大白菜單拷貝序列的長片段PCR體系優(yōu)化

魏利潔,蘇建輝,軒淑欣,王彥華,申書興,趙建軍

(河北農業(yè)大學 園藝學院,河北省蔬菜種質創(chuàng)新與利用重點實驗室,河北 保定　071001)

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大白菜單拷貝序列的長片段PCR體系優(yōu)化

魏利潔,蘇建輝,軒淑欣,王彥華,申書興,趙建軍

(河北農業(yè)大學 園藝學院,河北省蔬菜種質創(chuàng)新與利用重點實驗室,河北 保定071001)

目的序列長片段PCR產物可作為FISH技術的有效探針進行分子細胞遺傳學研究。然而,傳統PCR技術對于5 kb以上的長片段進行有效擴增很難。合適的反應條件及反應體系是進行長片段PCR有效擴增的必要前提。為了獲得目的序列長片段PCR產物以用于FISH研究,根據大白菜A03染色體頂端無重復序列區(qū)段設計了80對長片段PCR引物,從基因組DNA模板質量、dNTPs濃度以及退火溫度和延伸時間方面對PCR技術體系進行了優(yōu)化。試驗證明,選用幼苗嫩葉的基因組DNA和LATaqDNA聚合酶可以提高長片段PCR引物的擴增質量和擴增效率;確定了適合5～15 kb長片段PCR的反應體系為20 μL:50 ng/μL模板DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL正反引物各1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ(含Mg2+) 2 μL,5 U/μL LATaq酶0.2 μL;反應條件為98 ℃變性15 s;58～64 ℃退火10 s,68 ℃延伸5 min,35個循環(huán)；68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。在大白菜基因組中成功獲得了60對5～15 kb的擴增片段。為在大白菜粗線期染色體上開展長片段PCR-FISH技術研究及在近緣種間開展比較染色體涂染揭示進化關系奠定了理論基礎。

大白菜;長片段PCR;體系優(yōu)化;單拷貝序列

染色體涂染(Chromosome painting,CP)是利用染色體或染色體區(qū)段特異性DNA文庫作為探針池在中期染色體或粗線期染色體進行FISH(Fluorescenceinsituhybridization)可視化作圖的技術,在染色體鑒定、結構重排、染色體畸形診斷和物種進化研究中扮演了重要角色[1-3]。隨著分子生物學技術的發(fā)展,人們發(fā)展了多種方法來制備染色體涂染探針,如通過流式細胞分揀或顯微解剖的染色體獲得[4-5]、或平行擴增寡核苷酸探針文庫獲得[6-7]、或篩選無重復序列的毗鄰BAC克隆(BACs)獲得[8-10]。由于高等植物含有較高的重復序列,以流式細胞分揀或顯微解剖獲得的染色體DNA探針沒有取得較好的效果[11-12],而寡核苷酸探針在植物上的應用效果尚有待證實,大量無重復序列BACs的篩選工作量較大。Lou等[13]利用PCR擴增無重復序列的單拷貝基因,以擴增產物構成單拷貝基因池在黃瓜染色體上進行涂染獲得成功。染色體涂染結果表明,2～15 kb的擴增探針可以被成功檢測,擴增片段越長,檢測效率越高。這一結果為已測序植物上如何獲得染色體涂染探針進而開展相關研究提供了參考。

近幾年發(fā)展起來的長片段PCR(Long range PCR,LR-PCR)技術能快速、特異地擴增目的基因或較大的DNA片段,并已用于基因克隆、基因組作圖、DNA測序、連續(xù)重疊區(qū)(Contig)的構建、基因突變分析以及單倍型分析等諸多領域[14-17]。理論上,常規(guī)PCR可以得到5.0 kb以上的PCR產物,但在實際的操作過程中很難穩(wěn)定得到擴增片段,這就給利用單基因拷貝探針進行染色體涂染帶來一定困難。根據不同的試驗需要對PCR方法進行優(yōu)化和改進也正在不斷地發(fā)展,利用擴增長片段的LATaq酶,結合使用GC Buffer I,以及熱啟動PCR技術和兩步法擴增出了大小為16.5 kb的全長稻瘟病抗性基因Pi36[18]。采用巢式PCR或和降落PCR相結合的方法進行了基因FMNL2編碼區(qū)全長及FMNL2-NT、CT的擴增[19]。通過直接測序長片段PCR產物開發(fā)一種新型PKD1基因突變篩查檢測[20]。前人根據不同的試驗需要對長片段PCR方法進行優(yōu)化和改進,表明引物設計、模板質量、DNA聚合酶、dNTP濃度、熱啟動和退火、延伸溫度等因素不同程度的影響和限制著長片段的擴增結果。

