冬蟲夏草繁育品與野生品紅外指紋圖譜一致性評價△

詹澤蘋，李華，黃亮，李文慶，辛立波，李文佳，錢正明，劉國柱*，鄧炳初

(1.廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523808；2.廣東省食品藥品檢驗所，廣東 廣州 510180)

冬蟲夏草繁育品與野生品紅外指紋圖譜一致性評價△

詹澤蘋1，李華2，黃亮1，李文慶1，辛立波1，李文佳1，錢正明1，劉國柱1*，鄧炳初1

(1.廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523808；2.廣東省食品藥品檢驗所，廣東 廣州 510180)

目的：建立冬蟲夏草的紅外指紋圖譜檢測方法，對冬蟲夏草野生品、繁育品以及偽蟲草(蟬花、蟲草花、中華被毛孢菌絲粉、蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉)進行紅外測試。方法：根據紅外平均圖譜、一階導數圖譜、二階導數圖譜和標準偏差圖譜，判斷這3種蟲草的一致性。結果：在3000～2800 cm-1、1800～1000 cm-1、1000～800 cm-1，30批冬蟲夏草繁育品和21批野生品的紅外光譜圖譜的指紋圖譜具有較好的一致性，相似度均大于0.90；與偽蟲草不一致，相似度均小于0.90。結論：該方法具有良好的專屬性、重復性、穩(wěn)定性和精密度，可用于冬蟲夏草紅外指紋圖譜分析。

冬蟲夏草；紅外指紋圖譜；一致性分析

冬蟲夏草系麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(BerK.)Sacc.寄生于鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上所形成的子座及幼蟲尸體的干燥復合體，具有補腎益肺、止血化痰的功能。紅外光譜作為中藥鑒別的輔助手段近年來發(fā)展較快，有成本低、操作便捷等特點[1]。目前紅外指紋圖譜已成為鑒定和分析不同產地及品種的藥材內在質量的重要手段[2-3]。宋文軍[4]利用紅外進行了冬蟲夏草野生品的分析與鑒別。王鋼力等[5]采用近紅外漫反射法對不同產地冬蟲夏草進行鑒別。另外還有顯微鑒別、紫外吸收光譜鑒別、高效毛細管電泳鑒別、分子鑒別等鑒別方法[6-10]。冬蟲夏草繁育品為自然狀態(tài)下育種，模擬高原環(huán)境培植而成，為證明冬蟲夏草繁育品與野生品的化學成分一致性，本實驗開發(fā)了冬蟲夏草的紅外光譜指紋圖譜檢測方法，并用該方法對21 批冬蟲夏草野生品和30批繁育品進行檢測以及相似度評價。

1 儀器與實驗材料

1.1 儀器

紅外光譜儀(布魯克公司，TENSOR 27)；壓片機(美國PIKE公司，Crush IR)；分析天平(METTER公司，XP204)。

1.2 試劑

溴化鉀購于aladdin公司。

1.3 供試品

冬蟲夏草野生品樣本21批(編號：CSN-1～CSN-21)，包括青海冬蟲夏草樣本7批(編號：CSN-1～CSN-7)；西藏冬蟲夏草樣本7批(編號：CSN-8～CSN-14)，四川冬蟲夏草樣本7批(編號：CSN-15～CSN-21)；冬蟲夏草繁育品30批(編號：CSC-1～CSC-30)，由東陽光藥業(yè)研究院提供。以上樣本經中國中醫(yī)科學院研究員鑒定為冬蟲夏草。

中華被毛孢菌絲粉(編號：a)為宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司生產；蟲草花(編號：b)購自廣東；蟬花(編號：c)購自江西；蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉(編號：d)購自江西。

2 方法

2.1 樣品處理方法

取樣品粉末(過三號篩)4 mg與溴化鉀粉末200 mg混合，置于紅外燈下，在瑪璃乳缽中研磨均勻，裝入壓片模具100 mg，壓制約1 min，制成透明薄片，置于紅外光譜儀中進行測試。

