木通與川木通及關(guān)木通的快速PCR鑒別△

崔占虎，袁媛，胡峻

(1.南陽市第一人民醫(yī)院，河南 南陽 473010；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地 中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700)

木通與川木通及關(guān)木通的快速PCR鑒別△

崔占虎1，袁媛2*，胡峻2

(1.南陽市第一人民醫(yī)院，河南 南陽 473010；2.道地藥材國家重點實驗室培育基地 中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心，北京 100700)

目的：建立一種準確、快速、高效鑒別木通、川木通及關(guān)木通的分子鑒別方法。方法：采集不同產(chǎn)地的木通、川木通及關(guān)木通基原植物，所有樣品進行總DNA的提取，通過對木通、川木通及關(guān)木通樣品trnL-trnF片段進行擴增、測序，進行同源比對后根據(jù)其變異位點設(shè)計特異性鑒別引物，采用2步法進行PCR擴增，從而對木通、川木通及關(guān)木通進行鑒別。結(jié)果：通過對影響PCR反應(yīng)時間的退火溫度、變性溫度、退火時間、變性時間、循環(huán)次數(shù)等因素進行優(yōu)化，并對不同型號PCR儀進行考察，分別獲得木通、川木通及關(guān)木通快速PCR反應(yīng)程序。在PCR產(chǎn)物中加入SYBR Green I染料，正品顯示出明亮綠色熒光，而混淆品不顯示熒光。結(jié)論：快速PCR方法可以簡單快速鑒別木通、川木通及關(guān)木通，為實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提供技術(shù)支撐。

快速PCR；木通；分子鑒定；熒光檢測

木通為木通科植物木通Akebiaquinata(Thunb.) Decne、三葉木通A.trifoliata(Thunb.) Koidz.或白木通A.trifoliata(Thunb.) Koidz.var.australis(Diels) Rehd.的干燥藤莖。有利尿通淋、清心除煩、通經(jīng)下乳的功能，可用于淋證、水腫、心煩尿赤、口舌生瘡、經(jīng)閉乳少、濕熱痹痛[1]。

據(jù)文獻考證，古代所用木通正品是木通科的木通。清代《植物名實圖考》提出毛茛科木通，即川木通，來源包括毛茛科植物小木通ClematisarmandiiFranch.或繡球藤ClematisMontanaBuch.-Ham.的干燥藤莖。然而歷代中本草中未見有“關(guān)木通”的記載。直到1954年，任仁安等通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國商品木通主要為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴AristolochiamamshuriensisKom.的干燥藤莖[2]。其后，《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)1963年版收錄了關(guān)木通，其基原為馬兜鈴科植物東北馬兜鈴；同時分別收錄了木通、川木通。但因藥源短缺，自1977年版至2000年版《中國藥典》則將木通刪去，僅收錄了川木通和關(guān)木通，而醫(yī)師處方和藥物制劑的實用名則仍為木通，同名異物現(xiàn)象甚為嚴重。在中醫(yī)藥科技工作者的努力下，對木通類商品進行了系統(tǒng)的研究工作，《中國藥典》2005年版收載木通科植物木通、三葉木通或白木通的藤莖為木通。由于歷史變遷、本草記述中異物同名、同名異物和地區(qū)習慣用藥等原因，商品木通存在嚴重的品種混亂情況。2005年版《中國藥典》將木通正名后，商品木通的市場大有好轉(zhuǎn)，但部分地區(qū)仍存在混淆使用的情況，必須引起充分的注意[2]。3種不同來源的商品多加工為薄片，外觀上區(qū)別不大，很容易混淆不清，因此，建立一種鑒別木通、川木通和關(guān)木通的方法至關(guān)重要。

近年來，不同研究學者分別采用高效液相色譜法、近紅外光譜法、紫外光譜法以及DNA條形碼方法等對3種不同來源的木通進行鑒定研究[3-6]，但這些方法操作比較繁瑣，用時較長，不利于推廣，難以適應(yīng)當前中藥分子鑒定技術(shù)現(xiàn)場運用的需要[7]。PCR作為分子生物學中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，隨著研究和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷增長，存在著相當巨大的改進空間。自Millus等[8]發(fā)明PCR技術(shù)以來，一些學者不斷調(diào)整PCR條件對PCR技術(shù)進行改良，并提出了快速PCR概念[9-11]。

