兩種擬南芥CBF2基因突變體的鑒定與分析

劉曉東,劉　超,焦彬彬,代培紅,蘇秀娟,李　月

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,新疆 烏魯木齊　830052;2.上海出入境檢驗檢疫局,上海　200135)

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兩種擬南芥CBF2基因突變體的鑒定與分析

劉曉東1,劉超1,焦彬彬2,代培紅1,蘇秀娟1,李月1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,新疆 烏魯木齊830052;2.上海出入境檢驗檢疫局,上海200135)

低溫是主要的逆境脅迫之一,限制了作物的地理分布和產(chǎn)量。篩選理想的抗凍靶基因用于分子育種對于穩(wěn)定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。CBF調(diào)節(jié)子在植物抗凍反應(yīng)中扮演主要的角色，CBF2是CBF調(diào)節(jié)子的組成成分之一,在抗凍反應(yīng)中扮演負調(diào)控的作用。采用qRT-PCR和常規(guī)農(nóng)藝性狀測定法對2種CBF2基因突變體cbf2-1和cbf2-2進行了多項指標的鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這2種突變體中CBF2基因的表達存在不同程度的缺陷,cbf2-1中CBF2基因受低溫誘導(dǎo)表達,但表達量與對照相比,明顯下降;而cbf2-2中CBF2基因誘導(dǎo)表達的效應(yīng)完全喪失。抗凍性檢測結(jié)果顯示CBF2基因的表達量越低,其突變體植株的抗凍性越強,同時冷脅迫后冷響應(yīng)的下游基因表達量也越高,更重要的是,雖然這2種CBF2基因突變體抗凍性明顯增強,但與野生型植株相比,其開花時間和單株種子產(chǎn)量并沒有明顯變化。以上結(jié)果表明CBF2是一種可以利用基因組編輯技術(shù)進行作物抗凍育種的理想候選靶基因,可以利用最新的基因組編輯技術(shù)進行作物抗凍育種研究。

擬南芥;CBF2;抗凍;負調(diào)控

低溫顯著地限制了植物的地理分布和生長季節(jié),對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。植物為了生存,在長期進化過程中產(chǎn)生了一套復(fù)雜的基于低溫響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控機制,以增強自身的抗凍性。轉(zhuǎn)錄因子在逆境信號傳導(dǎo)中起重要作用。其通過特定功能結(jié)構(gòu)域結(jié)合下游抗逆基因的啟動子,誘導(dǎo)或抑制目的基因表達,使植物在生理生化方面對逆境做出適應(yīng)性調(diào)整,最終通過代謝調(diào)控,阻止細胞發(fā)生損傷,增強植物的抗逆性,包括抗凍性[1]。

DREB/CBF(Dehydration-responsive-element-binding protein/C-repeat binding factors )蛋白,屬于APETALA2(AP2)轉(zhuǎn)錄因子家族,可識別下游調(diào)控基因啟動子上的CRT/DRE(C-repeat/dehydration-responsive element)元件,進而調(diào)控靶基因的表達[2-3]。CBF通路是擬南芥抗凍調(diào)控機制中了解最清楚的一個途徑[4-5],在抗凍反應(yīng)中扮演主要的角色,也稱CBF調(diào)節(jié)子[3]。該調(diào)節(jié)子包括3個轉(zhuǎn)錄因子基因,分別是CBF1、CBF2和CBF3[6],也分別稱為DREB1b、DREB1c和DREB1a[3],這3個基因中任何一個過量表達都能改變上百個低溫響應(yīng)基因的表達,提高植物的抗凍性[7-9]。這3個基因在擬南芥基因組上以串聯(lián)的方式連接在一起,在低溫處理幾分鐘后就能被誘導(dǎo)表達[10-11]。然而他們自身的啟動子上并不包含低溫誘導(dǎo)的CRT/DRE元件[12]。到目前為止,CBF調(diào)節(jié)子提高抗凍性的分子機制并不完全清楚,已研究發(fā)現(xiàn)涉及抗凍蛋白基因的表達[13-14]和一系列低分子量冷凍保護劑的合成[15-17]。