2.2 檢測條件

傅里葉變換紅外光譜儀光譜范圍4000～400 cm-1；分辨率4 cm-1；掃描次數16次；重復測定次數5次；溴化鉀中紅外分束器。

2.3 色譜圖處理方法及評價

使用賽默飛世爾公司提供的OMNIC紅外軟件對原譜進行處理，得到紅外平均圖譜、一階導數圖譜、二階導數圖譜和標準偏差圖譜。設原圖平均圖譜為對照圖譜，計算各樣品圖譜與對照圖譜的相似度。

3 結果與討論

3.1 實驗條件考察

3.1.1 裝樣量考察 取冬蟲夏草樣品粉末2 mg與溴化鉀200 mg于瑪瑙乳缽中研磨均勻，分別裝入壓片模具70、80、90、100、110、120 mg壓片，壓片質量結果見表1。裝樣量在100～110 mg時，壓片效果較好，透明度好的壓片能降低測量誤差。

表1 不同裝樣量的壓片質量

3.1.2 樣品與溴化鉀混合比例考察 分別稱取樣品2、3、4、5、6 mg與200 mg溴化鉀研磨均勻后壓片，將制得的供試片置于紅外光譜儀中進行測試，結果表明，樣品用量為4 mg時，壓片效果較好，且紅外吸收峰強度較好。

3.1.3 掃描次數考察 取3.1.2制得的供試片，置于紅外光譜儀中，依次調整掃描次數為2、4、8、16、32、64進行測試，每個掃描次數條件下測試5次，結果表明，隨著掃描次數的增加，譜圖的重復性越好，但是測量時間增加。綜合各種因素，選擇藥材的掃描次數為16。

3.1.4 重復測定次數考察 取3.1.2制得的供試片，置于紅外光譜儀中，樣品連續(xù)掃描3、4、5、6次得到紅外圖譜，經軟件處理得到平均圖譜、二階導數圖譜和標準偏差圖譜。結果表明，測量次數越多，測得譜圖的重復性越好，但樣品測定時間越長，綜合各種因素，選擇冬蟲夏草樣品的重復測定次數為5次。

3.2 方法學考察

3.2.1 重復性考察 取同一批冬蟲夏草樣品粉末(過三號篩)，按2.1項下平行制備5份樣品，分別置于紅外光譜儀中按2.2項下檢測方法進行測試。結果所得的原譜、一階導數光譜、二階導數光譜的譜線基本重合，表明本實驗方法的重復性良好。

3.2.2 精密度考察 取冬蟲夏草樣品制得供試片，連續(xù)測定5次，取同一批冬蟲夏草樣品同法制片，連續(xù)測定3 d，對比紅外指紋圖譜。結果所得譜圖的譜線基本重合，表明儀器日內和日間精密度均良好。

3.2.3 穩(wěn)定性考察 取冬蟲夏草樣品制得供試片，放入干燥器內保存，分別在0、1、2、3、4、5、8、12、24 h測定所得紅外譜圖。結果顯示24 h內所得紅外圖譜的譜線基本重合，表明樣品壓片后24 h內穩(wěn)定。

3.2.4 專屬性考察 主要考察類似產品對本方法有無干擾。取冬蟲夏草樣品及偽蟲草(蟬花、蟲草花、中華被毛孢菌絲粉、蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉)，分別進行紅外測試，比較這5個樣品紅外譜圖原圖、一階導數圖譜及二階導數圖譜的差異。紅外譜圖原圖顯示冬蟲夏草樣品在3000～2800 cm-1及1800～1000 cm-1峰型與蟲草花、中華被毛孢菌絲粉、蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉有較大的差異，而與蟬花譜圖差異不明顯；一階導數光譜顯示冬蟲夏草樣品在1000～800 cm-1峰型與蟬花譜圖差異均較為顯著；二階導數光譜顯示冬蟲夏草樣品與4種偽品的峰型均有不同程度的差別。