快速、準確、高通量鑒別是現(xiàn)代中藥分子鑒別的核心需要，目前快速PCR方法已成功用于部分中藥材鑒定方面的研究，如金銀花、蛇類藥材等中藥材的真?zhèn)舞b別[12-13]，本文基于位點特異性PCR技術(shù)建立了木通、川木通及關(guān)木通快速PCR鑒別方法，并引入了熒光染料法對真?zhèn)舞b別結(jié)果進行檢測，可明顯縮短反應(yīng)時間，提高鑒別效率，為實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料﹑儀器與試劑

表1 樣品材料信息表

1.1.2 儀器 GeneAmp 9700型PCR擴增儀(Applied Biosystem公司)；TC-512梯度PCR儀(TECHNE公司)；VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀(Applied Biosystems公司)；5810 R 型高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；VORTEX-2 GENIE漩渦震蕩儀(Scientific industries 公司)；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠)；HE99X-15-1.5型電泳槽(Hoefer公司)；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)(GENE公司)；ZF-7A型手持式紫外燈(上海谷村電子光學儀器廠)。

1.1.3 試劑 瓊脂糖(Promega公司)；溴化乙啶(Fluka公司)；EXTaqDNA聚合酶、SpeedStar HSTaqDNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；10 000× SYBR Green I(Invitrogen公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2基因組總DNA的提取及PCR擴增、測序 取適量的樣品(約0.03 g)，研磨成細粉后，采用改良的CTAB法提取總DNA，獲得的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＿x擇通用引物trnL-trnF對木通、川木通和關(guān)木通樣品進行擴增，反應(yīng)程序見表2。反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括10×buffer緩沖液2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL，EXTaq0.2 μL，DNA 0.5 μL，滅菌蒸餾水14.7 μL。PCR反應(yīng)條件見表2。反應(yīng)結(jié)束后在PCR體系中加入5 μL 6×loading buffer，混勻后于EB染色的1.5 %濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。選擇陽性PCR產(chǎn)物樣品進行雙向測序。

1.3 基于葉綠體序列的木通、川木通及關(guān)木通鑒別引物設(shè)計

將測序所得序列去除引物序列，去除引物后的序列使用BioEdit分析軟件進行分析、校對處理后，找出具有穩(wěn)定差異的變異位點，進而篩選出木通、川木通及關(guān)木通的特有變異位點，根據(jù)Newton等建立的擴增阻滯突變系統(tǒng)原理[14]，主要是由于DNA聚合酶缺乏3′-5′外切酶活性，引物的3′末端堿基不能與靶DNA正確互補配對，那么靶DNA就不能被有效地擴增，因此，依據(jù)此原理及設(shè)計引物原則，利用Primer premier 5 軟件根據(jù)每種藥材特有的變異位點設(shè)計3對位點特異PCR引物，設(shè)計的3對特異引物MT-F1/R1、CMT-F1/R1、GMT-F1/R1擴增后片段大小分別為456、479、463 bp，引物序列見表2。

1.4 PCR擴增條件的確定

取樣品DNA用于確定快速PCR反應(yīng)條件。20 μL PCR反應(yīng)體系，2.0 μL 10×buffer緩沖液，1.6 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，0.5 μL上游及下游引物(5 μmmol·L-1)，0.5 μL鑒別引物F2(5 μmol·L-1)，0.2 μL SpeedStar HSTaqDNA聚合酶(Takara公司)，0.5 μL模板DNA，14.7 μL無菌雙蒸水。PCR反應(yīng)在GeneAmp 9700型PCR擴增儀上進行，初始反應(yīng)程序見表2。反應(yīng)結(jié)束后取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，加入2 μL 6× Loading buffer (Takara 公司) 混勻后于EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

表2 實驗中的引物及反應(yīng)條件

1.5 條件優(yōu)化

在學科促進方面，他舉例，比如甲狀腺手術(shù)，由于初診等因素的影響，這項手術(shù)在普外科、耳鼻咽喉頭頸外科、甲狀腺?？凭虚_展，而病種數(shù)據(jù)分析則能從效率、質(zhì)量、效益等方面直觀反映出各科開展情況的差異，“如果某一個科室開展這項手術(shù)，各方面都不占優(yōu)勢，那理應(yīng)考慮轉(zhuǎn)攻別的方面，夯實學科優(yōu)勢?！狈鈬硎?，正是通過這樣的精細化分析，實現(xiàn)病種結(jié)構(gòu)、成本結(jié)構(gòu)的“騰籠換鳥”，真正凸顯三甲綜合醫(yī)院的功能定位，將常見病、多發(fā)病分流到基層醫(yī)療機構(gòu)。

