尼羅羅非魚干擾素調(diào)節(jié)因子1的表達(dá)與細(xì)胞定位

王　丹,解文杰,朱葉飛,趙金良,陳曉武

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上?！?01306)

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尼羅羅非魚干擾素調(diào)節(jié)因子1的表達(dá)與細(xì)胞定位

王丹,解文杰,朱葉飛,趙金良,陳曉武

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201306)

為了分析尼羅羅非魚干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)的表達(dá)規(guī)律及其功能,克隆了尼羅羅非魚IRF1基因cDNA全長(zhǎng),與其他脊椎動(dòng)物IRF1基因進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建IRF家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。然后使用PolyI∶C對(duì)尼羅羅非魚進(jìn)行體內(nèi)注射誘導(dǎo)抗病毒免疫反應(yīng),利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)處理組和對(duì)照組中尼羅羅非魚各組織IRF1基因的表達(dá)差異。最后構(gòu)建尼羅羅非魚IRF1基因真核表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞定位。結(jié)果表明,尼羅羅非魚IRF1有888 bp的開放讀碼框,編碼295個(gè)氨基酸的蛋白序列。該蛋白N端高度保守,并含有6個(gè)保守的色氨酸,具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對(duì)蛋白相似率的計(jì)算發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚與斑馬魚IRF1相似度為52.1%。而與大鼠IRF1的相似率最低,為36.2%。IRF家族成員蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,IRF家族共分為4個(gè)亞群。將pCMV3-FLAG-IRF1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中后,對(duì)IRF1進(jìn)行細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),尼羅羅非魚IRF1主要分布在胞質(zhì)中,胞核中有少量分布。對(duì)尼羅羅非魚使用PolyI∶C進(jìn)行體內(nèi)注射誘導(dǎo)抗病毒應(yīng)答反應(yīng),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到各個(gè)組織中IRF1在不同時(shí)間下的表達(dá)水平有顯著差異。本研究完成了尼羅羅非魚IRF1的表達(dá)和細(xì)胞定位,對(duì)各種脊椎動(dòng)物IRF家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果有助于深入了解干擾素系統(tǒng)在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的調(diào)控機(jī)制。

干擾素調(diào)節(jié)因子;尼羅羅非魚;系統(tǒng)進(jìn)化;細(xì)胞定位

干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulation factor,IRF)能夠調(diào)節(jié)干擾素基因(Interferon,IFN)的轉(zhuǎn)錄。至今為止,在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)9個(gè)IRF成員(IRF1～9),鳥類中共有10個(gè)IRF家族成員被鑒定出(IRF1～10),而在魚類,IRF家族第11號(hào)成員IRF11只在斑馬魚等硬骨魚類中[1-2]。IRF除了可以誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生及抗病毒功能之外,還在細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡等方面發(fā)揮著廣泛作用[3-4]。所有的IRF家族成員在結(jié)構(gòu)上均有較高的保守性,IRF基因N端由大約120個(gè)高度同源的氨基酸組成,為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain,DBD)。在DBD結(jié)構(gòu)域內(nèi)有5個(gè)高度保守的色氨酸,形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)。通過DBD結(jié)構(gòu)域,IRF基因能夠結(jié)合DNA以發(fā)揮各種生物學(xué)功能。IRF1由于能夠結(jié)合在Ⅰ型IFN的病毒誘導(dǎo)類增強(qiáng)子元件上誘導(dǎo)IFN的表達(dá)而最早被發(fā)現(xiàn),隨后家族其他成員被陸續(xù)報(bào)道。除了IRF1外,其他IRF成員的羧基端均有一個(gè)能夠介導(dǎo)與其他轉(zhuǎn)錄因子互作的干擾素調(diào)節(jié)因子相關(guān)域(Interferon associate domain,IAD) 1區(qū)域[5]。而在IRF1亞家族羧基端為IAD2,能夠與IRF8發(fā)生互作。IRF1最先作為Ⅰ型干擾素基因病毒誘導(dǎo)增強(qiáng)子樣元件的調(diào)節(jié)子被發(fā)現(xiàn),也是目前研究最多的IRF家族成員。IRF1能夠結(jié)合IFN啟動(dòng)子調(diào)控域,誘導(dǎo)I型IFN的表達(dá),參與機(jī)體抗病毒過程[6]。對(duì)哺乳動(dòng)物IRF1的研究發(fā)現(xiàn),IRF1能夠在各種細(xì)胞中組成性表達(dá),不僅存在于細(xì)胞核中,也存在細(xì)胞質(zhì)中。在斑馬魚中,IRF1與其他IRF成員相比,在免疫器官中表達(dá)量最高,并且病毒感染后的IRF1表達(dá)變化最為顯著[7]。通過利用IRF1基因構(gòu)建質(zhì)粒,并用熒光素酶分析發(fā)現(xiàn)草魚體內(nèi)IFN的轉(zhuǎn)錄水平提高,從而證明IRF1是草魚IFN轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)因子[8]。在魚類中,牙鲆的IRF1是較早被鑒定出來的。當(dāng)被感染牙鲆彈狀病毒后,IRF1基因在牙鲆各組織中的表達(dá)量都出現(xiàn)增高[9]。IRF家族成員眾多,功能復(fù)雜,有的相互協(xié)同,也有相互拮抗的關(guān)系[7]。在細(xì)胞定位研究中也有不同之處。目前,在少數(shù)動(dòng)物中有報(bào)道。魚類作為種類最多的脊椎動(dòng)物,是研究IRF系統(tǒng)最好的選擇。

