響應(yīng)曲面法優(yōu)化金花葵種子中黃酮的提取工藝△

王璐珊，吳士龍，王淼，李先哲，王達(dá)，吳兆華，高慧媛*

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 教育部基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化金花葵種子中黃酮的提取工藝△

王璐珊1，吳士龍1，王淼2，李先哲1，王達(dá)1，吳兆華2，高慧媛1*

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 教育部基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng)110016；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江157011)

目的：優(yōu)化金花葵種子中黃酮的提取工藝。方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、提取時(shí)間及料液比為自變量，采用響應(yīng)曲面法研究各因素及其交互作用對(duì)金花葵種子中黃酮提取的影響。模擬得出了黃酮提取的回歸方程，確定黃酮提取的最佳條件。結(jié)果：優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度60%；提取溫度為80℃；提取時(shí)間為60min；液料比為1∶39；提取1次。結(jié)論：該提取工藝穩(wěn)定、合理、預(yù)測(cè)性良好。

金花葵；黃酮；響應(yīng)曲面；乙醇提??；紫外分光光度法

金花葵又名菜芙蓉，也稱野芙蓉，為一年生草本錦葵科秋葵屬植物。金花葵的花、葉、種子藥食兼用，營(yíng)養(yǎng)及開(kāi)發(fā)價(jià)值較高[1]。金花葵全株總黃酮含量較高，是其主要的生物活性物質(zhì)[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，該植物的總黃酮有抗炎鎮(zhèn)痛、改善心腦血管微循環(huán)及抗疲勞、治療口腔潰瘍、降脂等作用[4-5]。黃酮作為天然植物雌激素，對(duì)于人類的健康有重要作用，如在延長(zhǎng)女性青春期、減輕或避免中老年更年期綜合征等方面有很大的功能，其藥用價(jià)值已被世界各國(guó)醫(yī)藥、食品行業(yè)廣泛重視[6]。金花葵種子除活性黃酮外，還有不飽和脂肪酸、維生素E、多種微量元素等。

1 儀器與材料

1.1儀器

AB135-S型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-S型水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；UV-1700型紫外分光光度計(jì)[島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2試藥

蘆丁對(duì)照品(自制，含量≥98%)；石油醚(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；乙醇(分析醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；超純水；氫氧化鈉、硝酸鋁(天津博迪化工股份有限公司)；亞硝酸鈉(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。

1.3材料

干燥的金花葵種子收于黑龍江省牡丹江市東寧縣金花葵種植園，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)袁久志副教授鑒定為金花葵(Ablemoschusmanihot)的種子，

2 方法

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

供試品、對(duì)照品溶液采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，對(duì)總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，在400～900nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在510nm處有最大吸收，見(jiàn)圖1。

注：A.供試品；B.對(duì)照品。圖1 供試品與對(duì)照品的紫外掃描圖

2.2供試品溶液的制備

精密稱取經(jīng)粉碎、石油醚脫脂(脫脂兩次，每次3min)干燥的金花葵種子1.5g至圓底燒瓶中，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求進(jìn)行水浴回流提取，趁熱抽濾提取液，殘?jiān)?0%乙醇洗滌兩次，合并濾液及洗滌液，減壓濃縮，提取物用60%乙醇溶解并定容至25mL容瓶中，搖勻，制成供試品溶液，備用。

2.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品6mg，置于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.24mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

分別精密量取上述對(duì)照品2、3、5、10mL于25mL容量瓶中，加5%的亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，靜置5min后加10%硝酸鋁1mL，搖勻，靜置5min，加10%氫氧化鈉10mL，加60%乙醇稀釋到刻度，搖勻，靜置15min，以相應(yīng)試劑為空白，在510nm處測(cè)定吸光度[7]。對(duì)吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行分析，得線性回歸方程。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

取同一金花葵種子樣品6份，按2.2項(xiàng)下方法制備，測(cè)定黃酮含量，樣品中黃酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.1mg·g-1，RSD為1.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6精密度試驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液6份，按2.4項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，吸光度值分別為0.288、0.285、0.282、0.286 、0.283、0.287，RSD為0.94%，表明儀器精密度良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取3份已知含量的種子0.7495、0.7504、0.7492g，分別加入蘆丁對(duì)照品2.5mg，按2.2項(xiàng)下方法制備供試液，按2.4項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 金花葵種子的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.8單因素試驗(yàn)

選擇液料比、提取時(shí)間、乙醇濃度、提取次數(shù)、提取溫度這5個(gè)因素作為黃酮提取工藝有影響的參數(shù)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.8.1料液比對(duì)提取率的影響 在提取溫度為80℃、提取時(shí)間為60min、乙醇濃度為60%、提取次數(shù)為1次的條件下，考察料液比對(duì)金花葵種子中黃酮含量的影響，分別選取料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50進(jìn)行提取。

