聚L-半胱氨酸修飾電極對(duì)食品中香蘭素的測(cè)定

遲玉峰，曲有樂(lè)，石　婧

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山　316022；2.浙江海力生制藥有限公司，浙江舟山　316021；3.舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江舟山　316021）

聚L-半胱氨酸修飾電極對(duì)食品中香蘭素的測(cè)定

遲玉峰1，2，曲有樂(lè)1，石婧3

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江海力生制藥有限公司，浙江舟山316021；3.舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江舟山316021）

用循環(huán)伏安法制備聚L-半胱氨酸修飾電極并研究了香蘭素在聚L-半胱氨酸修飾電極上的電化學(xué)行為，建立了一種測(cè)定香蘭素的新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在pH=2.2磷酸鹽緩沖溶液中，香蘭素檢測(cè)線性范圍為1.2×10-5～1.2×10-4 mol/L；檢出限為8.0×10-7 mol/L。同時(shí)該修飾電極具有良好的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性，可用于食品中香蘭素的檢測(cè)，結(jié)果滿意，有較廣的應(yīng)用前景。

化學(xué)修飾電極；香蘭素；聚L-半胱氨酸；循環(huán)伏安法

香蘭素又名香草醛、香草酚（學(xué)名3-甲氧基-4-羥基苯甲醛）有香草的特殊氣味［1］，主要用于食品添加劑［2］，是全球產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的香料之一，廣泛運(yùn)用在各種需要增加奶香氣息的調(diào)香食品中，飲料、冰激凌、糖果、焙烤食品、明膠和布丁、口香糖、巧克力、糖漿等。有“食品香料之王”的美譽(yù)［3］。按照我國(guó)現(xiàn)行《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2014）中的規(guī)定，香蘭素可以作為食品添加劑使用并有相應(yīng)的限度要求，但是標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)0～6個(gè)月嬰幼兒配方食品、巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳、稀奶油等部分食品不得添加任何食用香料。對(duì)于市場(chǎng)上可能出現(xiàn)的違法添加香蘭素的情況，選擇便捷，穩(wěn)定性好，靈敏度高的檢測(cè)方法尤其重要。目前，有關(guān)香蘭素（VNL）含量測(cè)定的方法主要有高效液相色譜法［4］、分光光度法［5］、氣相色譜法［6］和微分脈沖溶出伏安法［7-15］等。本實(shí)驗(yàn)采用了循環(huán)伏安法來(lái)進(jìn)行研究。

本工作研究了聚L-半胱氨酸修飾電極的制備及香蘭素在此修飾電極上的電化學(xué)行為，建立了循環(huán)伏安法測(cè)定香蘭素的新方法?？捎糜谔枪仁称分邢闾m素的測(cè)定，結(jié)果滿意。本修飾電極制備簡(jiǎn)便，具有良好的選擇性、穩(wěn)定性、高靈敏度和較寬的線性范圍，應(yīng)用前景良好。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

CHI660C型電化學(xué)分析系統(tǒng)（上海辰華儀器有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電化學(xué)實(shí)驗(yàn)三電極系統(tǒng)：玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。

香蘭素（上海市阿拉丁試劑有限公司）配制成8.0×10-5mol/L溶液避光保存；L-半胱氨酸（天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）配制成2.0×10-4mol/L的溶液；磷酸鹽緩沖溶液體系（PBS，pH 2.2～8.0）。試液均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均二次蒸餾水。

1.2聚L-半胱氨酸修飾電極的制備

將玻碳電極（Φ=3.8mm）在濕潤(rùn)的金相砂紙（粒度為1 000）上磨光，用中性三氧化二鋁（30 nm）懸浮液拋光成鏡面，依次用硝酸（1：2，V/V）、無(wú)水乙醇、二次蒸餾水超聲清洗（2 min/次，每次清洗后需用二次水沖洗再放入另一個(gè)清洗瓶中），