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)隸屬于鱸形目(Percifomes)、麗魚科(Cichlidae),其適應(yīng)性強(qiáng)、食性廣、生長(zhǎng)快、繁殖力高[10]。我國(guó)是尼羅羅非魚養(yǎng)殖的主要國(guó)家,現(xiàn)已成為主要淡水養(yǎng)殖品種。近年來,由于養(yǎng)殖密度高、養(yǎng)殖環(huán)境變化等原因?qū)е吗B(yǎng)殖尼羅羅非魚發(fā)病率逐漸升高,威脅著尼羅羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[11-12]。對(duì)尼羅羅非魚抗病毒研究,特別是IRF家族在病毒性疾病中的功能研究還很少。尼羅羅非魚基因組已經(jīng)比較完整,多數(shù)IRF家族成員已經(jīng)被注釋,但尚需試驗(yàn)驗(yàn)證。IRF1表達(dá)水平相對(duì)其他IRF家族成員較高,也是重要的代表性成員。因此,本試驗(yàn)以尼羅羅非魚為研究對(duì)象,對(duì)IRF1基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、抗病毒效應(yīng)、以及細(xì)胞定位方面進(jìn)行分析探討。

1　材料和方法

1.1尼羅羅非魚養(yǎng)殖和取材

試驗(yàn)用尼羅羅非魚是由上海海洋大學(xué)尼羅羅非魚種質(zhì)資源試驗(yàn)站提供的新吉富品系,選擇體重200 g左右的試驗(yàn)魚,暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖中心,試驗(yàn)期間水溫25 ℃,每天投喂飼料2次,14 d后挑選攝食正常,體表完好無(wú)傷,健康狀況良好的尼羅羅非魚用于試驗(yàn)。暫養(yǎng)后的尼羅羅非魚隨機(jī)分為2組。使用聚肌胞苷酸(PolyI∶C)對(duì)其中一組尼羅羅非魚進(jìn)行腹腔注射以模擬病毒刺激。所使用的PolyI∶C購(gòu)自Sigma公司,溶于滅菌后的磷酸緩沖液中,注射量為每克魚0.5 μg。另一組使用不含PolyI∶C的PBS腹腔注射作為對(duì)照。

1.2組織總RNA的提取

PolyI∶C處理12,24 h后,將處理組及對(duì)照組尼羅羅非魚用M-222麻醉,取腦、鰓、肝、脾和腎臟組織迅速凍存于液氮中,約30 mg組織在1 mL TRIzol進(jìn)行裂解,裂解使用AP公司的裂解柱。RNA提取按照TRIzol說明書中的操作步驟進(jìn)行。提取完畢后,使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的完整性,并用分光光度儀檢測(cè) RNA 的產(chǎn)量和純度。合格的RNA 樣品存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3IRF1基因的克隆

第一鏈cDNA合成使用逆轉(zhuǎn)錄PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司),具體操作按試劑盒說明書操作。接著對(duì)尼羅羅非魚IRF1 基因全長(zhǎng)進(jìn)行克隆。首先,利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尼羅羅非魚IRF1(XM_003451380.3)預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物OnIRF1F:TCCTGGAATCAAAGCAAATT,OnIRF1R:TGAGGGTAGCTCTGCAAACT。以對(duì)照組尼羅羅非魚頭腎為模板,對(duì)IRF1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性 30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min 30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳并使用 DNA 凝膠回收試劑盒(Qiagen 公司)割膠回收,回收后的目的片段使用pGEM T-easy Vector (Promega公司)為載體進(jìn)行連接,連接后轉(zhuǎn)染至DH5α大腸桿菌中培養(yǎng)擴(kuò)增,后經(jīng)菌液PCR鑒定,挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并使用EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切,電泳鑒定后,將樣品送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

