大鼠血管組織提取物體外控制間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)向內(nèi)皮細(xì)胞的分化研究

梁曉鵬，田力

1.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院組織工程實驗室，遼寧沈陽 110000；2.沈陽醫(yī)學(xué)院臨床教研室，遼寧沈陽 110000

大鼠血管組織提取物體外控制間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)向內(nèi)皮細(xì)胞的分化研究

梁曉鵬1，田力2

1.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院組織工程實驗室，遼寧沈陽 110000；2.沈陽醫(yī)學(xué)院臨床教研室，遼寧沈陽 110000

目的 研究大鼠血管組織提取物于體外誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向內(nèi)皮細(xì)胞的分化能力。方法 2015年6—9月間使用淋巴細(xì)胞專用分離液對15例大鼠MSCs進(jìn)行分離，以貼壁法行培養(yǎng)擴(kuò)容，再采用流式細(xì)胞法檢測MSCs的表層抗原水平，以基礎(chǔ)培養(yǎng)液為實驗A組，以含熱處理的血管組織細(xì)胞提取物的培養(yǎng)液為實驗B組，以含大鼠血管組織細(xì)胞提取物的培養(yǎng)液為實驗C組，以含原代血管內(nèi)皮組織細(xì)胞提取物的培養(yǎng)液作為實驗D組，將第4代MSCs分別加入四組進(jìn)行分化培養(yǎng)，分析對比細(xì)胞的表達(dá)變化，并檢測內(nèi)皮組織細(xì)胞于特異性標(biāo)志物之變化表達(dá)。結(jié)果 實驗C組的MSCs的細(xì)胞形態(tài)未見顯著改變，但細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)可見明顯改變，內(nèi)皮細(xì)胞的特異性基因CD144、CD34、CD31以及eNOS（endothelial nitric oxide synthase）出現(xiàn)高表達(dá)。結(jié)論 血管組織細(xì)胞的提取物中含有能夠誘導(dǎo)大鼠MSCs向內(nèi)皮組織細(xì)胞分化的成份，提示成體細(xì)胞的內(nèi)組成份對于相鄰干細(xì)胞之分化結(jié)果具有至關(guān)重要的控制作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；組織細(xì)胞提取物；血管內(nèi)皮細(xì)胞；分化

髓間充質(zhì)干細(xì)具有低免疫原、高增殖能力及多向分化性的特點而受到廣泛關(guān)注，近些年來國外對于自體的MSCs醫(yī)治心梗與缺血性疾病方面已有深入研究，但國內(nèi)仍處于初級階段[1]。MSCs具備多向分化的隱性能力，于適當(dāng)條件誘導(dǎo)下可分化為同源性胚層間質(zhì)組織細(xì)胞，并可分化為突破胚層的非中胚層間質(zhì)組織細(xì)胞[2]。該研究旨在分析血管組織提取物于體外對于MSCs分化的影響，于2015年6—9月間以15例大鼠作為研究對象進(jìn)行相關(guān)實驗研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將制備的第4代MSCs分別加入4種誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，設(shè)置為4個實驗組，以單純基礎(chǔ)培養(yǎng)液為實驗A組，以血管組織的上清液加熱至沸點15 min后立即以冰浴冷卻加入至培養(yǎng)液中為實驗B組，以血管組織的上清液加入培養(yǎng)液中為實驗C組，以同條件下培養(yǎng)的原代血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液加入培養(yǎng)液中為實驗D組（陽性對照組），各組體積數(shù)均相等；行基因特異性表達(dá)分析。各組均每隔2～3 d更換培養(yǎng)液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)均進(jìn)行7～14 d；待細(xì)胞培養(yǎng)生成單層，細(xì)胞增殖至完全覆蓋瓶底80%時，以0.125%的胰酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。

1.2 材料

選用上海加科出品的SD大鼠、杭州四季青出品的胎牛血清、Hyclone鏈霉素-青霉素雙抗、Amresco蛋白酶抑制劑，Gibco：DMEM培養(yǎng)基含1.0 g/L葡萄糖、淋巴組織細(xì)胞分離溶液、混合性膠原酶與胰蛋白酶，Trizol、Invitrogen-Reagent、Promega-Taq DNA polymerase、BBI-DNA marker、Promega-d NTPs、Invitrogen-M-MLV Reversetranscriptase、瓊脂糖、瓊脂粉、DEPC。