為了開展蕓薹屬A、C基因組比較染色體涂染研究,鑒定大白菜—結球甘藍漸滲系中外源片段的滲入情況,本試驗以大白菜自交系85-1基因組DNA為模板,利用根據大白菜A03染色體序列設計的引物進行擴增,通過研究PCR反應體系中模板DNA質量、dNTPs濃度、聚合酶種類和反應程序中退火溫度、延伸溫度對擴增效果的影響,擬建立適合長片段擴增的PCR技術體系,旨在為大白菜染色體涂染技術體系的建立提供探針依據。

1　材料和方法

1.1試驗材料

供試植物材料:大白菜自交系85-1。供試試劑:6×Loading Buffer、DNA Marker、LATaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTP(2.5 mmol/L)、2×GC Buffer(含25 mmol/L Mg2+)均購自TaKaRa公司;瓊脂糖購自于上海GENE TECH公司。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取與檢測采用改良的CTAB法[21]提取大白菜85-1 5～6片苗期和開花期嫩葉基因組DNA,采用0.7%的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA的質量,采用紫外分光光度計測定其濃度。

1.2.2引物設計與合成基于白菜基因組網站(http://brassicadb.org/brad/)A03染色體的序列數據資料,利用在線軟件Repeatmarker排除重復DNA序列區(qū)段,利用Primer 5.0軟件從A03染色體頂端至170 kb區(qū)段隨機設計引物80對,引物長度20～23 bp,預期擴增長度5～17 kb,引物相關信息見表1,引物由上海生物工程技術有限公司合成。

1.2.3PCR擴增和檢測PCR基本反應體系20 μL,包含:50 ng/μL模板DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL正反引物各1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ(含Mg2+)2 μL,5 U/μL LATaq酶 0.2 μL,剩余體積用滅菌水補齊。其中對dNTPs的使用量分別進行了0.125，0.150，0.200，0.250，0.300，0.350 mmol/L的調整。

PCR的基本擴增程序參照Lou等[13]進行:98 ℃變性15 s；60 ℃退火10 s,68 ℃延伸5 min,共計35個循環(huán)；68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。根據引物序列不同對退火溫度進行58,60,62,64 ℃和延伸時間進行3,4,5 min的調整。

反應結束后,取5 μL PCR擴增產物與1 μL 6×Loading Buffer混合,點樣于1%瓊脂糖凝膠(含0.05%的Goldview)點樣孔中,在電壓100 V恒壓的條件下,電泳40 min后檢測。

表1　引物信息

2　結果與分析

2.1基因組DNA質量檢測及對PCR擴增效果影響

模板的完整性和濃度是LR-PCR擴增質量的關鍵因素,只有高質量的DNA模板,才能擴增出理想的帶譜。對不同時期的嫩葉采用改良CTAB法提取基因組DNA(gDNA),瓊脂糖凝膠檢測結果表明:用苗期幼葉提取的gDNA約為23 kb,條帶清晰、完整,基本無降解,純度高;開花期嫩葉提取的gDNA也在23 kb左右,但條帶較弱,濃度低,且泳道中存在大量的降解DNA(圖1-A)。

將提取的gDNA濃度調整到50 ng/μL,以其為模板,利用引物A03Ⅱ-9按基本反應體系和基本反應程序進行PCR擴增,檢測結果表明:以苗期幼葉gDNA為模板,引物A03Ⅱ-9擴增出了1條長度大于5 kb的特異條帶,而以開花期幼葉gDNA為模板,擴增的條帶弱,特異性差,且為非目的條帶。因此相比較而言,苗期幼葉提取的gDNA較適用于LR-PCR(圖1-B)。

A.提取的gDNA檢測圖:M.λHind Ⅲ Marker;1～4.苗期幼葉gDNA;5～6.開花期幼葉gDNA。

2.2dNTPs濃度和延伸時間對長片段PCR擴增的影響

隨機選取不同預期擴增長度的6對引物A03Ⅶ-4、A03Ⅷ-3、A03Ⅶ-12、A03Ⅶ-8、A03Ⅶ-10和A03Ⅶ-1,預期擴增片段長度分別為6 983,7 425,8 702,9 770,11 550,14 996 bp,對反應體系中dNTPs的濃度和反應程序中延伸時間進行了梯度設置,在退火溫度為60 ℃時進行試驗。

