蛋白輕鏈(FTL)和鐵蛋白重鏈(FTH)構(gòu)成，以多聚體形式吸收鐵離子在胞質(zhì)中儲(chǔ)存。其中FTH含有亞鐵氧化酶中心，將二價(jià)鐵離子快速轉(zhuǎn)化到三價(jià)鐵并儲(chǔ)存在鐵蛋白分子中，F(xiàn)TL涉及鐵的礦化和儲(chǔ)存。研究發(fā)現(xiàn)抑制鐵代謝的主要轉(zhuǎn)錄因子IREB2(Iron responsive element binding protein 2)可以顯著增加FTL、FTH1的表達(dá)，表明通過(guò)IREB2可以間接調(diào)控體內(nèi)鐵離子吸收。此外，血紅素加氧酶HO-1(heme oxygenase)也是細(xì)胞內(nèi)鐵的重要來(lái)源，研究證明HO-1可誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)從而引起鐵死亡的發(fā)生，還可以將細(xì)胞內(nèi)的血紅素分解為鐵和卟啉，促進(jìn)鐵死亡的進(jìn)程。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)被打破后，過(guò)量的鐵通過(guò)Fenton反應(yīng)將過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為ROS，進(jìn)而引起鐵死亡。

3 鐵死亡誘導(dǎo)劑

目前發(fā)現(xiàn)的鐵死亡誘導(dǎo)劑包括調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)和調(diào)節(jié)鐵離子代謝反應(yīng)。(1)erastin是最先發(fā)現(xiàn)的鐵死亡誘導(dǎo)劑。線粒體電壓依賴性陰離子通道(Voltage-dependent anion channels，VDACs)是轉(zhuǎn)運(yùn)離子和代謝產(chǎn)物的跨膜通道[7]。erastin可以結(jié)合VDACs使得線粒體發(fā)生功能紊亂，產(chǎn)生ROS損害線粒體或直接作用于System Xc使其受到抑制，從而觸發(fā)鐵死亡，并且該過(guò)程由于HO-1誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵離子和產(chǎn)生ROS而得以增強(qiáng)。erastin的衍生物piperazine erastin因其在細(xì)胞內(nèi)的溶解性及穩(wěn)定性比erastin更優(yōu)越，可通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡抑制人成纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞的增殖[8]。(2)索拉菲尼(sorafenib)現(xiàn)廣泛應(yīng)用于晚期肝癌的治療中，可通過(guò)抑制System Xc誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生，從而增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性，抑制其增殖，促進(jìn)持續(xù)性的腫瘤衰退。研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2可以調(diào)控GSH的生成量，通過(guò)激活p62-keap1-Nrf2通路可以實(shí)現(xiàn)抗氧化，防止細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。而敲除Nrf2及其靶基因可以增強(qiáng)sorafenib的活性，抑制肝癌細(xì)胞增殖。抑制p62后，HO-1、NQO1和FTH1的抗氧化反應(yīng)元件可明顯增強(qiáng)鐵死亡誘導(dǎo)劑，如sorafenib、erastin、sulfasalazine等的活性[9]。(3)小分子化合物RSL3、DPI2/7/10和Fin56均可直接對(duì)GPX4產(chǎn)生抑制作用，從而產(chǎn)生脂質(zhì)活性氧，導(dǎo)致鐵死亡。誘導(dǎo)劑RSL5直接與VDAC2/3作用可以產(chǎn)生ROS導(dǎo)致鐵死亡。丁磺氨酸(Buthionine sulfoximine，BSO)不可逆地抑制γ-谷氨酸/半胱氨酸合成酶的活性，從而減少GSH合成并抑制其活性。細(xì)胞外過(guò)量的谷氨酸或谷氨酸鹽也能夠抑制System Xc的活性，最終引起鐵死亡[10]。(4)在乳腺癌的治療過(guò)程中，西拉美新(siramesine)可以通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)改變細(xì)胞內(nèi)的鐵含量，當(dāng)造成鐵累積時(shí)可以誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。這一過(guò)程也可結(jié)合拉帕替尼(lapatinib)共同作用[11]。

4 鐵死亡抑制劑

調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝正常進(jìn)行、提高GSH水平、提高GPX4活性、直接抑制ROS產(chǎn)生等都能抑制細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激類抑制劑，例如第一代鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1的活性依賴于芳香胺，通過(guò)特異性地抑制脂質(zhì)活性氧反應(yīng)產(chǎn)生的ROS積累進(jìn)而抑制erastin和RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡[12]。第二代(SRS11-92)和第三代鐵死亡抑制劑(SRS16-86)的代謝更為穩(wěn)定，且抗組織損傷的能力顯著增強(qiáng)。如前所述，通過(guò)上調(diào)Nrf2表達(dá)量或利用zileuton抑制5-LOX活性降低ROS產(chǎn)生，均可以抑制鐵死亡。對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞尤其是皮層神經(jīng)細(xì)胞，酪氨酸激酶受體FLT3和PI3Kα抑制劑可抑制鐵死亡的發(fā)生[13]。此外，trolox、ebselen、 tocopherol、vitamin E、lostoxin A、pepstatin methyl ester、丁羥甲苯、氯化銨等均可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化途徑抑制鐵死亡。