擬南芥CBF1、CBF2和CBF3之間氨基酸序列相似性高達85%,而且這3個基因超表達后都能提高擬南芥的抗凍性[16],然而進一步研究發(fā)現(xiàn),他們的功能并不相同。首先CBF1和CBF3受低溫誘導(dǎo)表達的時間早于CBF2,而且發(fā)現(xiàn)CBF2負調(diào)控了CBF1和CBF3基因的表達[18],但CBF1或CBF3并沒有負調(diào)控其他2個CBF基因;其次CBF1和CBF3功能缺陷突變體的抗凍性明顯減弱,這與它們超表達后抗凍性增強的結(jié)果相呼應(yīng)[12]。然而CBF2功能缺陷突變體cbf2的抗凍性卻顯著提高,并且發(fā)現(xiàn)可能是通過同時提高CBF1和CBF3基因的表達量增強了植物的抗凍性[17]。與CBF1或CBF3組成型過量表達結(jié)果不同的是,CBF1或CBF3過量表達后,植株的抗凍性明顯提高但生長發(fā)育受到嚴重抑制[16,19-20],而cbf2突變體的抗凍性也顯著提高,但植株正常的生長發(fā)育并沒有受到任何明顯影響[18]。上述研究結(jié)果揭示出CBF2在植物抗凍反應(yīng)中的負調(diào)控功能。本試驗鑒定了2種CBF2功能不同缺陷程度的突變體,進一步研究CBF2與植物抗凍性之間的關(guān)系以及在作物抗凍育種中的潛在價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBF2功能缺陷程度較高的突變體,植株的抗凍性更強,而且生長發(fā)育以及單株種子產(chǎn)量并沒有受到明顯影響。試驗結(jié)果表明,CBF2可以作為作物抗凍育種的候選靶基因。

1　材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana,Columbia ecotype)為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室保存。CBF2(At4G25470)基因的T-DNA插入突變體Salk_009689和Salk_073208購自擬南芥資源中心(ArabidopsisBiological Resource Center)。

1.1.2生化試劑Easy Pure Plant Genomic DNA Kit、Easy Pure RNA Kit、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCR SuperMix、EasyTaqDNA Polymerase、dNTP、DNA標準分子量均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2試驗方法

1.2.1植物培養(yǎng)將野生型Col-0和突變體擬南芥種子用6%次氯酸鈉消毒5 min后,用無菌水清洗5次,播種到1/2MS 培養(yǎng)基中,于4 ℃黑暗處理3 d,然后轉(zhuǎn)到22 ℃,14 h光照/10 h黑暗,光照強度6 000～8 000 lx的環(huán)境中培養(yǎng)7 d。將其移栽到蛭石∶泥炭土∶珍珠巖=6∶3∶1比例混合的培養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2擬南芥AtCBF2突變純合體的鑒定將擬南芥新鮮幼苗葉片置于液氮中研磨,按照Easy Pure Plant Genomic DNA Kit操作步驟提取葉片基因組DNA。根據(jù)http://signal.salk.edu/網(wǎng)站上查到Salk_009689和Salk_073208的T-DNA插入位點信息,設(shè)計基因特異引物LP和RP與T-DNA的LBal,引物序列見表1。以基因組DNA為模板,分別以LP1/RP1和LBal/RP為組合引物進行PCR擴增,以野生型Col-0和突變體擬南芥基因組DNA為模板,采用EasyTaqDNA聚合酶擴增,擴增為20 μL體系：ddH2O 14 μL、10×Easy Taq Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L正反向引物各0.5 μL、模板0.5 μL、EasyTaqDNA聚合酶 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測有無目的條帶。

1.2.3野生型擬南芥和CBF2突變純合體低溫脅迫后基因轉(zhuǎn)錄水平分析將在上述培養(yǎng)條件下生長20 d的野生型Col-0和突變體擬南芥幼苗,進行冷脅迫處理。處理方法為：擬南芥苗置于盛有水(4 ℃低溫預(yù)冷)的大燒杯中,放置于4 ℃培養(yǎng)箱,持續(xù)光照。于上述處理的0,1,3,6,12,24 h采集葉片樣品,迅速置于液氮冷凍,按照Easy Pure RNA Kit操作步驟提取RNA,按照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix進行cDNA合成。利用http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/在線引物設(shè)計軟件進行基因qRT-PCR引物的設(shè)計,以擬南芥ACT2為內(nèi)參基因(表1)。根據(jù)TransStart Top Green qPCR SuperMix 說明書操作,反應(yīng)體系為cDNA 1 μL、10 μmol/L正反向引物各0.5 μL、Top Green qPCR Mix 10 μL、Passive Reference Dye 0.4 μL,超純水補至20 μL。利用ABI7500實時定量PCR儀進行PCR擴增,反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán);72 ℃ 30 s。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法分析。以看家基因ACT2為內(nèi)參進行校正比較,檢測CBF2基因在低溫處理0,4 h 2個時間點的表達水平,同時檢測下游基因在0 ,1,3,6,12,24 h 6個時間節(jié)點的表達水平。