獲得的IRF1序列使用DNAStar等軟件分析序列信息,確定其開放閱讀框進(jìn)而預(yù)測(cè)氨基酸序列,并且在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BlastP分析。從 GenBank 下載脊椎動(dòng)物模式物種的IRF家族蛋白序列,使用ClustalX及MEGA6軟件對(duì)IRF家族成員蛋白序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。MEGA軟件中鄰接法采用Poission correction替換模型和配對(duì)刪除法,系統(tǒng)樹分支的可信度測(cè)試采用100次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)。

1.5IRF1在不同組織中的表達(dá)和比較

根據(jù)尼羅羅非魚IRF1基因cDNA序列,設(shè)計(jì)1對(duì)基因特異引物qOnIRF1F:AACAGTCGAGATTG GCCCTG,qOnIRF1R:AGAGTTGTGTACTGTGGCCG。以β-actin作為內(nèi)參基因,引物為qOnactbF:GAATC CTGCGGAATCCACGA,qOnactbR:ATTTACGCTCAG GTGGGGC。20 μL PCR 反應(yīng)液中包括 2 μL cDNA 模板,10 μL 2 ×Roche SYBR Master Mix,正反向混合引物共0.8 μL (10 μmol/L)和 7.2 μL雙蒸水。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min;再運(yùn)行 95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s退火共40 個(gè)循環(huán);接著72 ℃延伸5 min,最后繪制熔解曲線,生物學(xué)重復(fù)每組3個(gè)(n=3)。每個(gè)樣品重復(fù) 3管以保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性,利用公式 2-ΔΔCt計(jì)算出每一個(gè)樣本IRF1 基因的相對(duì)表達(dá)量,使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行顯著差異分析和作圖。

1.6熒光表達(dá)載體構(gòu)建和細(xì)胞定位

使用OnIRF1F和OnIRF1R擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,使用兩端包含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物IRF1-CMVs:GACAAGCTTATGCCAGTGTCAAGA (Hind Ⅲ)和IRF1-CMVa:GGCCTAGGTAAAGCAAAAGTGG (BamH Ⅰ),進(jìn)行第2輪PCR,再經(jīng)過克隆驗(yàn)證。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,和經(jīng)過同樣酶切的p3XFLAG-CMV-10表達(dá)載體進(jìn)行連接。構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV3-FLAG-IRF1,進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的Hela細(xì)胞中,培養(yǎng)后進(jìn)行免疫熒光染色,主要方法如下:轉(zhuǎn)染48 h后,使用3%的多聚甲醛固定細(xì)胞10 min;將固定好的細(xì)胞置于含0.2%TritonX-100的PBS溶液通透15 min;之后置于5%的山羊血清37 ℃封閉1 h,接著加入免抗FLAP抗體(1∶200稀釋濃度)37 ℃下孵育1 h;再使用FITC標(biāo)記的抗山羊IgG二抗孵育1 h;使用PBS漂洗3次后,使用4′、6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核1 min,熒光顯微鏡下觀察和拍照。

起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TAA)加粗顯示。下劃線為DBD結(jié)構(gòu)域區(qū)。

2　結(jié)果與分析

2.1尼羅羅非魚IRF1基因序列特征

尼羅羅非魚IRF1基因克隆測(cè)序的結(jié)果顯示其讀碼框長(zhǎng)度為888 bp,編碼295個(gè)氨基酸的蛋白序列(圖1)。蛋白質(zhì)分子量是34.15 kDa。氨基酸含量最高的是絲氨酸(Ser,S),占12.0%,最低的是酪氨酸,占2.0%。蛋白序列不含信號(hào)肽。

比較斑馬魚、河鲀及尼羅羅非魚IRF1基因結(jié)構(gòu)圖中可以看出,尼羅羅非魚IRF共有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子,尼羅羅非魚與河鲀比較接近。而斑馬魚只有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子區(qū)較長(zhǎng)。可見,尼羅羅非魚IRF1基因與河鲀IRF1相比,基因排列基本一致,存在高度保守的基因組共線性關(guān)系,上下游包括了ACS16、FNIP1和SLC22A4等基因(圖2)。

A.羅非魚、河豚和斑馬魚IRF1基因結(jié)構(gòu)。方框代表外顯子,水平線代表內(nèi)含子,不保守外顯子和保守外顯子分別用黑色框和白色框表示,數(shù)字分別代表核苷酸數(shù)目。B.羅非魚、河豚和斑馬魚IRF1基因在基因組中的共線性分析。

A.Schematic diagram of gene structure ofIRF1 in tilapia,fugu and zebrafish.Exons were expressed as boxes,and introns as lines,black and white boxes indicated conserved and unconserved regions,and the figure means the number of nucleotides;B.Diagram to show gene synteny atIRF1 loci in nile tilapia,fugu and zebrafish.