1.3 方法

大鼠MSCs的分離與培養(yǎng)，按SD大鼠體重以50 mg/kg比例給予戊巴比妥鈉（國藥準(zhǔn)字H31021724）腹腔注射麻醉，于無菌條件下剝離出股骨與脛骨，切除兩端干骺端充分顯露出骨髓腔。以10%的胎牛血清、加入雙抗的DMEM 100 U/mL配制為含20%肝素的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液對骨髓腔進(jìn)行反復(fù)沖洗，制備細(xì)胞混懸液，將混懸液滴注于離心管內(nèi)同體積的淋巴組織細(xì)胞分離液的上層，1 500 rpm離心20 min，離心后離心管內(nèi)可見4層物質(zhì)，采集中部交界處的乳白色個體核細(xì)胞層，以基礎(chǔ)培養(yǎng)液定容至6 mL，離心5 min，棄上清液，注入基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制為個體核細(xì)胞的懸液，計數(shù)。將個體核細(xì)胞按1×105cells/mL的密度種植于培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱之中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后將未貼壁的細(xì)胞懸液吸出再次培養(yǎng)，培養(yǎng)基每隔3 d進(jìn)行1次換液，2周后當(dāng)貼壁細(xì)胞計數(shù)達(dá)融合90%程度時以0.125%的胰酶消化，以1∶3進(jìn)行傳代，定期采取處于生長狀態(tài)下的細(xì)胞倒置，使用倒置相差型顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

血管細(xì)胞組織提取物的制備，于無菌環(huán)境下剝離取得大鼠的新鮮血管細(xì)胞組織，使用PBS將新鮮血管細(xì)胞組織反復(fù)沖洗3次，徹底清除表層附著物。將新鮮血管細(xì)胞組織剪碎，置于0.5%的混合性膠原酶中在37℃條件下消化6 h。離心后去上清，以0.25%胰蛋白酶再次消化。離心后采集沉淀細(xì)胞，以1∶100蛋白酶抑制液、含重懸細(xì)胞的細(xì)胞裂解液，超聲裂解細(xì)胞，在4℃下，定容14 000 g離心15 min，離心兩次。收集血管細(xì)胞組織的上清液于無菌條件以0.22 um過濾器進(jìn)行過濾，靜置于4℃的冰箱內(nèi)保存待用。

1.4 鑒定細(xì)胞分化

使用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞表型分析，檢測mRNA水平鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的特異性基因是否可見表達(dá)，據(jù)此判斷MSCs是否朝向血管的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生分化。引物序列為CD31、CD34、CD144、eNOS以及β-actin。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MSCs表型與表層抗原結(jié)果

于倒置相差型顯微鏡下所見，大鼠的MSCs經(jīng)傳代培養(yǎng)后呈現(xiàn)為扁平或者多角形，旺盛生長時可呈現(xiàn)為旋渦狀。細(xì)胞密度升高時胞體形狀變?yōu)榧?xì)長，其形態(tài)與纖維細(xì)胞相似，具體形態(tài)見圖1。

圖1 傳代培養(yǎng)后的大鼠MSCs

圖2 細(xì)胞表層抗原檢測

傳至P4第4代時，以流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表層標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果為MSCs表層抗原細(xì)胞CD90與CD73為陽性，CD34呈陰性表達(dá)。提示P4代的細(xì)胞屬于較為純化的MSC見圖2。

2.2 誘導(dǎo)后分化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)結(jié)果

經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，A、B、C 3組的細(xì)胞表層形態(tài)未見顯著改變，且生長均旺盛，隨著傳代代數(shù)的增加，扁平細(xì)胞可見升高，細(xì)胞呈明顯衰老的狀態(tài)。

2.3 誘導(dǎo)后分化內(nèi)皮細(xì)胞的特征性基因表達(dá)結(jié)果

誘導(dǎo)分化后2周，分別提取4組實驗細(xì)胞的RNA，以RT-PCR對內(nèi)皮細(xì)胞的特征性基因表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果說明加入了血管組織細(xì)胞上清液C組與原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞D組內(nèi)，均可見CD144、CD33、CD31及eNOS一氧化氮合酶的表達(dá)，未添加血管細(xì)胞組織上清液的A組與熱處理的B組內(nèi)則均未見相關(guān)基因的表達(dá)或者表達(dá)量微小，具體情況見圖3。

圖3 誘導(dǎo)后分化內(nèi)皮細(xì)胞的特征性基因表達(dá)結(jié)果

3 討論

MSCs是一組存在于滑膜、骨髓、脂肪等機(jī)體多項間質(zhì)組織中的多功能干細(xì)胞，但通常于骨髓中分離獲得。近年來，組織工程研究成為一項重點項目，間質(zhì)干細(xì)胞成為當(dāng)前最常用的一種種子細(xì)胞。有研究表明，來源于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞MSCs可于局部微環(huán)境的干預(yù)下重新編程，在體外可定向分化成為脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等[3-5]。劉四紅等[6]指出將成骨細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，在促進(jìn)骨形成的同時也能夠促進(jìn)血管的形成。因此體外誘導(dǎo)分化內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的臨床應(yīng)用價值。也提示細(xì)胞的外基質(zhì)部分對于干細(xì)胞的結(jié)局具有關(guān)鍵作用。該次研究于含有內(nèi)皮細(xì)胞提取物的培養(yǎng)誘導(dǎo)溶液中對間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其于培養(yǎng)14 d后出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的特異標(biāo)志物表達(dá)，印證了MSCs分化的方向不但取決于細(xì)胞的外基質(zhì)環(huán)境，并且也可受到環(huán)境與成體細(xì)胞內(nèi)的誘導(dǎo)因子干預(yù)，分離并鑒別這些相關(guān)的誘導(dǎo)因子，對于間質(zhì)干細(xì)胞未來于臨床上應(yīng)用具有不可或缺的意義。