試驗結果表明,當dNTPs濃度為0.150～0.200 mmol/L,延伸時間為3 min時,A03Ⅶ-4、A03Ⅷ-3和A03Ⅶ-12分別擴增出了預期大小的DNA片段(圖2-A);當dNTPs使?jié)舛葹?.150～0.200 mmol/L,延伸時間延長為4 min時,A03Ⅶ-8和A03Ⅶ-10分別擴增出了預期大小的DNA片段(圖2-B、D),當延伸時間延長為5 min時,A03Ⅶ-1擴增出了預期大小的DNA片段(圖2-C、E);而dNTPs的濃度為0.300,0.350 mmol/L時在不同的延伸時間6對引物的擴增效果不如濃度為0.200 mmol/L好,并且延伸時間為5 min時擴增效率最高(圖2-F)。

M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker;1.A03Ⅶ-4;2.A03Ⅷ-3;3.A03Ⅶ-12;4.A03Ⅶ-8;5.A03Ⅶ-10;6.A03Ⅶ-1.

2.3長片段引物的初篩

根據以上試驗結果得出,在PCR反應體系其他成分不變的情況下,采用0.200 mmol/L的dNTPs使用量,反應程序采用60 ℃的退火溫度和5 min的延伸時間,對設計的80對引物進行PCR擴增。結果表明,55對成功擴增出了預期大小的DNA片段,條帶清晰,長度為5～15 kb(表2),部分引物初篩瓊脂糖檢測結果如圖3所示。

表2　60 ℃退火溫度下可獲得擴增產物的引物

1.A03Ⅶ-1;2.A03Ⅶ-2;3.A03Ⅶ-4;4.A03Ⅶ-5;5.A03Ⅶ-6;6.A03Ⅶ-7;7.A03Ⅶ-8;8.A03Ⅶ-9;9.A03Ⅶ-10;10.A03Ⅶ-11;11.A03Ⅶ-12;12.A03Ⅷ-1;13.A03Ⅷ-2;14.A03Ⅷ-3;15.A03Ⅸ-1;16.A03Ⅸ-2;M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker.

2.4退火溫度梯度設置對擴增產物的影響

對于60 ℃退火溫度下沒有擴增出產物的26對引物,通過在58～64 ℃內設置連續(xù)退火溫度,對85-1基因組DNA進行了進一步擴增。

結果表明,有5對引物擴增出了預期大小的DNA片段,其中,2對引物A03Ⅳ-3和A03Ⅶ-8在退火溫度為58 ℃時分別獲得了預期大小為11,9 kb的擴增產物;3對引物A03Ⅱ-13、A03Ⅲ-9和A03Ⅳ-5均在退火溫度為64 ℃時得了預期大小為12～13 kb的擴增產物(圖4)。

1.A03Ⅱ-13;2.A03Ⅲ-9;3.A03Ⅳ-5;M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker.

3　討論

一般來說,普通的PCR技術通常情況下只能擴增5 kb以內的短片段。和普通的PCR技術相比來看,LR-PCR技術有很多難點,因為隨著擴增片段的延長,擴增效率也會隨之降低,在長片段PCR過程中,其DNA分子的變性比短片段困難;高溫會降低緩沖液的緩沖能力,從而損害模板DNA和PCR產物;且高溫下其他二價離子的存在會促進DNA的裂解;再者,DNA聚合酶與模板DNA的趨近和結合變得困難;錯配堿基的摻入導致DNA聚合酶的作用不能正常發(fā)揮,從而限制產物的長度;長片段擴增常常受到非特異短片段優(yōu)先擴增的影響等問題。