調(diào)節(jié)鐵離子代謝類抑制劑通過(guò)適當(dāng)減少不正常的鐵攝取過(guò)程可以有效抑制erastin誘發(fā)的鐵死亡。例如HSPB1(Heat shock protein beta 1)在細(xì)胞內(nèi)參與鐵攝取過(guò)程，通過(guò)抑制熱休克因子轉(zhuǎn)錄因子-1的表達(dá)可以影響HSPB1的表達(dá)，進(jìn)而抑制erastin誘導(dǎo)的鐵死亡[14]。通過(guò)shRNA下調(diào)TFR1同樣可以抑制erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。鐵螯合劑抑制鐵死亡是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)鐵無(wú)法向氧化物傳遞電子，進(jìn)而抑制ROS的生成[12]。根據(jù)鐵螯合劑作用機(jī)制將其分為三類：親脂性鐵螯合劑可穿過(guò)細(xì)胞膜并螯合細(xì)胞內(nèi)游離鐵，抑制脂質(zhì)自由基的形成；鐵螯合劑可直接作用于含有鐵離子的酶，進(jìn)而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化；沒(méi)有膜通透性的鐵螯合劑如去鐵胺(Desferrioxamine B，DFO)等，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用截取細(xì)胞溶酶體中的鐵離子，進(jìn)而阻止脂質(zhì)活性氧的生成。

5 鐵死亡的臨床應(yīng)用策略

針對(duì)不同類型的疾病，適當(dāng)?shù)蔫F死亡誘導(dǎo)劑或抑制劑可以起到一定的治療作用。一方面，在癌癥治療領(lǐng)域利用鐵死亡誘導(dǎo)劑治療腫瘤細(xì)胞將成為癌癥治療的一種新思路。鐵死亡作為一種新型細(xì)胞程序性死亡模式，因其特殊的作用機(jī)制和信號(hào)通路能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行清除，尤其是對(duì)放化療、凋亡等死亡方式不敏感的腫瘤細(xì)胞更為重要。例如胰腺癌細(xì)胞耐受化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，卻對(duì)青蒿酯誘導(dǎo)的鐵死亡敏感。雙氫青蒿素可以誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生鐵死亡[15]。西拉美新、拉帕替尼可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞鐵死亡[11]。對(duì)乙酰氨基酚可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[16]。

另一方面，已有研究證實(shí)鐵死亡與許多神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。不同于腫瘤治療，在神經(jīng)治療領(lǐng)域通過(guò)抑制鐵死亡的發(fā)生可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)而抑制神經(jīng)疾病的發(fā)生。例如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種復(fù)雜的神經(jīng)疾病，其特征為多巴胺能神經(jīng)元缺失。轉(zhuǎn)鐵蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的鐵運(yùn)輸過(guò)程中有重要作用，但在PD患者中發(fā)生異常，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)量輸入，造成胞內(nèi)鐵離子聚集。PD患者黑質(zhì)中鐵離子含量明顯升高，進(jìn)而可引起羥基自由基升高和多巴胺氧化，氧化環(huán)境的產(chǎn)生可對(duì)黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元造成損傷。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TFR2的突變可能通過(guò)降低鐵離子的攝取進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)[17]。研究表明鐵死亡在PD發(fā)生的機(jī)制中可能與多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)。人源多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系LUHMES細(xì)胞對(duì)鐵死亡十分敏感，erastin能夠誘導(dǎo)明顯的鐵死亡特征[18]。這表明給予PD患者鐵抑制劑可能是PD患者潛在的治療手段。此外，在Huntington舞蹈病(Huntington’s disease，HD)的前期研究中發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)谷氨酸鹽、GSH和鐵離子含量異常、脂質(zhì)過(guò)氧化物積累和神經(jīng)細(xì)胞非凋亡性死亡[3]。在HD大鼠紋狀體離體腦片模型中轉(zhuǎn)染具有致病性的外顯子HttN90Q7，再給予鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1，能夠通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，明顯減輕離體腦片中神經(jīng)細(xì)胞的死亡情況。以上研究表明，鐵死亡在疾病發(fā)生進(jìn)程中發(fā)揮作用，對(duì)鐵死亡的抑制有利于疾病進(jìn)程的延緩、病情的減弱。對(duì)于神經(jīng)疾病而言，鐵死亡抑制劑是基礎(chǔ)研究與臨床治療的一個(gè)新的切入點(diǎn)，具有關(guān)鍵意義。

綜上所述，目前的研究已經(jīng)表明鐵死亡在重大疾病的研究與治療方面具有重要意義。對(duì)細(xì)胞鐵死亡機(jī)制的進(jìn)一步研究有助于臨床腫瘤及神經(jīng)疾病的治療，有著巨大的發(fā)展?jié)摿?。?duì)鐵死亡機(jī)制及鐵死亡誘導(dǎo)劑、鐵死亡抑制劑的探索勢(shì)必成為今后的研究重點(diǎn)。此外對(duì)于目前已廣泛應(yīng)用于臨床的藥物，如索拉菲尼等在鐵死亡的新作用機(jī)制的進(jìn)一步研究也將具有重要的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用價(jià)值。