圖2IRF1基因結(jié)構(gòu)和共線性分析

Fig.2Analysis of gene structure and synteny ofIRF1

尼羅羅非魚和斑馬魚(Daniorerio)、虹鱒(Onchorynchusmykiss)等硬骨魚類及其他脊椎動(dòng)物如雞(Gallusgallus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)及人(Homosapiens)IRF1比對(duì)結(jié)果顯示,IRF是一類結(jié)構(gòu)特征上保守的轉(zhuǎn)錄因子家族。所有物種IRF1蛋白的N 端約120個(gè)氨基酸的同源性較高,越靠近C端,保守性越低。氨基酸的N端包含DBD結(jié)構(gòu)域,而在C端含有IAD2結(jié)構(gòu)域。在尼羅羅非魚IRF1氨基端DBD結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有 IRF家族特有的色氨酸(Try,W)重復(fù)殘基,分別為第11,26,38,46,58及77位,共6個(gè)(圖3)。蛋白同源性分析結(jié)果顯示,尼羅羅非魚與斑馬魚的IRF1蛋白序列相似度最高,為52.1%，其次是鮭魚(44.3%)及虹鱒(42.6%),相似度最小的為大鼠(36.2%)。

選取脊椎動(dòng)物亞門中的代表物種IRF家族各成員蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。從圖4可以看出,13個(gè)IRF1蛋白聚集在一起,其中尼羅羅非魚IRF1 與黃鱔和青鳉IRF1相似性最高,而與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的魚和其他脊椎動(dòng)物IRF1相似性較低。其他IRF也基本聚集成單獨(dú)的家族,最后又分別聚為4大亞群:一支包含所有IRF1和IRF2;一支由IRF4、IRF8和IRF9組成;一支由IRF5和IRF6組成;一支由IRF3和IRF7組成。

2.2尼羅羅非魚IRF1 mRNA的組織特異性表達(dá)及刺激后的表達(dá)變化

尼羅羅非魚IRF1在腦、鰓、肝、脾和頭腎中均有表達(dá)。脾臟及鰓中IRF1表達(dá)量較高,而在腦中的表達(dá)量比其他組織低。尼羅羅非魚腹腔注射PolyI∶C 12 h后,除腦無(wú)顯著差異外,其他各組織的對(duì)照組和處理組均有顯著差異。差異最大的為肝臟,表達(dá)量約增加12倍。在處理24 h后,頭腎及脾臟中IRF1表達(dá)水平仍有顯著上調(diào)變化。在處理24 h后的各個(gè)組織中,IRF1表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)(圖5)。

實(shí)線方框顯示DBD結(jié)構(gòu)域,其中包括高度保守的6個(gè)色氨酸;虛線方框代表IAD2結(jié)構(gòu)域。

2.3IRF1表達(dá)載體的構(gòu)建及免疫熒光染色定位

構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCMV3-FLAG-IRF1,轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并進(jìn)行熒光染色,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV3-FLAG-IRF1的細(xì)胞能夠檢測(cè)到綠色熒光,說明IRF1重組蛋白能夠在細(xì)胞中正常表達(dá),熒光主要定位在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中也能檢測(cè)到少量綠色熒光蛋白。這表明尼羅羅非魚IRF1主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖6)。

3　討論

尼羅羅非魚作為重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種,近10年在我國(guó)的產(chǎn)量以平均每年9%左右的速度遞增,穩(wěn)居世界首位。其養(yǎng)殖產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量50%。但隨著尼羅羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大,各種傳染性疾病的發(fā)生呈現(xiàn)不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì),尤其是近年來鏈球菌病和一些病毒性疾病的大范圍流行,給尼羅羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。因此,對(duì)于尼羅羅非魚免疫學(xué)的研究越來越受到重視。