2.8.2提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 在提取溫度為80℃、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%、提取次數(shù)為1次的條件下，為了考察提取時(shí)間對(duì)金花葵種子中黃酮含量的影響，分別選取提取時(shí)間40、60、90、100、120min進(jìn)行提取。

2.8.3乙醇濃度對(duì)提取率的影響 在提取溫度為80℃、提取時(shí)間為60min、料液比為1∶40、提取次數(shù)為1次的條件下，考察乙醇濃度對(duì)金花葵種子中黃酮含量的影響，分別選取50%、60%、70%、80%的乙醇濃度進(jìn)行提取。

2.8.4提取次數(shù)對(duì)提取率的影響 在提取溫度為80℃、提取時(shí)間為60min、料液比為1∶40的條件下，考察提取次數(shù)對(duì)金花葵種子中黃酮含量的影響。

2.8.5提取溫度對(duì)提取率的影響 在提取時(shí)間為60min、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%、提取次數(shù)為1次的條件下，考察提取溫度對(duì)金花葵種子提取物中黃酮含量的影響，分別選取50、60、70、80、90℃進(jìn)行提取。

2.9響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用軟件Design-Expert.8.05b，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)自變量，以金花葵種子中總黃酮含量為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)曲面分析對(duì)金花葵種子中黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[8-10]。

3 結(jié)果與分析

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=12.659X+0.0036(r=0.9993)。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照溶液濃度在0.019～0.096mg·mL-1線性關(guān)系良好。

3.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1料液比對(duì)提取率的影響 隨著料液比的擴(kuò)大，黃酮的含量不斷升高，當(dāng)料液比從1∶20擴(kuò)大至1∶40時(shí)，黃酮的含量增加趨勢(shì)顯著，之后增幅較小。這是由于料液比的增大可以增加物料與溶劑的接觸面積，使黃酮更充分的溶解出來(lái)，但當(dāng)繼續(xù)增加料液比時(shí)，由于黃酮的含量逐漸達(dá)到平衡，此時(shí)黃酮含量增長(zhǎng)緩慢。見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)金花葵種子提取物中黃酮含量的影響

3.2.2提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 隨著時(shí)間的增加黃酮的含量不斷升高，當(dāng)時(shí)間為60min時(shí)黃酮的含量達(dá)到了最大值，隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，黃酮的含量呈下降狀態(tài)。這表明目的產(chǎn)物浸出過(guò)程與時(shí)間密切相關(guān)，時(shí)間過(guò)短產(chǎn)物溶解不充分，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而使含量降低。見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)金花葵種子提取物中黃酮含量的影響

3.2.3乙醇濃度對(duì)提取率的影響 隨著乙醇濃度的增加黃酮的含量不斷升高，當(dāng)濃度達(dá)到60%時(shí)，黃酮的含量達(dá)到了最高值，隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加黃酮的含量又逐漸降低。推測(cè)原因可能是當(dāng)溶質(zhì)達(dá)到一定比例時(shí)，黃酮在乙醇中的溶解達(dá)到平衡，再增加溶質(zhì)的量，就會(huì)增加雜質(zhì)的溶出，使金花葵種子提取物中黃酮的含量下降。見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)金花葵種子提取物中黃酮含量的影響

圖5 提取次數(shù)對(duì)金花葵種子提取物中黃酮含量的影響

3.2.4提取次數(shù)對(duì)提取率的影響 金花葵種子中總黃酮有效成分一次提取就已取得最大提取量，目標(biāo)產(chǎn)物大部分被提出，第二、三次提取無(wú)太大意義。見(jiàn)圖5。3.2.5提取溫度對(duì)提取率的影響 隨著提取溫度的升高，黃酮的含量有增高趨勢(shì)，80℃時(shí)達(dá)到最大，隨著提取溫度的繼續(xù)升高，黃酮的含量呈緩慢下降狀態(tài)。推測(cè)原因是過(guò)高的溫度對(duì)黃酮會(huì)結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞，故而以80℃為最佳提取溫度。見(jiàn)圖6。

圖6 提取溫度對(duì)金花葵種子提取物中黃酮含量的影響

3.3提取工藝的響應(yīng)曲面優(yōu)化

通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述5個(gè)參數(shù)對(duì)金花葵種子中黃酮提取效果均有不同程度的影響，但乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比對(duì)黃酮提取效果影響較大，而提取溫度對(duì)黃酮提取效果影響較小。通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)影響黃酮提取效果較大的3個(gè)因素乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行優(yōu)化，以黃酮含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平的試驗(yàn)方案。