細(xì)胞表層分子是細(xì)胞分化與定型的一種標(biāo)志物。MSCs通常不發(fā)生分化表達(dá)的相關(guān)標(biāo)志有Ⅰ～Ⅲ型膠原、和（或）堿性的磷酸酶等，細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁附著時，細(xì)胞可見 均 一 表 達(dá) 的 有 CD44、CD90、CD73、CD124、CD105、CD120a等多種表層蛋白[7-10]。目前對于MSCs的表層特異標(biāo)志物仍存在 許多不同觀點，認(rèn)識尚未完全明確。本次實驗中選擇CD73與CD90作為MSCs的表層特征分子行細(xì)胞的鑒定。CD144、CD31、CD34及一氧化氮合酶等是血管內(nèi)皮組織細(xì)胞廣泛認(rèn)可的特異標(biāo)志物[11-14]。梁峰等[15]研究結(jié)果表明誘導(dǎo)7 d后可見CD34、CD31、F1K-1以及vWF的陽性表達(dá)。與該次研究結(jié)果相符。該組研究采用胰酶與膠原酶與徹底清除了細(xì)胞的外基質(zhì)相關(guān)成份。而后裂解了內(nèi)皮細(xì)胞組織，充分顯露其內(nèi)容物，使其可與間質(zhì)干細(xì)胞直接結(jié)合，成功的將其誘導(dǎo)分化為能夠發(fā)生血管內(nèi)皮組織細(xì)胞特異標(biāo)志物表達(dá)的細(xì)胞，證實了MSCs具有多向分化的潛能，同時也印證了MSCs的誘導(dǎo)條件與分化機(jī)制十分復(fù)雜，過程中可被諸多因素所左右。在圖3中能夠看出，熱處理后的血管細(xì)胞上清液對MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，可見CD31與CD34有部分表達(dá)，分析其原因可與血管細(xì)胞組織提取物中所含有的非蛋白質(zhì)型誘導(dǎo)因子或蛋白因子的不完全變性，使MSCs發(fā)生部分分化有關(guān)。

綜上所述，以大鼠血管組織提取物在體外可誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞朝向內(nèi)皮細(xì)胞分化，MSCs可于體外培養(yǎng)擴(kuò)增，能夠作為組織工程法建構(gòu)血管的一項種子細(xì)胞，對于未來應(yīng)用于臨床血管相關(guān)疾病或外傷均具有重要意義。

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Study on the Control of the Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Into Endothelial Cells in the Blood Vessel Tissue of Rats

LIANG Xiao-peng1，TIAN Li2
1.Tissue Engineering Laboratory of Ho's Medical College in Liaoning，Shenyang,Liaoning Proivnce,110000 China；2.Department of Clinical Laboratory,Shenyang Medical College，Shenyang,Liaoning Proivnce,110000 China

Objective To study the vascular tissue of rats to extract inducing bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)into endothelial cells differentiation.Methods From June to September 2015 using a separate liquid special for separation of 15 cases of lymphocytes in MSCs rats by adherent culture expansion,then the surface antigen level and flow cytometry was used to detect MSCs,in the basic culture medium as experimental group A,in cultured vascular tissue cell extracts containing heat treatment for the experimental group B in the medium containing vascular tissue,cell extracts of rats as experimental group C,with the medium containing primary vascular endothelial cells extract as experimental group D,the fourth generation of MSCs were added to the four group of differentiation and expression analysis of comparative cell change,and detect the endothelial cells on specific markers the change of expression. Results The cell morphology in experimental group C MSCs no significant changes,but the genes within the cell Expression of visible change obviously,endothelial cell specific gene CD144,CD34,CD31,and eNOS appear high expression.Conclusion Vascular tissue and cell extracts containing can induce rat MSCs to the composition of the endothelial cell differentiation,it was suggested that the somatic components to adjacent stem cell differentiation results have important role in controlling.

Bone marrow mesenchymal stem cells；Mesenchymal stem cells；Cell extracts；Endothelial cell differentiation

R3；R74

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.03.20

2016-07-12；

2016-08-09

梁曉鵬（1978.10-）,男，遼寧沈陽人，碩士，中級工程師,研究方向：干細(xì)胞誘導(dǎo)分化。