全蝎三種產(chǎn)地加工方法的對(duì)比研究△

孫靜，王集會(huì)

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

全蝎三種產(chǎn)地加工方法的對(duì)比研究△

孫靜1，王集會(huì)2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南250355)

目的：比較三種產(chǎn)地加工全蝎粉的含水量、含鹽量、醇提取物含量、蛋白質(zhì)含量、平衡吸濕量以及?；撬岷康牟煌?，找出最適合的產(chǎn)地加工方法。方法：用快速水分測(cè)定儀測(cè)定含水量；用滴定法測(cè)定全蝎粉含鹽量；用lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；用重量法測(cè)定醇提取物含量；用平衡吸濕曲線測(cè)定臨界相對(duì)溫度(CRH)值；用高效液相外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)?；撬岷俊＝Y(jié)果：比較三種產(chǎn)地加工方法在各種指標(biāo)上的差異性，結(jié)果顯示，常溫風(fēng)干蝎和冷凍干燥蝎之間差異較小，而高溫鹽蝎與前兩者之間有顯著差異。結(jié)論：全蝎冷凍干燥和常溫風(fēng)干可作為產(chǎn)地加工方法。

全蝎粉；產(chǎn)地加工方法；蛋白質(zhì)；臨界相對(duì)溫度；?；撬?/p>

全蝎是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功能?，F(xiàn)代研究表明，鮮全蝎含有蝎毒、?；撬?、軟硬脂酸等蛋白質(zhì)及非蛋白質(zhì)成分[2]。其中蝎毒素為可溶性蛋白，是一種含碳、氫、氧、氮、硫等元素的毒性蛋白。全蝎的醇提取物及蝎毒粗毒是抗癌的主要活性成分[3]，現(xiàn)已成為治療多種疑難病的臨床藥物。

產(chǎn)地加工是影響全蝎藥材質(zhì)量的重要因素。鹽水煮沸風(fēng)干、淡水煮沸風(fēng)干使可溶性蛋白等有效成分喪失，為此我們嘗試將野生活蝎捕捉后快速清水漂洗，除去泥沙，-18 ℃直接冷凍凍死，粉碎，自然風(fēng)干和冷凍干燥。為了考察不同產(chǎn)地加工方法全蝎粉的質(zhì)量，我們選擇含水量、含鹽量、醇提取物含量、蛋白質(zhì)含量、平衡吸濕量以及牛磺酸含量等指標(biāo)進(jìn)行分析研究，擬找出全蝎最佳產(chǎn)地加工方法。

1 材料與儀器

1.1材料

氯化鈉、鉻酸鉀指示劑、硝酸銀溶液、乙醇、硫酸溶液、Lorry試劑、福林酚試劑(國(guó)藥集團(tuán)，分析純)；正己烷、冰醋酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；乙腈(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆V純)；三乙胺(天津市化學(xué)試劑一廠，分析純)；?；撬?中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

野生全蝎購(gòu)自山東臨沂，均為野生活蝎，選擇成年蝎，剔除幼蝎，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系鑒定為鉗蝎科東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch。高溫鹽蝎按《中華人民共和國(guó)藥典》一部制取，自然風(fēng)干粉按參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行加工，凍干粉自制。

1.2儀器

冠亞牌SPF系列快速鹵素水分測(cè)定儀(深圳市冠亞電子科技有限公司)；FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；智能編程層析柜(上海嘉鵬科技有限公司)；SKB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵disb-zc(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；四環(huán)凍干機(jī)LGJ-18A(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)；LC-10ATVP(日本島津公司)；MettlerAE240電子天平(瑞士梅特勒公司)。

2 方法

2.1全蝎凍干粉加工方法

取野生全蝎，清水漂洗，去凈泥沙，凍結(jié)，打碎成漿，預(yù)冷凍。將預(yù)冷凍好的全蝎粉放入冷凍干燥機(jī)中，冷阱溫度為-60℃，真空度為1Pa，物料溫度為25℃，環(huán)境溫度25℃，冷凍干燥24h即得。

2.2含水量的測(cè)定

取3種全蝎粉各0.5g，平鋪于快速水分測(cè)定儀的托盤上，按儀器使用說(shuō)明測(cè)定。

2.3含鹽量的測(cè)定

2.3.1 供試液制備 取3種全蝎粉各5g，精密稱定，放在三角燒杯中，加水90mL，浸泡30min，超聲波震蕩10min，加熱至微沸30min，過(guò)濾，濾液備用。濾渣加水70mL，泡20min，微沸20min，過(guò)濾，濾渣再加水50mL，微沸20min，沖洗濾渣，濾液并用，定容至250mL量瓶中備用[4]。

2.3.2 供試液滴定 分別取3種供試液各25mL，滴加1mL鉻酸鉀指示劑，充分混勻后，用硝酸銀滴定液(0.100 0mol·L-1)滴定至溶液出現(xiàn)磚紅色，用硝酸銀的消耗量推算出氯化鈉含量。