用二次蒸餾水清洗干凈后，放入10.00 mL PBS（pH=4.0），1.00 mL（2.0×10-4mol/L）L-半胱氨酸及9.00 mL H2O配成的溶液中（聚合前要搖勻），以玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，在0.0～1.0 V電位范圍內(nèi)，以0.08 V/s掃描速率循環(huán)掃描20段，取出，并用二次水沖淋電極表面，即制得聚L-半胱氨酸修飾電極。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

在50 mL電解池中，依次加入pH=2.2的磷酸鹽緩沖溶液10.00 mL、0.20 mL香蘭素、9.80 mL二次蒸餾水。以聚L-半胱氨酸修飾電極作為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，攪拌1 min，在0.2～1.0 V電位范圍內(nèi)，以0.10 V/s掃描速率循環(huán)掃描2段，并記錄峰電位和峰電流。

2　結(jié)果分析

圖1　聚合液pH的影響Fig.1　Effect of Polymer solution pH

2.1電化學(xué)聚合條件的選擇

在研究聚合底液中濃度對(duì)測(cè)定的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)濃度對(duì)其電化學(xué)行為影響并不大。當(dāng)L-半胱氨酸加入體積為1.00 mL（2.0×10-4mol/L）時(shí)，響應(yīng)電流達(dá)到最大。

2.1.1最佳聚合pH的選擇

聚合溶液的pH值會(huì)影響修飾電極的性能，設(shè)定其余參數(shù)不變，僅改變?nèi)芤旱膒H值，測(cè)得聚合液在pH= 4.0的情況下，香蘭素在修飾電極上的響應(yīng)電流達(dá)到最大。結(jié)果如圖1。所以選擇pH=4.0的緩沖溶液為底液。

2.1.2最佳聚合段數(shù)的選擇

聚合物修飾電極膜的厚度與聚合底液濃度及掃描段數(shù)均有一定的關(guān)系。聚合液濃度越大時(shí)，膜越厚。設(shè)定上述聚合液濃度，僅改變掃描段數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)聚合20段時(shí)，修飾電極對(duì)香蘭素的響應(yīng)電流達(dá)到最大。結(jié)果如圖2。因此選擇聚合段數(shù)為20段。

2.1.3最佳聚合電位的選擇

限定低電位為-0.2 V，僅改變高電位進(jìn)行研究。結(jié)果表明：當(dāng)高電位為1.0 V時(shí)，香蘭素在修飾電極上氧化峰的響應(yīng)電流達(dá)到最大，如圖3所示。

限定高電位為1.0 V，僅改變低電位進(jìn)行研究。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)碗娢粸?.0 V時(shí)，香蘭素在修飾電極上氧化峰的響應(yīng)電流達(dá)到最大，如圖4所示。

所以，本實(shí)驗(yàn)選擇聚合電位范圍為：0.0～1.0 V。

2.1.4最佳聚合掃描速率的選擇

掃描速率對(duì)修飾電極的響應(yīng)電流有較大的影響。限定其它聚合參數(shù)，僅改變掃描速率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：當(dāng)掃描速率0.08 V/s時(shí)，所制備的修飾電極對(duì)香蘭素的響應(yīng)電流達(dá)到最大，結(jié)果如圖5。所以選擇掃描速率為0.08 V/s。

圖2　掃描段數(shù)的影響Fig.2　Effect of scan segment

圖3　高電位的影響Fig.3　Effect of high potential

圖4　低電位的影響Fig.4　Effect of low potential

圖5　掃描速率的影響Fig.5　Effect of scan rate

2.2聚L-半胱氨酸修飾電極的聚合循環(huán)伏安曲線

圖6為L(zhǎng)-半胱氨酸在最佳聚合條件下聚合過(guò)程的循環(huán)伏安圖。由圖可知：隨掃描段數(shù)的增加，峰電位不變，峰電流增加，但增加幅度逐漸減小，最后趨向穩(wěn)定。證明了L-半胱氨酸在電極表面發(fā)生了聚合反應(yīng)。