分別利用木通、川木通及關(guān)木通特異性鑒別引物對 MT-F1/R1、CMT-F1/R1、GMT-F1/R1進行PCR反應(yīng)，并考察：①退火溫度：52、54、56、58、60 ℃；②PCR循環(huán)數(shù)：30、28、26、24、22個循環(huán)；③變性溫度：94、92、90、88 ℃；④變性和退火時間：20、10、5、3、1 s；⑤不同PCR儀：9700型PCR儀(ABI公司)，VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀(Applied Biosystems公司)，TC-512型PCR儀(TECHNE公司)。

1.6 PCR產(chǎn)物檢測

在PCR擴增產(chǎn)物中加入1 μL 100× SYBR Green I于365 nm紫外波長下檢測熒光，出現(xiàn)綠色熒光則表明存在陽性擴增產(chǎn)物。

2 結(jié)果分析

2.1 鑒別引物設(shè)計及驗證

選擇通用引物trnL-trnF對木通、川木通及關(guān)木通樣品進行PCR擴增，然后通過Clustal W軟件進行序列比對，根據(jù)其變異區(qū)設(shè)計3對特異引物。利用位點特異性PCR方法對特異引物進行驗證，PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過利用木通位點特異PCR引物對木通、川木通及關(guān)木通進行擴增，木通可以擴增出一條帶，而川木通及關(guān)木通則擴增不出條帶。使用川木通位點特異PCR引物，川木通可以擴增出一條帶，而木通及關(guān)木通則擴增不出條帶。使用關(guān)木通位點特異PCR引物，關(guān)木通可以擴增出一條帶，而木通及川木通則擴增不出條帶。結(jié)果表明設(shè)計的3對特異引物可以用作木通、川木通及關(guān)木通之間的鑒別引物。

2.2 快速PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

由于Yap等研究表明，低溫預(yù)變性(92 ℃ 1 min)即可實現(xiàn)PCR有效擴增[9]，且本課題組前期證實94 ℃預(yù)變性1 min可以實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的有效擴增[12-13]，因此本文把PCR初始程序設(shè)計為94 ℃預(yù)變性1 min，從94 ℃變性開始，兩步法，30個循環(huán)，并開展PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上進一步依次對PCR反應(yīng)過程中退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)、變性溫度、變性和退火時間5個因素進行優(yōu)化，并分析了不同的PCR儀對改良后PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。

2.2.1 木通特異引物快速PCR條件優(yōu)化 凝膠電泳結(jié)果表明，對于木通特異引物，退火溫度分別為54、56、58、60 ℃時，木通樣品均能夠擴增出目的條帶，但由于60 ℃時條帶較弱，因此選擇58 ℃為最適退火溫度；退火最適時間為10 s。大于26個循環(huán)時，木通樣品均出現(xiàn)明顯條帶，但26個循環(huán)時條帶較弱，因此選擇28個循環(huán)為最適循環(huán)數(shù)。當變性溫度高于88 ℃時，木通能夠擴增出明顯條帶，而川木通和關(guān)木通則均不能擴增出條帶，因此選擇88 ℃為最適變性溫度。變性時間在5 s和3 s時木通樣品均有條帶，3 s時條帶亮度明顯減弱，因此選擇5 s為最適變性時間(見表3)。

2.2.2 川木通特異引物快速PCR條件優(yōu)化 對于川木通特異引物，退火溫度分別為54、56、58、60 ℃時，川木通樣品均能夠擴增出目的條帶，但由于60 ℃時條帶較弱，因此選擇了58 ℃為最適退火溫度；最適退火時間為5 s。大于24個循環(huán)時，川木通樣品均出現(xiàn)明顯條帶，但24個循環(huán)時條帶較弱，因此選擇26個循環(huán)為最適循環(huán)數(shù)。當變性溫度高于88 ℃時，川木通能夠擴增出明顯條帶，而木通和關(guān)木通則均不能擴增出條帶，因此選擇88 ℃為最適變性溫度。變性時間在5 s和3 s時川木通樣品均有條帶，3 s時條帶亮度明顯減弱，因此選擇5 s為最適變性時間(見表3)。