2.4醇提取物的測(cè)定

稱定供試品約2～4g(精密稱定)，置250mL錐形瓶中，精密加20%的乙醇100mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1h。連接回流冷凝管，加熱沸騰，保持微沸1h，冷卻至室溫。取錐形瓶密塞稱質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過(guò)，精密量取濾液25mL，置干燥后的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3h，干燥器中冷卻30min，迅速精密測(cè)定醇提物質(zhì)量[5]。

2.5蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定[6]：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=2.141 3X+0.007 1[Y為吸光度，X為蛋白質(zhì)濃度(mg·mL-1)]，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，線性關(guān)系良好。

取3種粉末各0.5 g于小錐形瓶中，加入20 mL水超聲30 min，分離上清液后，再加入20 mL水超聲30 min，抽濾后，將3種溶液定容到100 mL，離心，取1 mL用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

2.6平衡吸濕量的測(cè)定

取各種樣品供試品分別置于7～9個(gè)不同相對(duì)濕度的密閉干燥器中，相對(duì)濕度為10%～100%，即得各相對(duì)濕度下的平衡吸濕量。以吸濕率為縱坐標(biāo)，相對(duì)濕度為橫坐標(biāo)作圖，得吸濕曲線。將吸濕曲線陡直部分延長(zhǎng)與橫坐標(biāo)相交，即為樣品CRH。

2.7?；撬岷繙y(cè)定

2.7.1 衍生化試劑制備 精密量取0.3mLPITC，置于25mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，濃度為0.1mol·L-1，搖勻，4 ℃保存，作為PITC的乙腈溶液；精密量取14mL三乙胺，置于100mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，濃度為1mol·L-1，搖勻，作為三乙胺的乙腈溶液[7]。

2.7.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取?；撬釋?duì)照品10.43mg，用蒸餾水溶解并定容至25mL，制成質(zhì)量濃度為0.417 7mg·mL-1的對(duì)照品溶液A。

2.7.3 樣品溶液的制備 精密稱取3種全蝎粉末各0.5g，按最佳超聲提取工藝提取，定容至100mL。

2.7.4 衍生化步驟 精密吸取待分析溶液5mL于25mL棕色量瓶中，精密加入0.1mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5mL，1mol·L-1三乙胺的乙腈溶液2.5mL，搖勻，室溫放置1h后，加50%的乙腈稀釋至刻度，搖勻。精密移取5mL，加入5mL正己烷，振搖后放置10min，取下層溶液，用微孔濾膜(0.45μm)過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.7.5 色譜條件AgilentZORBAXSB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)以0.07mol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液-2.5%乙腈(pH=6.5)為流動(dòng)相A，以乙腈-甲醇-水(40∶15∶45)為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫：0～15min96.5%→89%A，15～30min89%→0%A，30～45min0%A；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；流速為1.0mL·min-1；進(jìn)樣量為5μL。用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定?；撬岷?。

2.7.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.417 7mg·mL-1)，用水稀釋成6個(gè)不同濃度的對(duì)照品稀釋液，按上述方法進(jìn)行衍生化，并按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以牛磺酸對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X，峰面積值為縱坐標(biāo)Y，以最小二乘法計(jì)算回歸方程。

2.7.7 精密度試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液進(jìn)行衍生化，并測(cè)定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣5次。

2.7.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取3種樣品各3份，精密稱定，按最佳超聲提取工藝提取并進(jìn)行衍生化，按上述色譜條件測(cè)峰面積，計(jì)算樣品中?；撬崞骄?。

2.7.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知?；撬岷康臉悠?份，每份0.104 9 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入?；撬釋?duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.412 8 mg·mL-1)1.0 mL，水19 mL，密塞，稱定質(zhì)量。按最佳超聲工藝超聲處理，制備樣品溶液，進(jìn)行色譜分析，計(jì)算回收率。

3 結(jié)果

3.1含鹽量、含水量、醇溶物含量及蛋白質(zhì)含量

見(jiàn)表1。

表1 3種全蝎粉含鹽量、含水量、醇溶物含量及CRH數(shù)值

注：*、**表示單因素方差分析各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。

3.2三種全蝎粉的CRH

見(jiàn)圖1。

注：A.高溫鹽蝎；B.常溫風(fēng)干蝎；C.冷凍干燥蝎。圖1 3種全蝎粉相對(duì)濕度

3.3高效液相色譜圖

見(jiàn)圖2。

注：A.?；撬針?biāo)準(zhǔn)品；B.冷凍干燥蝎；C.高溫鹽蝎；D.常溫風(fēng)干蝎；E.陰性對(duì)照。圖2 3種全蝎粉、?；撬針?biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照品的牛磺酸高效相色譜

3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=1273400X+62009，r=0.9991。在0.08354～0.4177μg進(jìn)樣量與峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。

3.5精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品5份，與試驗(yàn)組用相同衍生法處理后，用高效液相法測(cè)定牛磺酸峰面積，峰面積平均值為1387200.093，RSD為1.84%，表明本方法精密度良好。

3.6加樣回收率試驗(yàn)