2.3測(cè)定香蘭素的最佳條件

在濃度為2.00×10-4mol/L，pH=4.0，掃描段數(shù)為20段，掃描速率為0.08 V/ s，電位范圍為0.00～1.0 V的聚合條件下進(jìn)行試驗(yàn)，比較不同的pH、段數(shù)、高低電位及掃描速率對(duì)香蘭素在聚L-賴氨酸修飾電極上的響應(yīng)電流值的影響。

2.3.1最佳測(cè)定pH的選擇

圖6　聚L-半胱氨酸聚合過(guò)程的循環(huán)伏安曲線Fig.6　CVs of Poly-L-cysteine polymerization process

實(shí)驗(yàn)表明：在pH為2.2～8.0之間，Epa與pH呈線性關(guān)系，回歸方程為：E=1.01-0.048 pH，r=0.995 6（如圖9），說(shuō)明了香蘭素的氧化還原過(guò)程有質(zhì)子參與。當(dāng)pH=2.2時(shí)，響應(yīng)電流最大（如圖7所示），所以選擇2.2為測(cè)定液pH值。

2.3.2最佳測(cè)定電位的選擇

改變低電位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)定高電位為1.4 V。結(jié)果表明：當(dāng)?shù)碗娢粸?.2 V時(shí)，香蘭素在修飾電極上的響應(yīng)電流最大（如圖10所示）。

圖7　測(cè)試液pH的影響Fig.7　Effect of the test solution pH

圖8　香蘭素在聚L-賴氨酸修飾電極上的pH變化的CV曲線（1-7為pH為2.2，3，4，5，6，7，8）Fig.8　Vanillin at the surface of poly-L-lysine amino acid modified electrode for different pH（the pH of 1-7：2.2，3，4，5，6，7，8）

圖9　8.0×10-5 mol/L香蘭素在聚L-半胱氨酸修飾電極上的峰電位與pH的關(guān)系曲線Fig.9　EffectofpHonpeak potentialsfor8.0×10-5mol/LVanillin onthesurfaceofpoly-L-lysine aminoacidmodifiedelectrode

圖10　低電位的影響Fig.10　Effect of low potential

改變高電位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)定低電位為0.2 V。結(jié)果表明：當(dāng)高電位1.0 V時(shí)，香蘭素在修飾電極上的響應(yīng)電流最大（如圖11所示）。

所以本實(shí)驗(yàn)選擇的電位范圍為：0.2～1.0 V。

2.3.3最佳測(cè)定掃描速率的選擇

改變掃描速率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，氧化峰電流與掃描速率的大小呈線性關(guān)系（圖12），其線性回歸方程為ipa=1.62×10-6-1.25×10-5v，r=0.996 7，說(shuō)明香蘭素在修飾電極上的電極過(guò)程為吸附過(guò)程。隨掃描速率的增加，峰電流增加（圖13）。在掃描速度為0.10 V/s時(shí)，峰形最好，故本實(shí)驗(yàn)選用掃描速率為0.10 V/s。

2.3.4最佳測(cè)定攪拌時(shí)間的選擇

由于香蘭素吸附在電極表面，攪拌時(shí)間對(duì)峰電流有較大影響。改變攪拌時(shí)間t，對(duì)8.0×10-5mol/L的香蘭素進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：峰電流的大小，隨攪拌時(shí)間的增大，先增大后減小，在60 s時(shí)的氧化峰的數(shù)值達(dá)到最大（如圖14所示）。因此選擇60 s為最佳攪拌時(shí)間。

2.4工作曲線和穩(wěn)定性

圖11　高電位的影響Fig.11　Effect of high potential

圖12　掃描速率與氧化峰電流的關(guān)系曲線Fig.12　The relationship curves of the scan rate and the oxidation peak current

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，用循環(huán)伏安法對(duì)香蘭素進(jìn)行測(cè)定（循環(huán)伏安曲線如圖15），香蘭素在1.2×10-5～1.2×10-4mol/L的濃度范圍內(nèi)與氧化峰電流有良好的線性關(guān)系（如圖16），其線性方程分別為：ipa（A）= 6.231×10-7+0.043 C，相關(guān)系數(shù)為：R1=0.998 9，檢出限：8.0×10-7mol/L。