1.2.4擬南芥植株冷凍脅迫后苗期表型分析將在上述培養(yǎng)條件生長20 d的野生型Col-0和突變體擬南芥幼苗,置于可控低溫培養(yǎng)箱中,參照文獻[18]方法進行低溫脅迫處理,然后植株轉(zhuǎn)移到上述正常的生長條件,恢復(fù)生長7 d,統(tǒng)計成活率。

1.2.5擬南芥開花時間和單株種子量測定將同批種植的野生型和cbf2突變體植株移栽至土壤中繼續(xù)生長,生長條件為22 ℃,14 h光照/10 h黑暗,記錄各單株第1朵花開放的時間。另外種子開始成熟后1個月,以3株苗為1個樣本,收集所有種子,然后在干燥箱中室溫干燥7 d后,采用稱重法測定單株種子量,設(shè)置3個重復(fù),分析突變體種子量是否與野生型種子量存在差異。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有試驗結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值±標準誤差。采用Microsoft Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行整理和方差分析;采用SPSS v19.0軟件進行差異顯著性檢驗。

表1　引物序列

2　結(jié)果與分析

2.1T-DNA插入純合突變體的鑒定

根據(jù)TAIR(http://www.arabidopsis.org/)提供的信息,SALK_009689和SALK_073208突變體T-DNA的插入位點分別為CBF2基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游180,30 bp的啟動子區(qū)內(nèi)(圖1)。

圖1　擬南芥CBF2基因結(jié)構(gòu)及其突變體示意圖

使用http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html提供的SALK_009689和SALK_073208 T-DNA插入位點兩側(cè)的正向引物SALK_009689-LP和SALK_073208-LP及反向引物SALK_009689-RP和SALK_073208-RP,以候選植株的基因組DNA為模板,進行PCR鑒定。若植株無T-DNA插入即野生型,突變體LP/RP引物可擴增出約1 000 bp的特異條帶,若植株為插入純合體,由于插入較大片段的T-DNA,超出了PCR的擴增能力,則無擴增條帶,若植株為雜合體,LP/RP引物可以擴增出1 000 bp的DNA片段,同時用T-DNA邊界引物LBa1和RP引物組合,會擴增出535～835 bp大小的DNA片段。

圖2　SALK_073208和SALK_009689純合突變體PCR鑒定

如圖2所示為SALK_073208突變體的PCR鑒定結(jié)果是1號植株和野生型(WT)植株結(jié)果一致,即用LP/RP引物有擴增條帶,而T-DNA邊界引物LBa1/RP未擴增出條帶,表明沒有T-DNA插入。2，3，4，5，6號植株用LP/RP引物未擴增出目的條帶,同時用T-DNA邊界引物LBa1/RP擴增出目的片段,表明這5個植株為T-DNA插入純合突變體。SALK_009689突變體PCR鑒定結(jié)果為5株苗均為T-DNA插入純合突變體。SALK_009689和SALK_073208的純合突變體分別命名為cbf2-1和cbf2-2。

2.2純合突變體中CBF2基因的表達

在基因啟動子區(qū)域中插入一段T-DNA會影響基因表達水平下調(diào)或者不表達。為了檢測CBF2基因在野生型擬南芥和純合突變體中的表達情況,對這些植株進行了4 ℃低溫脅迫處理,分別于0,4 h 2個時間點檢測基因的表達。如圖3所示,在正常生長條件下,CBF2基因在2種突變體與野生型擬南芥植株中均有低水平表達。在低溫處理4 h時,野生型植株CBF2基因大量誘導(dǎo)表達,但在cbf2-1和cbf2-2突變體中CBF2基因的誘導(dǎo)表達水平顯著降低,且在cbf2-2突變體中表達量下降最顯著,與0 h基本一致。以上結(jié)果表明,啟動子區(qū)T-DNA的插入抑制了CBF2基因的誘導(dǎo)表達,而cbf2-2突變體中CBF2基因的低溫誘導(dǎo)表達效應(yīng)基本喪失。

