化州柚入藥部位的探討

張秋玲，伍柏堅，黃曉丹，陳康，林勵*

(1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510130；2.廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510450；3.廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

化州柚入藥部位的探討

張秋玲1，伍柏堅2，黃曉丹2，陳康3，林勵3*

(1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510130；2.廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510450；3.廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

目的：對化州柚外果皮、中果皮、果瓤進行研究，探討其入藥部位，為化州柚資源充分利用奠定基礎。方法：采用紫外分光光度法測定化州柚外果皮、中果皮、果瓤的總黃酮含量，采用HPLC測定柚皮苷含量和色譜指紋圖譜相似度，結(jié)合藥效學研究，探討化州柚的入藥部位。結(jié)果：化州柚果實各部位總黃酮、柚皮苷含量大致相仿，色譜指紋圖譜相似度較高；外果皮、中果皮、果瓤與全果均能延長小鼠咳嗽潛伏期和減少小鼠的咳嗽次數(shù)，組間比較無統(tǒng)計學差異。結(jié)論：化州柚以全果入藥存在一定科學性與合理性。

化州柚；入藥部位；總黃酮；柚皮苷；指紋圖譜；鎮(zhèn)咳；小鼠

《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)2010版中規(guī)定化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，具有理氣寬中、燥濕化痰的功效[1]。這兩種植物基原中，前者化州柚習稱為“毛橘紅”，是特產(chǎn)于廣東省化州市的道地藥材，其質(zhì)量明顯優(yōu)于后者，明清兩代曾列為皇室貢品，被公認為理氣化痰的首選藥材。化州柚主要有效成分是柚皮苷等黃酮類化合物，其中柚皮苷是《中國藥典》2010版規(guī)定的含量測定指標成分，具有顯著的消炎作用[2]。收載化州柚的入藥部位被《中國藥典》2010版定為干燥外層果皮，但自古以來道地產(chǎn)區(qū)化州市就將化州柚未成熟干燥全果入藥，習稱為橘紅珠[3]。為探討充分利用化州柚資源的可行性，緩解道地藥材緊缺的局面，作者進行了本項研究。

1 儀器、試藥與材料

1.1儀器

1200系列高效液相色譜儀，G1322A在線真空脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1329A自動進樣器，G1316A 柱溫箱，G1315B DAD紫外檢測器(美國 Agilent)；Precisa XS225A型電子分析天平(瑞士，0.1 mg)；魚躍牌YUYUE402A超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設備有限公司)。

1.2 材料

柚皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110722-200610)；野漆樹苷對照品(自制，純度：98.57%)HPLC用甲醇為色譜純，水為超純水；其他所用試劑均為分析純；可立停(磷酸苯丙哌啉口服溶液，北京九龍制藥有限公司，批號：120803)。

化州柚鮮果[直徑(6.8±0.2) cm，(110±10) g，化州綠色生命有限公司化州柚GAP基地]，2012年4月采收，經(jīng)廣東省中藥研究所蔡岳文主任中藥師鑒定其基原為化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’。置沸水中燙2 min，取燙制后部分果實分割成外果皮、中果皮、果瓤，上述不同部位及全果于60 ℃烘干，打成粗粉備用。

1.3 動物

SPF級NIH小鼠，雌雄各半，體重18～22 g(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心)，合格證號：粵監(jiān)證字2012A005。

2 方法

2.1 紫外分光光度法測定總黃酮含量

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷對照品0.010 10 g，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 樣品溶液的制備 取化州柚全果及不同部位的粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，水浴加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得樣品溶液A；再精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[4]。

2.1.3 標準曲線制備 分別精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置25 mL量瓶中，然后分別加入100 g·L-1硝酸鋁溶液1 mL，加甲醇至刻度，搖勻，放置15 min；另取100 g·L-1硝酸鋁溶液 1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為空白對照溶液。分別于306 nm處測定吸光度，得線性回歸方程為Y= 37.331X-0.002(r=0.999 8)，線性范圍為0.004 28～0.042 8 mg·mL-1。

2.1.4 樣品總黃酮含量測定 將各樣品分別按上述方法制備樣品溶液，精密量取樣品溶液1.0 mL置25 mL量瓶中，加入100 g·L-1硝酸鋁溶液1 mL，加甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，于306 nm處測定吸光度。代入回歸方程，計算各樣品總黃酮含量。

2.1.5 方法學考察 精密度試驗的RSD=0.56%；穩(wěn)定性試驗90 min內(nèi)RSD=1.01%；重現(xiàn)性試驗的RSD=1.12%；加樣回收率試驗平均回收率為98.85%，RSD=1.82%。