3.3 樣品檢測

按實驗方法分別對青海、西藏、四川冬蟲夏草野生品21批、繁育品30批以及偽蟲草(中華被毛孢菌絲粉、蟲草花、蟬花、蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉)進行紅外測試，得到紅外圖譜原圖，用Norris導數過濾器對紅外圖譜原圖進行處理，得到一階導數圖譜和二階導數圖譜。將21批冬蟲夏草野生品所得到紅外譜圖進行平均化后再進行平均，得到平均圖譜，設置此譜圖為標準圖譜；用Norris導數過濾器對該平均圖譜進行處理，得到一階導數圖譜和二階導數圖譜。采用OMNIC軟件的“QC Compare”功能將冬蟲夏草繁育品30批供試樣品、21 批野生品和偽蟲草的紅外圖譜原圖與標準指紋圖譜進行比對，得到相似度結果見表2。從紅外圖譜總體分布特征來看，冬蟲夏草野生品和繁育品共51批基本一致。從相似度結果來看，30批冬蟲夏草繁育品和21批野生品的相似度均大于0.90，而偽蟲草(蟲草花、蟬花、蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉和中華被毛孢菌絲粉)的相似度均小于0.90，與前期報道結果一致[1，3]。冬蟲夏草野生品、CSC-10批冬蟲夏草繁育品以及偽蟲草(中華被毛孢菌絲粉、蟲草花、蟬花、蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉)的紅外原圖譜、一階導數圖譜和二階導數圖譜的疊加對比圖，見圖1。以上結果顯示30批冬蟲夏草繁育品和21批野生品的紅外光譜圖譜的指紋圖譜具有較好的一致性，與偽蟲草不一致。

表2 冬蟲夏草紅外圖譜原圖相似度結果

注：CSC-1～30為冬蟲夏草繁育品，CSN-1～21為冬蟲夏草野生品，a～d為偽蟲草。

注：A.紅外圖譜，B.一階導數圖譜，C.二階導數圖譜。圖1 冬蟲夏草野生品、繁育品和偽蟲草的紅外指紋圖譜

4 結論

本實驗建立的冬蟲夏草紅外指紋圖譜檢測方法具有良好的專屬性、重復性、穩(wěn)定性和精密度；冬蟲夏草樣品在3000～2800 cm-1、1800～1000 cm-1、1000～800 cm-1峰型與偽蟲草譜圖差異較為顯著，可用于冬蟲夏草紅外指紋圖譜檢測。30批冬蟲夏草繁育品和21批野生品的紅外指紋圖譜具有較好的一致性，鑒定結果與本研究組已報道的HPLC、NMR等[11-13]方法的鑒定結果一致。

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ConsistencyEvaluationofIRFingerprintsofCultivatedCordycepsandNaturalCordyceps

ZHAN Zeping1，LIHua2，HUANGLiang1，LIWenqing1，XINLibo1，LIWenjia1，QIANZhengming1，LIUGuozhu1*，DENGBingchu1

(1.SunshineLakePharmaCo.，LTD，Guangdong，Dongguan523808，China；2.GuangdongInstitutionforFoodandDrugControl，Guangzhou510180，China)

Objective：In this research，an IR fingerprint analysis method was developed for identifying Cordyceps.Methods：Natural Cordyceps，cultivated Cordyceps and pseudo Cordyceps(cicada fungus，Cordyceps flower，hirsutella mycelium powder and paecilomyces hepiali mycelium powder)were identified respectively by this method.The conformity of the samples were estimated according to the similarity of IR average spectra，first-order derivative spectra and second derivative spectra.Results：The IR fingerprint had good uniformity between 30 batches of cultivated Cordyceps and natural samples in the range of 3000-2800 cm-1，1800-1000 cm-1and 1000-800 cm-1，with similarity not less than 0.90.However，the pseudo Cordyceps obtained inconsistent results，with similarity less than 0.90.Conclusion：The method is proved specific，sensitive and accurate，which is suitable for identification of Cordyceps.

Cordyceps；IR fingerprint；conformity analysis

2015-09-25)

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201507002)；創(chuàng)新藥物研發(fā)與產業(yè)化團隊(201001Y0104742262)

*

劉國柱，博士，研究方向：藥物分析；Tel：(0769)88615888，E-mail：LiuGuozhu@hecpharm.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.012