因此，為了提高長片段產物擴增效率,在反應體系和反應程序中,參考大多文獻,筆者采取了以下優(yōu)化措施:首先,模板在LR-PCR中起著決定性作用,較長的模板DNA中有更多位點容易在變性步驟中發(fā)生脫嘌呤和脫氨,所以長片段PCR中使用的要求是完整的DNA模板[15,21]。試驗證明用苗期幼葉為材料比開花期幼葉所提取的DNA條帶不容易降解,而且在DNA提取過程中,要注意操作輕柔,避免劇烈振蕩,以確保DNA的完整性;其次是調整反應體系,以適合擴增5～15 kb片段。在dNTPs用量上,在PCR反應中,dNTPs是為其提供原料的,所以較長目的片段可能需要較多的dNTPs;從原理上講是作為DNA合成的原料,片段越長需要的dNTPs越多,而且多數文獻中dNTPs采用濃度為0.35 mmol/L[21],本試驗中對dNTPs濃度進行了0.125～0.350 mmol/L的梯度設置,表明dNTPs濃度0.200 mmol/L(1.6 μL)時就可以獲得預期的片段長度;反應程序中,由于長片段PCR的擴增對退火溫度的反應特別敏感,筆者根據引物Tm值及預期片段長度,并參考Lou等[13]LR-PCR程序中采用的退火溫度60 ℃,選擇60 ℃為退火溫度,然后為了獲得較好的擴增效率,對退火溫度進行了梯度設置,發(fā)現在60 ℃時擴增效率最高,對沒有擴增出產物的引物,選用其他退火溫度,可獲得的引物只有5對,擴增效率不高說明退火溫度不是主要原因,可能與引物設計有關;另外,LR-PCR要保證鏈延伸足夠長,必須要保證足夠的鏈延伸時間和校對酶活性,在本試驗中證明采取延長延伸時間(5 min)時擴增效率最好。

通過調整PCR反應體系和反應程序,本試驗成功地獲得了60對長度為5～15 kb的PCR產物,為長片段探針在大白菜染色體涂染技術中的應用奠定了基礎。

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Optimization of Long-range PCR System Based on Single Copy Sequences of Chinese Cabbage

WEI Lijie,SU Jianhui,XUAN Shuxin,WANG Yanhua,SHEN Shuxing,ZHAO Jianjun

(College of Horticulture,Hebei Agricultural University,Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei,Baoding071001,China)

The products obtained by long range PCR based on objective sequences were the effective probes for FISH to carry out molecular cytogenetic study.However,it is very difficult to amplify more than 5 kb-long fragments effectively by traditional PCR techniques.Suitable reaction conditions and reaction system are the necessary prerequisite for running effective LR-PCR amplification.In order to obtain LR-PCR products based on the objective sequences as FISH probes,80 pairs of LR-PCR primers were designed based on the sequences of repeat-free regions on the top of Chinese cabbage chromosome A03,and PCR technique system was optimized from the following aspects containing the template quality of Chinese cabbage genomic DNA,dNTPs concentration,annealing temperature and extended time.Results indicated that genomic DNA of seedling leaves and LATaqpolymerase enzyme could improve the amplification quality and efficiency of long-range PCR.And 5-15 kb PCR products could be amplified by the reaction system with 20 μL of total volume,comprising of 50 ng/μL DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL of each primer 1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ (including Mg2+) 2 μL,5 U/μL LATaqenzyme 0.2 μL.PCR reaction procedure was followed as:98 ℃ for 15 s;58-64 ℃ for 10 s,68 ℃ for 5 min,35 cycles;final extension at 68 ℃ for 10 min kept at 4 ℃.Under these conditions,60 fragments with 5-15 kb length were obtained from Chinese cabbage genome.This research would establish the basis for carrying out long range PCR-FISH on meiotic pachytene chromosomes of Chinese cabbage and for clarifying evolutionary by comparing chromosome painting among close related species.

Chinese cabbage;Long range PCR(LR-PCR);System optimization;Single copy sequences

2016-05-12

國家自然科學基金項目(31501758;31171964);農業(yè)部杰出人才培養(yǎng)計劃項目(2130106);“十二五”農村領域國家科技計劃項目(2012AA100202-5);河北省百人計劃項目(No.E2013100011);河北省科技計劃項目(16226304D)

魏利潔(1988-),女,河北邯鄲人,碩士,主要從事蔬菜育種研究。

趙建軍(1971-),男,河北滄州人,研究員，博士,博士生導師,主要從事蔬菜生物技術與遺傳育種研究。

軒淑欣(1977-),女,河北保定人,副研究員,博士，碩士生導師,主要從事分子細胞遺傳與育種研究。

Q78;S634.03

A

1000-7091(2016)04-0051-06

10.7668/hbnxb.2016.04.009