2.2.3 關(guān)木通特異引物快速PCR條件優(yōu)化 對于關(guān)木通特異引物，退火溫度分別為54、56、58、60 ℃時，關(guān)木通樣品均能夠擴增出目的條帶，但由于58 ℃時條帶最亮，因此選擇了58 ℃為最適退火溫度；最適退火時間為10 s。大于26個循環(huán)時，關(guān)木通樣品均能夠擴增出條帶，但26個循環(huán)時關(guān)木通條帶較弱，因此選擇28個循環(huán)為最適循環(huán)數(shù)。當變性溫度高于88 ℃時，關(guān)木通能夠擴增出明顯條帶，而木通和川木通則均不能擴增出條帶，因此選擇88 ℃為最適變性溫度。變性時間在5 s和3 s時關(guān)木通樣品均有條帶，3 s時條帶亮度明顯減弱，因此選擇5 s為最適變性時間(見表3)。

綜合以上優(yōu)化結(jié)果可以得出，木通、川木通及關(guān)木通快速PCR反應(yīng)的反應(yīng)參數(shù)基本相同，因此，為了能夠在同一時間、同一臺PCR儀中完成PCR擴增過程，達到快速檢測的目的，本實驗最終確定的木通、川木通及關(guān)木通快速PCR反應(yīng)的反應(yīng)參數(shù)均為88 ℃預(yù)變性1 min后，88 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，28個循環(huán)，并對該反應(yīng)條件使用不同PCR儀對木通、川木通及關(guān)木通樣品進行快速PCR擴增，結(jié)果表明：最終優(yōu)化得到的木通、川木通及關(guān)木通快速PCR反應(yīng)反應(yīng)參數(shù)使用GeneAmp 9700型PCR擴增儀、VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀、TC-512梯度PCR儀擴增、電泳檢測后均可獲得樣品的特異性目的條帶，其中木通特異性引物PCR擴增結(jié)果見圖1A，川木通特異性引物PCR擴增結(jié)果見圖1B，關(guān)木通特異性引物PCR擴增結(jié)果見圖1C。

2.3 快速PCR反應(yīng)熒光檢測

分別選擇優(yōu)化的木通、川木通及關(guān)木通快速PCR反應(yīng)參數(shù)，在確保3種藥材的所有樣品DNA均無降解情況下，對3種藥材進行快速PCR擴增，在擴增產(chǎn)物中加入1 μL 100× SYBR Green I，在365 nm紫外波長下進行熒光檢測。結(jié)果表明，使用木通特異鑒別引物擴增，所有木通樣品顯示出明亮綠色熒光，而川木通、關(guān)木通均不發(fā)出熒光；使用川木通特異鑒別引物擴增，川木通樣品顯示出明亮綠色熒光，而木通、關(guān)木通均不發(fā)出熒光，同樣，使用關(guān)木通特異鑒別引物擴增，關(guān)木通樣品顯示出明亮綠色熒光，而木通、川木通均不發(fā)出熒光，見圖2。

表3 PCR條件優(yōu)化

注：+表示亮帶，△表示暗帶，-表示無帶。

注：A.木通快速PCR產(chǎn)物凝膠電泳及熒光檢測結(jié)果，M.DL 2000 Marker，1.陰性對照，2.三葉木通(湖南衡東)，3.三葉木通(湖南臨澧)，4.三葉木通(重慶梁平)，5.三葉木通(甘肅徽縣)，6.木通(重慶萬州)，7.木通(安徽含山)，8.木通(重慶彭水)，9.木通(安徽鳳陽)，10.木通(安徽梅山)，11.白木通(重慶黔江)，12～14.白木通(湖南株洲)，15～18.白木通(湖南慈利)；B.川木通快速PCR產(chǎn)物凝膠電泳及熒光檢測結(jié)果，M.DL 2000 Marker，1.陰性對照，2.川木通(重慶綦江)，3.川木通(重慶南川)，4.川木通(重慶江津)，5.川木通(重慶石柱)，6.川木通(重慶渾平)，7.川木通(重慶黔江區(qū))；C.關(guān)木通快速PCR產(chǎn)物凝膠電泳及熒光檢測結(jié)果，M.DL 2000 Marker，1.陰性對照，2～6.東北馬兜鈴(吉林撫松)，7～11.東北馬兜鈴(吉林靖宇)。圖1 木通、川木通及關(guān)木通快速PCR產(chǎn)物凝膠電泳及熒光檢測結(jié)果