2.2 HPLC法測定化州柚柚皮苷含量

2.2.1 色譜條件 流動相：A(甲醇)-B[水-乙酸(61∶4)](40∶60)，流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；色譜柱：Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：283 nm[2-4]。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密量取總黃酮測定項下的柚皮苷對照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度為0.101 0 mg·mL-1。

2.2.3 樣品溶液的制備 取總黃酮測定項下制備的樣品溶液。

2.2.4 標準曲線制備 取上述對照品溶液，分別進樣2、4、8、10、15、20 μL，按上述色譜條件進行測定，得回歸方程為Y= 28.98X-2.409 7(r=0.999 8)，線性范圍為0.202～2.020 μg。

2.2.5 樣品柚皮苷含量測定 取各樣品溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，進樣10 μL，依法測定，外標峰面積法計算柚皮苷含量。

2.2.6 方法學考察 柚皮苷含量測定的精密度試驗的RSD=0.62%；穩(wěn)定性試驗8 h內(nèi)RSD=0.92%；重現(xiàn)性試驗的RSD=1.43%；加樣回收率試驗的平均回收率為98.74%，RSD=1.62%。

2.3 HPLC色譜指紋圖譜分析

2.3.1 色譜條件 流動相：A(甲醇)-B[水-乙酸(61∶4)]，二元梯度洗脫(0～10 min，0%～10% A；10～15 min，10%～13% A；15～20 min，13%～25% A；20～50 min，25%～55% A；50～55 min，55%～62% A；55～60 min，62%～70% A；60～70 min，70%～100% A；70～75 min，100% A)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：283 nm；柱溫：25 ℃；色譜柱：Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)[4-5]。

2.3.2 樣品溶液的制備 取總黃酮測定的樣品溶液制備項下樣品溶液A，精密量取50 mL，水浴上蒸干，加適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 樣品指紋圖譜測定 取各樣品溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，進樣10 μL，測定并記錄色譜圖。

2.3.4 方法學考察 取外果皮供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h進行測定，柚皮苷保留時間的RSD和峰面積的RSD分別為0.46%和0.94%；取外果皮供試品溶液，連續(xù)進樣5次，柚皮苷保留時間的RSD和峰面積的RSD分別為0.86%和0.94%；取外果皮供試品溶液5份，峰面積比例大于1%的5個主要色譜峰保留時間RSD均低于1.0%，保留時間RSD均低于1.81%。

3 藥效學研究

3.1 受試藥的制備

稱取化州柚外果皮、中果皮、果瓤、全果粗粉各8.5 g，按《中國藥典》2010版一部附錄ⅩD項下提取揮發(fā)油，分別提取兩次(3、2 h)后將各自水提液合并濃縮至80 mL，分別加入揮發(fā)油(適量乙醇溶解)得濃縮液(生藥含量為0.085 g·mL-1)，再加水至100 mL，備用(用前搖勻)。試驗劑量按臨床成人(60 kg)服用3 g計算[1]，小鼠給藥劑量為0.43 g·kg-1。

3.2 方法

小鼠72只，雌雄各半，隨機分成6組，分別為全果組、外果皮組、中果皮組、果瓤組、可立停組(按臨床成人60 kg每次服用40 mL計算)和0.9%氯化鈉溶液組。每組小鼠12只，抽取相應體積的藥液，按20 mL·kg-1體重計算，用0.9%氯化鈉溶液補至相應體積，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥4 d。于末次給藥后1 h，將小鼠逐個放入玻璃鐘罩內(nèi)，以氨水(25%)噴霧引咳20 s，觀察小鼠從噴霧開始到出現(xiàn)腹肌收縮張嘴的時間以及2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，首咳時間超過90 s者，按90 s計[6-7]。藥效實驗數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件處理，方差分析比較各組之間的差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 化州柚各部位黃酮類成分含量測定結(jié)果

化州柚各部位黃酮類成分含量的測定中，柚皮苷對照品與樣品紫外光譜見圖1，柚皮苷對照品與樣品HPLC色譜見圖2，測定結(jié)果見表1。在各部位中，總黃酮、柚皮苷含量大致相仿，以果瓤部位的含量最高。

注：A.柚皮苷；B.外果皮；C.中果皮；D.果瓤。圖1 柚皮苷對照品與化州柚各部位紫外光譜圖

注：A.柚皮苷；B.外果皮；C.中果皮；D.果瓤。圖2 柚皮苷對照品與化州柚各部位HPLC圖

表1 化州柚各部位黃酮類成分含量測定(n=3)