2.3擬南芥植株冷凍脅迫后苗期表型分析

Novillo等[18]發(fā)現(xiàn)CBF2基因突變后,植株的抗凍性顯著增強。試驗鑒定了2種CBF2基因T-DNA插入突變體,結(jié)果表明，這2種突變體導(dǎo)致CBF2基因的表達存在不同程度的缺陷。因此，與野生型一起,將CBF2基因3種不同表達量的遺傳材料進行了進一步的抗凍表型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)植株的抗凍性與CBF2基因的表達量呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)。隨著基因表達量的逐漸減弱,抗凍性也顯著增強(圖4)。成活率的統(tǒng)計也進一步驗證了表型的觀察結(jié)果,野生型Col-0的成活率為50%,cbf2-1突變體成活率為70%,cbf2-2突變體成活率為91%,2種突變體的成活率均顯著性高于野生型,而cbf2-2突變體的抗凍性顯著高于cbf2-1(圖4)。以上結(jié)果進一步證明了CBF2基因是一個抗凍負調(diào)控基因。

柱狀圖上的不同字母表示差異達到顯著水平(P<0.05)。圖4同。

2.4下游耐逆基因的表達分析

Novillo等[18]的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),CBF2基因突變后提高了下游一系列耐逆相關(guān)基因的表達。因此,cbf2-2突變體中這些耐逆基因的表達是否也顯著高于cbf2-1。為此本試驗挑選了4個耐逆基因COR15A、KIN1、DREB2A、LTI78進行了表達驗證分析。將野生型和2種突變體材料于4 ℃處理,分別于0,1,3,6,12,24 h 6個時間節(jié)點采集葉片,提取RNA,進行qRT-PCR分析。結(jié)果如圖5所示,這4個基因的表達趨勢基本一致,即在0 ,1 ,3 h的表達量很低,在6 h后基因的表達量開始明顯增加。2種突變體中上述4個耐逆基因的表達量都顯著高于野生型,同時cbf2-2突變體中這些耐逆基因的表達高于cbf2-1。以上結(jié)果呈現(xiàn)出植株抗凍性與CBF2基因的表達量存在明顯的負相關(guān)性。

圖4　cbf2突變體植株抗凍性和成活率分析

*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。

2.5cbf2突變體開花時間和單株種子量測定

抗逆性的增加往往會抑制植株的各種生產(chǎn)性狀[16-17],進而阻礙抗逆育種的推廣應(yīng)用。開花時間和單株種子產(chǎn)量是評價植株生產(chǎn)性狀的2個重要指標,因此對這2個指標進行測定。結(jié)果顯示,無論是開花時間還是單株種子量,cbf2突變體植株與野生型之間并沒有明顯差異。表明擬南芥cbf2基因突變后,開花時間和種子產(chǎn)量這2個重要性狀都沒有受到明顯影響(圖6)。

圖6　cbf2突變體開花時間(A)和單株種子量(B)分析

3　討論

DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于各種植物中,除了擬南芥外,還包括具有冷適應(yīng)能力的植物,如油菜和大麥;不具有冷適應(yīng)能力的植物,如番茄和水稻,以及大豆、葡萄等[21]。在擬南芥基因組中有6個DREB1/CBF基因,分別命名為DREB1A/CBF3、DREB1B/CBF1、DREB1C/CBF2、DREB1D/CBF4、DDF1/DREB1F和DDF2/DREB1E。其中只有CBF1、CBF2和CBF3 這3個基因受低溫脅迫高水平誘導(dǎo)表達[3,10],它們組成一個CBF調(diào)節(jié)子,開啟了一系列與低溫適應(yīng)有關(guān)基因的表達,這些基因的啟動子包含有CRT/DRE元件。其中CBF1和CBF3基因的過量表達都能增強植物的抗凍性,同時其對應(yīng)的功能缺陷突變體都表現(xiàn)出抗凍性減弱。不僅如此組成型表達CBF1或CBF3的轉(zhuǎn)基因植株還表現(xiàn)出對干旱和高鹽脅迫的耐受性[22]。由于CBF1和CBF3對多種逆境抗性的功能表現(xiàn),因此DREB1/CBF基因在各種植物中被廣泛克隆,同時也被廣泛地用于各種作物抗逆性的遺傳改良[21]。然而組成型表達CBF1和CBF3基因,卻常常導(dǎo)致植株發(fā)育遲緩,生長不正常,并嚴重地影響了DREB1/CBF基因在育種中的應(yīng)用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)使用誘導(dǎo)型啟動子,可以有效減弱組成型表達所帶來的負面效應(yīng)[22]。但是由于轉(zhuǎn)基因所產(chǎn)生的生物安全性問題引起社會極大的爭議,嚴重地阻礙了轉(zhuǎn)基因作物,尤其是轉(zhuǎn)基因糧食作物的市場推廣。