圖13　掃描速率與氧化峰電流的關(guān)系曲線（1-7為掃描速率0.04，0.08，0.12，0.16，0.20，0.24，0.28 v/s）Fig.13　The relationship curves of the scan rate and the oxidation peak current（the scan rate of 1-7：0.04，0.08，0.12，0.16，0.20，0.24，0.28 v/s）

圖14　攪拌時(shí)間的影響Fig.14　Effect of churning time

圖15　最佳實(shí)驗(yàn)條件下聚L-半胱氨酸在濃度香蘭素中的循環(huán)伏安曲線Fig.15　CVs of poly-L-cysteine in the concentration of 1.2×10-5-1.2×10-4mol/L vanillin under the optimum conditions

2.5干擾實(shí)驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，允許相對(duì)誤差在±5%范圍，對(duì)于8.0×10-5mol/L的香蘭素，用濃度為香蘭素濃度60倍的Na+，K+，檸檬酸，Cu2+，維生素（B6、B12），Ca2+，Mg2+，Zn2+，不干擾測(cè)定；60倍的Fe3+和蔗糖對(duì)于測(cè)定有一定的干擾性，但影響并不大。

2.6回收率的測(cè)定

取10.00 g的添加有香蘭素的奶糖研碎，用15 mL無(wú)水乙醇溶解，溶解后轉(zhuǎn)入布式漏斗中抽濾，再加15 mL無(wú)水乙醇清洗濾渣，最后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻備用。取6 mL，進(jìn)行回收率測(cè)定，平行實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖16　香蘭素的濃度與氧化峰電流的關(guān)系曲線Fig.16　The relationship curves of vanillin concentration and oxidation peak current

3　結(jié)論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，最佳聚合條件為：濃度為2.00×10-4mol/L，pH=4.0，掃描段數(shù)為20段，掃描速率為0.08 V/s，電位范圍為0.00～1.0 V。在此條件下，可制得最佳聚L-半胱氨酸修飾電極。最佳測(cè)定條件為：pH=2.2，電位范圍0.20～1.0 V，掃描速率為0.10 V/s，攪拌時(shí)間為60 s；在此條件下，用聚L-半胱氨酸修飾電極可準(zhǔn)確地測(cè)量食品中香蘭素的含量。

表1　樣品中香蘭素的測(cè)定結(jié)果（次數(shù)n=6）Tab.1　The determination results of vanillin in the sample（n=6）

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Poly（L-Cysteine）Modified Electrode for Determination of Vanillin in Food

CHI Yu-feng1，2，QU You-le1，SHI Jing3
（1.Food and Pharmaceutic School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022；2.Zhejiang Hailisheng Pharmaceutical Co Ltd，Zhoushan316021；3.Zhoushan Institute for Food and Drug Control，Zhoushan 316021，China）

The poly（L-Cysteine）modified electrodes were prepared using cyclic voltammetry.The electrochemical behavior of vanillin on the poly（L-Cysteine）modified electrodes was studied.A new method to determine vanillin was established.The study results showed that in phosphate buffer solution pH=2.2，the linear range for the determination of vanillin was from 1.2×10-5to 1.2×10-4mol/L and the limit of detection was 8.0 ×10-7mol/L.Meanwhile the modified electrodes demonstrated excellent sensitivity，selectivity and stability.The medthod was applied to the determination of vanillin in chocolates with satisfactory results and will have a wider application prospect.

chemically modified electrode；Vanillin；L-Cysteine；cyclic voltammetry

O657.14

A

1008-830X（2016）02-0127-05

2015-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（21276240/B06037）

遲玉峰（1977-），男，浙江舟山人，工程師，研究方向：藥物分析.E-mail：zj_hls_chi@163.com

曲有樂(lè)（1960-），男，教授.E-mail：youle1960@163.com