隨著尼羅羅非魚基因組信息的逐步完善,通過生物信息學(xué)方法能獲得大量注釋的編碼基因,包括IRF家族的成員。但是相關(guān)結(jié)果仍然需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證,但尼羅羅非魚IRF1基因的功能研究也未見報(bào)道。通過將尼羅羅非魚與其他脊椎動(dòng)物的IRF1氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)后發(fā)現(xiàn),IRF1家族蛋白序列比較保守。特別是氨基端有高度保守的DBD結(jié)構(gòu)域,并含有6個(gè)色氨酸殘基,說明尼羅羅非魚IRF1蛋白序列擁有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。在羧基端,IRF1和IRF2具有與其他成員不同的IAD2結(jié)構(gòu)域。盡管IRF1和IRF2序列比較接近,但是在干擾素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及促細(xì)胞生長(zhǎng)方面具有不同的效應(yīng)[13-14]。IRF1具有激活干擾素轉(zhuǎn)錄功能,而IRF2通過與IRF1競(jìng)爭(zhēng)相同的順式調(diào)控元件而發(fā)揮相反的抑制作用[15]。通過來自脊椎動(dòng)物的IRF家族基因蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,IRF1～I(xiàn)RF 9都可以單獨(dú)聚為1支。而IRF家族又可分為四大支:IRF1 亞家族;IRF4亞家族;IRF5亞家族和IRF3亞家族。結(jié)果表明IRF在分化中的時(shí)間上先后不同。

系統(tǒng)樹構(gòu)建使用MEGA 6.0軟件,根據(jù)Neighbor-joining法進(jìn)行計(jì)算,自舉檢測(cè)100次重復(fù)檢驗(yàn),蛋白序列來自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

IRF1基因表達(dá)量計(jì)算以β-actin作為內(nèi)標(biāo),每組至少3條魚,每組計(jì)算mean±SEM;*.P<0.05。

A.IRF1在細(xì)胞中表達(dá)的熒光照片;B.細(xì)胞核DAPI染色;C.IRF1熒光染色和DAPI染色圖像重合。

作為低等脊椎動(dòng)物,魚類具有固有免疫和適應(yīng)性免疫[16]系統(tǒng)。由于魚類適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的不完善,固有免疫系統(tǒng)在魚類整個(gè)免疫系統(tǒng)中占十分重要的地位。固有免疫利用模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)對(duì)細(xì)菌、病毒等病原體中保守結(jié)構(gòu)、病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)進(jìn)行識(shí)別,從而引起免疫反應(yīng)[17]。在識(shí)別PAMPs的過程中,Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是研究最多的模式識(shí)別受體之一,能夠誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá),從而使機(jī)體形成抗病毒狀態(tài)。I型IFN系統(tǒng)在固有免疫及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中扮演重要的角色,能參與抗病毒免疫反應(yīng),抑制腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié),巨噬細(xì)胞活性及T、B淋巴細(xì)胞增殖[18-20]。而這些過程離不開IRF家族成員的參與。IRF家族為IFN重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。關(guān)于哺乳動(dòng)物IRF家族功能的研究表明,IRF1、IRF3、IRF5和IRF7能夠參與I型干擾素的正反饋調(diào)節(jié),以此發(fā)揮抗病毒作用[21]。如在哺乳動(dòng)物TLR信號(hào)通路中,當(dāng)機(jī)體受到病毒感染時(shí),細(xì)胞質(zhì)中的IRF3受到磷酸化并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,以激活I(lǐng)FN-beta的低量表達(dá)。而IFN-beta又能促進(jìn)IRF7的大量表達(dá),從而IRF3和IRF7的大量表達(dá)激活I(lǐng)型干擾素及抗病毒基因的表達(dá)。在魚類中已有十幾種魚類IRF1的研究,包括虹鱒、河鲀、斑馬魚及草魚等硬骨魚類。經(jīng)聚肌胞苷酸刺激的魚類,其各個(gè)組織中IRF1的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)顯著上調(diào)[22-24]。在草魚抗病毒感染的過程中,IRF3在受到刺激后能大量表達(dá),從而誘導(dǎo)IFN和ISG的轉(zhuǎn)錄[25]。對(duì)斑馬魚的研究顯示,IRF1與其他IRF家族成員相比,在免疫器官中的表達(dá)量最高,并且病毒感染后的IRF1表達(dá)變化最為顯著[7]。對(duì)牙鲆IRF1的研究發(fā)現(xiàn),IRF1能夠使機(jī)體形成抗病毒狀態(tài)[15]。因此,在牙鲆的養(yǎng)殖過程中,IRF1可以作為一種DNA疫苗輔劑而增強(qiáng)魚體抗病能力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示了尼羅羅非魚各種組織能表達(dá)IRF1,其表達(dá)量也會(huì)隨著組織種類的不同而不同。試驗(yàn)利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)尼羅羅非魚各組織中IRF1表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)IRF1基因在脾臟和鰓中表達(dá)量較高,腦中的表達(dá)水平較低。同時(shí)利用聚肌胞苷酸PolyI∶C模擬病毒刺激,促使尼羅羅非魚產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示,各個(gè)組織中IRF1的表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(shì)?？梢?IRF1對(duì)病毒刺激有相同的反應(yīng)模式,其功能具有保守性。