在植物體內(nèi)有許多調(diào)控抗逆性的基因,除目前普遍使用的正調(diào)控基因外,還存在一些負調(diào)控基因,這些基因突變,功能喪失后,植物的抗逆性也明顯增強,如ERA1[23]、ASG2[24]、SAD1[25]、GGB[26]和DST[27]等,而且一些突變體的生長發(fā)育與野生型相比并沒有明顯改變,其中CBF2就屬于這類基因。研究發(fā)現(xiàn)CBF2基因的突變,顯著提高了CBF1和CBF3基因的表達,并且被定時定量地控制,且沒有一直持續(xù)地高水平表達,這樣低溫來襲時,既提高了抗凍相關(guān)基因的表達,又有效地避免了由此帶來的副作用,植物的生長發(fā)育沒有受到明顯抑制[18]。本研究鑒定了2種在CBF2基因啟動子區(qū)存在T-DNA插入的純合突變體。T-DNA在啟動子區(qū)的插入顯著抑制了CBF2基因的誘導(dǎo)表達,其中在cbf2-2突變體中,CBF2基因的誘導(dǎo)表達效應(yīng)幾乎完全喪失。通過對這2種CBF2功能不同缺陷程度的突變體研究發(fā)現(xiàn),植株的抗凍性與CBF2基因表達量呈明顯的負相關(guān),CBF2基因表達量越弱,其植株的抗凍性越強,而且下游相關(guān)抗凍功能基因的表達也越高。更重要的是,這2種突變體抗凍性增強但植株開花時間和單株種子產(chǎn)量并沒有受到明顯改變,即使是cbf2-2突變體也是如此。開花時間和單株種子產(chǎn)量是農(nóng)作物的2個重要農(nóng)藝性狀,因此以上結(jié)果暗示著CBF2可以作為作物抗凍育種的候選理想靶基因。

在大多數(shù)作物中都存在CBF的同源基因[21],其中是否也擁有CBF調(diào)控子結(jié)構(gòu)，是否也存在這種抗凍負調(diào)控基因。因此，有必要進一步開展相關(guān)的研究工作,克隆作物中可能存在CBF2類的抗凍負調(diào)控基因,然后通過基因功能互補分析,驗證篩選出對應(yīng)的抗凍負調(diào)控基因,最后采用基因組編輯技術(shù)[28]敲除該基因并驗證其抗逆功能,創(chuàng)制出具有更高抗凍能力且其他農(nóng)藝性狀正常的植株,為作物抗凍育種提供優(yōu)良的親本材料。同時可以有效避免轉(zhuǎn)基因育種面臨的生物安全性評價和生產(chǎn)監(jiān)管問題[29]。

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Analysis and Identification of Two CBF2 Gene Mutants in Arabidopsis

LIU Xiaodong1,LIU Chao1,JIAO Binbin2,DAI Peihong1,SU Xiujuan1,LI Yue1

(1.College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Key Laboratory of Agricultural Biological Technology,Urumqi830052,China;2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai200135,China)

Cold stress is one of the major abiotic stress,which limits the geographical distribution and yield of crops.CBF regulon plays a major role in freezing tolerance.CBF2,one of the components of the CBF regulon,has a negative role in freezing tolerance.In this study,two SALK mutants whose T-DNA insertion are both within the promoter ofCBF2 gene,cbf2-1 andcbf2-2 were identified by qRT-PCR method.Results showed that the level ofCBF2 gene expression in the two mutants reduced.CBF2 gene expression was induced by low temperature incbf2-1 mutnat.However,the degree of induction was lower incbf2-1compared with the control.The effect of induction by low temperature was lost incbf2-2.Analysis of freezing tolerance showed that the less degree of induction,the stronger freezing tolerance of plants and the higher the expression of downstream cold-responsive genes.More important thing was that although freezing resistance of the twoCBF2 gene mutants were improved,their flowering time and seed yield per plant did not change significantly compared with the wild type plants.All the results indicate thatCBF2 may be an ideal candidate target gene for crop breeding of freezing tolerance by genome editing technology.

Arabidopsis;CBF2;Freezing tolerance;Negative regulation

2016-03-20

國家自然科學(xué)基金項目(31470289)

劉曉東(1975-)，男，新疆烏魯木齊人，副教授，博士，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。

李月(1984-)，女，河南許昌人，講師，博士，主要從事棉花分子生物學(xué)研究。

Q78

A

1000-7091(2016)04-0019-07

10.7668/hbnxb.2016.04.004