4.2 化州柚各部位的色譜指紋圖譜結(jié)果

化州柚各部位的色譜指紋圖譜見圖3～7。應用國家藥典委員會推薦使用的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，以外果皮的指紋圖譜為參比圖譜，計算圖譜之間的相似度，共標識13個共有峰，相似度計算結(jié)果見圖8。外果皮、中果皮、果瓤、全果的相似度分別為1.000、0.937 7、0.896 3、0.972 3。

圖3 柚皮苷和野漆樹苷HPLC圖

圖4 化州柚全果HPLC指紋圖譜

圖5 化州柚外果皮HPLC指紋圖譜

圖6 化州柚果瓤HPLC指紋圖譜

圖7 化州柚中果皮HPLC指紋圖譜

注：1.外果皮；2.果瓤；3.中果皮；4.全果；R.共有模式。圖8 化州柚各部位相似度計算分析圖

4.3 化州柚藥效學研究結(jié)果

表2結(jié)果表明，外果皮組、中果皮組、果瓤組、全果組與空白組比較，均能延長小鼠咳嗽潛伏期和減少2 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；外果皮組與全果組、果瓤組、中果皮組間相互比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 化州柚各部位對小鼠的鎮(zhèn)咳作用

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

5 小結(jié)與討論

化州柚產(chǎn)于化州市，其果實為一種表皮密被絨毛的特有的柚。史上化州柚原被列入橘紅項下，李中立的《本草原始》就載有：“橘紅，廣東化州者勝”；由于化州橘紅質(zhì)優(yōu)效佳，之后才單列為化橘紅?；蓁种泄ず凸糠謩e占果實總重的34%和9%，《中國藥典》2010版僅按照橘紅類以果皮入藥的方法，規(guī)定化橘紅以外果皮入藥，既有悖于化州柚傳統(tǒng)入藥方法，又浪費了化州柚中果皮和果瓤部分，不利于化州柚資源的利用。

本研究結(jié)果顯示，外果皮與中果皮、果瓤的總黃酮、柚皮苷含量大致相仿；指紋圖譜相似度軟件計算結(jié)果顯示各部位的指紋圖譜具有較高的相似度，顯示分散在果實各部位中黃酮類成分大致相同；藥效學研究表明外果皮、中果皮、果瓤、全果均具有較強的鎮(zhèn)咳效果，后三者與外果皮比較鎮(zhèn)咳作用差異無統(tǒng)計學意義。表明化州柚以全果入藥具有一定科學性與合理性。

本研究為充分利用化州柚資源、緩解道地藥材的緊缺局面打下了堅實的研究基礎，為后續(xù)的研究作了很好的開端，但僅對總黃酮化學成分及鎮(zhèn)咳效果進行對比研究，有一定的局限性，作者擬繼續(xù)開展揮發(fā)油化學成分，祛痰、抗炎等藥效藥理研究和急毒、長毒的毒理學研究，以及進一步以化橘紅為君藥的經(jīng)典中藥復方的藥效學對比研究，力求更加全面地評價化州柚全果入藥的科學性。

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StudyonMedicinalPartsofCitrusGrandis‘Tomentosa’

ZHANGQiuling1，WUBojian2，HUANGXiaodan2，CHENKang3，LINLi3*

(1.GuangzhouHospitalofTCM，Guangzhou510450，China；2.GuangzhouWanglaojiPharmaceuticalCompanyLimited，Guangzhou510450，China；3.GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Objectives：To study the exocarp，mesocarp and flesh ofCitrusgrandis‘Tomentosa’ for laying the foundation to make full use of resources.Methods：The total flavonoids content was determined by UV spectrophotometry.The naringin content and similarity of chromatographic fingerprint were determined by HPLC.Combined with the pharmacological index to the medicinal parts ofC.grandis‘Tomentosa’ was discussed.Results：The total flavonoids content and naringin content were similar in different parts ofC.grandis‘Tomentosa’.The similarity of chromatographic fingerprint of different parts was higher.All groups of exocarp，mesocarp，flesh and the whole fruit prolonged the cough incubation periodand and reduce the cough frequency in mice.There were no significant differences between all groups of them.Conclusion：There exists a certain scientific reasons for that the whole fruit ofC.grandis‘Tomentosa’ could be used as medicinal parts.

Citrusgrandis‘Tomentosa’；medicinal parts；total flavonoids；naringin；chromatographic fingerprint；antitussive；mice

2015-07-07)

國家發(fā)展和改革委員會發(fā)改高技(2003-26)

*

林勵，研究員，研究方向：中藥資源利用與新藥開發(fā)；E-mail：13802914007@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.009