見(jiàn)表2。

表2 3種全蝎粉的加樣回收率

3.7三種樣品牛酸含量

見(jiàn)表3。

表3 3種全蝎粉的磺酸含量

3.8重復(fù)性試驗(yàn)

稱取全蝎粉樣品3份，精密稱定，按最佳超聲提取工藝提取并進(jìn)行衍生化，按上述色譜條件測(cè)峰面積，計(jì)算出樣品中?；撬崞骄繛?21.9mg·g-1，經(jīng)計(jì)算RSD為3.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

4 討論

4.1含鹽量

高溫鹽蝎的含鹽量是其他兩種加工方法的20倍，據(jù)報(bào)道有些品種全蝎藥材的含鹽量可達(dá)到100%～300%，而目前《中華人民共和國(guó)藥典》2010版也未對(duì)全蝎藥材的含鹽量作出明確的限定。含鹽量過(guò)高使全蝎藥材的實(shí)際用藥量下降，既不利于準(zhǔn)確用藥，也不利于判斷藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。

4.2醇提取物含量

實(shí)驗(yàn)中用20%的乙醇做溶劑，提取出來(lái)的物質(zhì)主要是水溶性的成分。高溫鹽蝎中含有大量的鹽，所以其醇提取物含量較高，可能是鹽的因素。

4.3蛋白質(zhì)含量

高溫鹽蝎加工時(shí)會(huì)使蛋白質(zhì)流失，使蝎子粉中有效成分降低。

4.4CRH

全蝎中既有水不溶性的動(dòng)物纖維,又有水溶性的蛋白質(zhì)、酸性黏多糖等成分，因此為兩性混合物。高溫鹽蝎由于含有大量的鹽分，CRH值較小，大約在50%左右。冷凍干燥蝎由于干燥方式的原因，藥材的形態(tài)較疏松，水分已進(jìn)入藥粉內(nèi)部，所以也易吸潮。自然風(fēng)干的全蝎粉較密實(shí)，較不易吸濕，所以，根據(jù)三者的CRH，高溫鹽蝎和冷凍干燥蝎在儲(chǔ)藏中尤其應(yīng)注意密閉低溫保存。

4.5牛磺酸含量

實(shí)驗(yàn)中的HPLC圖有兩個(gè)較大的峰，一個(gè)是?；撬?，峰在25min左右；另一個(gè)是衍生化試劑PITC的峰，在38min左右。通過(guò)計(jì)算得出，冷凍干燥蝎?；撬岷孔罡撸瑸?11.10mg·g-1，其次為風(fēng)干蝎，含量為82.96mg·g-1，最低為高溫鹽蝎，含量為39.12mg·g-1。這可能是因?yàn)楦邷佧}蝎在產(chǎn)地加工過(guò)程中隨煮沸水的棄去而流失，所以冷凍干燥是最有利于保存?；撬岬闹谱鞴に嚒?/p>

由以上討論可知，沸水煮全蝎并不是最適宜的產(chǎn)地加工方式，將捕捉到的野生全蝎直接凍死后粉碎成粉，冷凍干燥或直接自然風(fēng)干能最大限度地保留全蝎的蛋白質(zhì)和牛磺酸等活性成分，更有利于保護(hù)全蝎的藥用價(jià)值。

[1] 陳秀敏.全蝎不良反應(yīng)分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2003，14(10)：635.

[2] 王燕平，呂欣然.東亞鉗蝎蝎毒分離純化及藥理作用的研究進(jìn)展[J].中草藥，2000，31(1)：59-61.

[3] 張紅梅，劉巖峰，張景海.蝎及蝎毒抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(6)：401.

[4] 王集會(huì)，曲仕明，高世杰.全蝎兩種產(chǎn)地加工方法的對(duì)比研究[J].山東中醫(yī)雜志，2009，28(2):131-132.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[7] 蒲秋易，張一竹，張二云，等.柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定全蝎中游離?；撬岬暮縖J].中國(guó)新藥雜志，2013(02):230-234.

ComparativeStudyofThreeHabitat-processingMethodforButhusmartensiiKarsch

SUNJing1，WANGJihui2*

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineofPharmacy,Jinan250355,China；2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineofexperimentcenter,Jinan250355,China)

Objective：Three habitat-processing method for Buthus martensii Karsch were compared with each other in the aspects of water，salt，protein，taurine concentration，alcohol extracts and CRH.Methods：The water concentration was measured with the rapid moisture check device,the salt with titrametric analysis，the protein with Lowry method，the alcohol extracts’ with gravimetric method，the CRH value with the balance curve line of the moisture absorption，the taurine with external standard one point method and HPLC.Results：By comparing the difference between the various indicators in every index，the lyophilization and the air dry have little difference，but the high temperature has much significance difference.Conclusion：The lyophilization and nature drying are availiable ways of the three habitat-processing methed for B. martensii.

Buthus martensii Karsch；habitat-processing method；protein；CRH； taurine

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.022

2015-04-21)

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計(jì)劃資助項(xiàng)目(201310441026)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013GSF11908)

*

王集會(huì)，副教授，研究方向：蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究;E-mail：wangjihui10@126.com