采用Box-BehnkenDesign(BBD)設(shè)計(jì)三因素三水平共17組試驗(yàn)，以黃酮的含量(Y)為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各因素與響應(yīng)值的回歸方程為：Y=0.41-0.032A-0.020B+0.015C+0.045A2+0.035B+0.015C2。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 提取工藝條件BBD方案設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由方差分析可知，該回歸模型P<0.000 1，表明回歸方程模型極其顯著；失擬項(xiàng)P= 0.751 0>0.05，表明失擬不顯著，從而說(shuō)明該模型能夠?qū)鸹N子中黃酮的提取進(jìn)行準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)和分析。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：一次項(xiàng)A(乙醇濃度)、B(提取時(shí)間)和C(料液比)極其顯著；二項(xiàng)式A2、B2和C2極其顯著；交互項(xiàng)BC具有一定的顯著性，AB和AC不顯著。說(shuō)明不同的提取工藝對(duì)金花葵種子中黃酮提取量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

根據(jù)所擬合的回歸方程，作相應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面形狀，分析乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間對(duì)金花葵種子中黃酮含量的影響。見(jiàn)圖7～9。

圖7 提取時(shí)間與料液比的等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖

以上三組圖直觀地反應(yīng)了各因素對(duì)響應(yīng)值的交互影響，乙醇濃度和料液比的相互作用較顯著。等高線的形狀可反應(yīng)出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則相反。

采用Design-Expert.8.05b軟件的響應(yīng)優(yōu)化功能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件：乙醇濃度為60.32%；提取時(shí)間為60.43 min；液料比為1∶39.50，預(yù)測(cè)金花葵種子中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5.5 mg·g-1。

圖8 乙醇濃度和提取時(shí)間的等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖

圖9 料液比與乙醇濃度的等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖

3.4最優(yōu)工藝的優(yōu)化

對(duì)響應(yīng)曲面法所得到的最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)得到的結(jié)果是否真實(shí)可靠，在最佳提取條件下分別提取了3次，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

由表三可知，黃酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.47 mg·g-1，與模型預(yù)測(cè)值5.5 mg·g-1偏差不大，吻合較好，說(shuō)明該預(yù)測(cè)模型能夠可靠的預(yù)測(cè)黃酮的含量 。

4 討論

基于試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert.8.05b，通過(guò)二次回歸設(shè)計(jì)得到了黃酮含量與乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間關(guān)系的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)黃酮含量。利用模型的響應(yīng)面及其等高線，對(duì)影響黃酮提取量的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討，得到最優(yōu)工藝：乙醇濃度為60%；提取溫度為80℃；提取時(shí)間為60min；料液比為1∶39；提取次數(shù)為1次。在最優(yōu)提取工藝的條件下，金花葵種子提取物中黃酮含量分別為5.5mg·g-1。因此，利用響應(yīng)曲面分析方法對(duì)金花葵種子中黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效減少工藝操作的盲目性，從而為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)，為金花葵的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

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OptimizationofExtractionParametersofFlavonoidsfromAblemoschusmanihotUsingResponseSurfaceMethodology

WANGLushan1，WUShilong1，WANGMiao2，LIXianzhe1，WANGDa1，WUZhaohua2，GAOHuiyuan1*

(1.KeyLaboratoryofStructure-BasedDrugDesign&DiscoveryofMinistryofEducation，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China；2.DepartmentofPharmacology，MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China)

Objective：To optimize the process of extracting flavonoids from the seeds ofAblemoschusmanihot.Methods：Ethanol concentration，extraction time and liquid ratio were selected as independent variables of response surface methodology to study the effects of various factors and their interactions on extraction of flavonoids from the seeds ofA.manihot.The extraction regression equation for flavonoids was obtained by simulation and the optimum extraction conditions of flavonoids were determined.Results：The optimal extraction parameters were as follows：ethanol concentration60%,extraction temperature80℃,extraction time60min，liquid ratio1∶39.Conclusion：The extraction technology is reliable，reasonable and highly predictive．

Ablemoschusmanihot;flavonoid;response surface;alcohol extracting;ultraviolet spectroscopy

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.023

2015-09-22)

沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥物化學(xué)學(xué)科建設(shè)研究資助計(jì)劃，校級(jí)優(yōu)秀中青年教師資助計(jì)劃A類(2015013)

*

高慧媛，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥、天然藥物活性成分研究；Tel：(024)23986481，E-mail：sypugaohy@163.com