注：1.木通，2.三葉木通，3.白木通，4.川木通，5.東北馬兜鈴，6.陰性對照。圖2 木通、川木通及關(guān)木通快速PCR熒光檢測結(jié)果

3 討論

本實驗主要針對木通、川木通及關(guān)木通3種藥材，建立快速PCR鑒別方法，經(jīng)DNA提取、PCR擴增、熒光檢測3個步驟，在同一臺PCR儀內(nèi)可同一時間完成3種藥材真實性快速鑒別，有利于實現(xiàn)中藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用。針對木通、川木通及關(guān)木通三者之間的快速鑒別，本文建立的位點特異性PCR方法，具有易于檢測且快速的特點，相比劉美子等使用的DNA條形碼鑒定方法而言[4]，該方法無需測序，通過凝膠電泳膠圖可直接、快速地反應(yīng)出檢測結(jié)果。而使用熒光染色快速檢測技術(shù)，則無需凝膠電泳檢測，通過加入熒光染料在紫外燈下觀察是否有熒光便可快速鑒別藥材真?zhèn)?，因此，將傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測結(jié)果方法改為熒光染料快速染色的方法，可最終縮短檢測時間，提高檢測效率[15]，該鑒別方法對于木通、川木通及關(guān)木通3種藥材之間的鑒別顯示出較大的優(yōu)勢。

經(jīng)典PCR鑒定技術(shù)雖然擁有準確、專屬性強、重現(xiàn)性好等特點，但由于其自身操作相對復(fù)雜、單次反應(yīng)耗時較長，難以用于中藥材現(xiàn)場鑒別。常規(guī)PCR反應(yīng)時間大約為2～3 h，而本文采用的2步法快速PCR技術(shù)，即預(yù)變性與變性同一溫度，退火與延伸同一溫度，因此要求特異引物的Tm值盡可能接近常規(guī)PCR延伸溫度72 ℃，2步反應(yīng)的溫度值相差越小，則PCR反應(yīng)越短，檢測時間越短。同時，可在確保PCR反應(yīng)靈敏度和特異性的前提下，盡可能大地縮短PCR過程中變性、退火和延伸時間，提高檢測效率。目前快速PCR方法已在一些臨床檢驗和司法檢測中得到廣泛應(yīng)用[16-21]。因此，快速PCR技術(shù)可以通過對經(jīng)典PCR反應(yīng)進行條件優(yōu)化，結(jié)合熒光檢測技術(shù)，操作簡單、檢測結(jié)果準確，在中藥材的鑒定中具有很強優(yōu)勢，也適用于中藥材快速檢測試劑盒的開發(fā)，有助于實現(xiàn)中藥材現(xiàn)場準確、快速鑒定。

然而，傳統(tǒng)鑒別藥材真?zhèn)位蛸|(zhì)量評價的檢測方法大多較為單一。近來，Wu等研究通過將DNA 條形碼、實時熒光定量PCR及UHPLC-HR-MS 3種檢測方法相結(jié)合，分析了來自46個物種的158份馬兜鈴科樣品和來自33個物種的131份容易與馬兜鈴科物種混淆的樣品，證實來自馬兜鈴科的大多數(shù)樣本中都含有有毒的馬兜鈴酸[22]。此次研究者提出的整合鑒定系統(tǒng)可以為中草藥產(chǎn)品提供高效可靠的檢測系統(tǒng)，值得今后中藥鑒定學者們的借鑒。同時，在此基礎(chǔ)上，如何達到中藥材的現(xiàn)場準確、快速鑒定，今后仍有待進一步研究。

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AuthenticationofMutong，Chuan-MutongandGuan-MutongbyRapidPCR

CUI Zhanhu1，YUANYuan2*，HUJun2

(1.NanyangFirstPeople'sHospital，Nanyang473010，China；2.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsBreedingBase，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To establish an accurate，rapid and efficient method for authenticating Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong by using PCR amplification of specific alleles.Methods：The samples of Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong were collected.The total DNA of the samples has been extracted，andtrnL-trnFsequence from Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong was amplified by PCR and sequenced directionally.These sequences were aligned by using Clustal W.specific primers were designed and amplified by two-steps PCR amplification method.Results：The rapid PCR methods for authenticating Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong were established by optimizing the denatured and annealing temperature，cycle numbers，and etc.When 100×SYBR Green I was added in the PCR product，strong green fluorescence was visualized under 365 nm UV lamp whereas adulterants without.Conclusion：The results indicated that the rapid PCR method can identify Mutong，Chuan-Mutong and Guan-Mutong rapidly.This study provides the technical support for authentication of Chinese medicinal materials.

Rapid PCR；Akebiae Caulis；molecular authentication；fluorescence

2016-05-23)

中醫(yī)藥行業(yè)專項(201407003)

*

袁媛，副研究員，研究方向：中藥功能基因組及中藥分子鑒定；Tel：(010)64014411-2847，E-mail：y_yuan0732@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.006