對(duì)哺乳動(dòng)物IRF1細(xì)胞定位的研究發(fā)現(xiàn),IRF1主要存在于細(xì)胞核中,少量在細(xì)胞質(zhì)中[26-27]。而斑馬魚IRF1在正常狀態(tài)下主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,經(jīng)過刺激后會(huì)聚集在細(xì)胞核中[7]。為了對(duì)尼羅羅非魚IRF1進(jìn)行細(xì)胞定位,本試驗(yàn)構(gòu)建IRFl融合蛋白的真核表達(dá)載體pCMV3-FLAG-IRF1。轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞定位,這種方法可以方便地使用抗flag的抗體來識(shí)別目的蛋白,有利于目的蛋白檢測(cè)和分離純化[28]。免疫熒光染色結(jié)果顯示,尼羅羅非魚IRF1蛋白能在Hela細(xì)胞中表達(dá),而且在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)更多,在細(xì)胞核中僅存在少量表達(dá)。結(jié)果和斑馬魚IRF1的研究結(jié)果比較接近,和哺乳動(dòng)物結(jié)果有一定差異,推測(cè)與表達(dá)的蛋白種類和選擇的細(xì)胞類型有關(guān)系。本試驗(yàn)對(duì)尼羅羅非魚IRF1基因進(jìn)行克隆,系統(tǒng)分析和細(xì)胞定位,初步探討了其在抗病毒中的組織表達(dá)和反應(yīng)模式。這些結(jié)果將有助于更深入了解脊椎動(dòng)物干擾素表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn),為尼羅羅非魚抗病研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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Expression Characterization of Interferon Regulatory Factor 1 in Nile Tilapia

WANG Dan,XIE Wenjie,ZHU Yefei,ZHAO Jinliang,CHEN Xiaowu

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Shanghai Ocean University,Ministry of Education,Shanghai201306,China)

In order to study the expression and function of interferon Regulatory Factor (IRF1) in nile tilapia,the full length cDNA ofIRF1 was cloned and applied for phylogenetic analysis,and the expression variation was checked by qRT-PCR after PolyI∶C stimulation.Cell transfection by eukaryotic expression vector was used to analyzing for subcellular localization.The opening reading frame of nile tilapiaIRF1 contains 888 bp with deduced protein of 295 amino acids.Structurally,nile tilapia IRF1 protein typically shares the conserved characterizations with other species′ IRF1 homologues,displaying conserved DNA-binding domain,IRF association domain,serine-rich C terminal domain,and 6 tryptophan residues in the N terminal.The results of phylogenetic analysis showed that the IRF family was divided into four subfamily:IRF1,IRF3,IRF4 and IRF5.The nile tilapia IRF1 was found to be merged into the teleost subgroup,amphibian and mammalian homologues were clustered into their corresponding subgroups.Real-time PCR revealed a broad expression pattern of nile tilapiaIRF1 in various tissues.The expression ofIRF1 was mainly in the head kidney,spleen,liver and gill,furthermore,which increased obviously after PolyI∶C stimulation,especially for the spleen and head kidney.Subcellular localization analysis showed that nile tilapia IRF1 mainly resides in the cytoplasm.These data supported the view that nile tilapia IRF1 was a potential molecule in IFN immune defense system against viral infection.

Interferon regulatory factor;Nile tilapia;Phyletic evolution;Subcellular localization

2016-02-25

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-49);水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心 (ZF1206)

王丹(1991-),女,安徽淮南人,在讀碩士,主要從事魚類免疫學(xué)研究。

陳曉武(1976-),男,安徽六安人,副教授,博士,主要從事水生生物分子遺傳學(xué)研究。

Q785;S917

A

1000-7091(2016)04-0031-08

10.7668/hbnxb.2016.04.006