谷子糯質(zhì)基因共分離分子標記的研究

白　輝,李志勇,王永芳,石　燦,劉　磊,全建章,董志平

(河北省農(nóng)林科學院 谷子研究所,國家谷子改良中心,河北省雜糧研究實驗室,河北 石家莊　050035)

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谷子糯質(zhì)基因共分離分子標記的研究

白輝,李志勇,王永芳,石燦,劉磊,全建章,董志平

(河北省農(nóng)林科學院 谷子研究所,國家谷子改良中心,河北省雜糧研究實驗室,河北 石家莊050035)

為得到一種鑒別糯質(zhì)谷子的分子標記方法,用于優(yōu)質(zhì)谷子糯質(zhì)資源的利用及糯質(zhì)品種的選育。通過對糯性谷子十里香與梗性谷子豫谷1號配制的F2群體的F3種子胚乳進行碘液檢測,結(jié)果顯示:深藍色與棕紅色胚乳單株數(shù)的比例符合3∶1,說明糯質(zhì)對梗質(zhì)是由單基因控制的隱性性狀。利用糯質(zhì)分型引物對十里香基因組進行PCR擴增和產(chǎn)物測序,結(jié)果表明,十里香的糯性是由Ⅳ型糯質(zhì)基因控制,即由TSI-2轉(zhuǎn)座子插入到淀粉合成酶基因(Si006103m)內(nèi)元1形成。根據(jù)該糯質(zhì)基因設計出2對InDel標記引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R,擴增谷子基因組DNA,若waxy-TSI2/int1引物組合能擴增出984 bp的擴增片段,并且waxy-int1-1F/4R引物組合不能擴增出540 bp的擴增片段,則該材料為含Ⅳ型糯質(zhì)基因的糯質(zhì)谷子。最后,利用該標記組合從100份谷子資源中鑒定到2份屬于Ⅳ型糯質(zhì)基因控制的糯質(zhì)材料?？梢?該標記組合可以準確鑒別谷子Ⅳ型糯質(zhì)基因。

谷子;糯質(zhì)基因;分子標記;共分離

谷子,脫殼后稱小米,是一種營養(yǎng)豐富的食品,經(jīng)常食用小米對維持蛋白質(zhì)、氨基酸的代謝平衡均有重要的作用。小米主要物質(zhì)為淀粉,含量在75%左右,一般品種直鏈淀粉含量在12.8%以上,糯性品種直鏈淀粉含量為1.24%～7.00%。糯小米粒小,色淡黃或深黃,質(zhì)地較硬,糯小米淀粉分子量比普通小米小20多倍,食用消化率比普通小米高20%以上,在國外糯小米也被評為“營養(yǎng)之王”而列為“保健食品”。它還具有較高的粘滯性和良好的適口性,制成品有甜香味。加溫處理的糯小米淀粉具有較高的膨脹力和透明性,這些優(yōu)良特征賦予糯小米寶貴的價值和廣泛的用途[1-3]。

分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記和生化標記之后發(fā)展起來的一種新的較為理想的遺傳標記形式,近十幾年來發(fā)展非常迅速[4-6]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,分子標記已經(jīng)在遺傳育種改良研究中得到了廣泛的應用[7-17]。分子標記技術(shù)可以直接從分子水平對目標性狀進行選擇,結(jié)合田間表型選擇,可明顯提高對目標性狀選擇的準確性,從而加快選育優(yōu)秀品種的進程,縮短育種周期,降低育種成本。因此,分子標記技術(shù)已成為作物遺傳育種最重要的輔助手段之一。

十里香系優(yōu)質(zhì)糯性谷子資源,但其他農(nóng)藝性狀很差。豫谷1號系獲國家發(fā)明獎的優(yōu)良谷子品種,梗性品質(zhì)。由豫谷1號×(1066A不育材料×十里香)F4復合雜交選育而成的冀創(chuàng)1號(河北省農(nóng)林科學院谷子研究所植保室選育),是高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)糯性品種,其直鏈淀粉含量(占樣品干質(zhì)量)僅1.22%,在國內(nèi)谷子糯質(zhì)品種中含量處于最低水平,表明其為高糯質(zhì)品種[18]。目前已經(jīng)制成糯小米酒、糯小米醋、糯小米乳和粘糕等具有糯質(zhì)特色的小米加工產(chǎn)品。

冀創(chuàng)1號的選育過程歷經(jīng)15年,但是分子標記技術(shù)能夠?qū)δ繕嘶蜻M行快速選擇,為高效育種提供了非常有效的工具[8-11,19]。如果再以目標基因間的差異作為標記,可有效地避免分子標記與目標基因連鎖互換的問題,同時可以在苗期進行選擇,用PCR技術(shù)對DNA的質(zhì)量要求不高,而且實用性很強,從而明顯縮短了育種周期,也提高了選擇效率。為此,本試驗開發(fā)了可以對糯質(zhì)性狀進行基因型鑒定的共分離分子標記,為建立谷子糯質(zhì)基因鑒定的技術(shù)體系奠定了基礎,既明顯提高谷子糯質(zhì)育種進程,又促進谷物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1　材料和方法

1.1植物材料

谷子優(yōu)質(zhì)糯性資源十里香、梗質(zhì)品種豫谷1號及其雜交后代F1、F2(400株)材料均由河北省農(nóng)林科學院谷子研究所植保室保存。谷子種質(zhì)資源中100份記錄為糯質(zhì)的谷子材料,原產(chǎn)地包括河北、河南、北京、天津、湖北、甘肅、山西等地區(qū),上述材料為河北省農(nóng)林科學院谷子研究所植保室收集保存。

1.2糯質(zhì)性狀鑒定

F2中每份谷子材料隨機選取成熟籽粒15粒,分別置于小研缽中用杵子搗碎,加碘-碘化鉀溶液 30 μL,混勻樣品和溶液,觀察胚乳中淀粉顏色的變化。

100份記錄為糯質(zhì)的谷子材料中,每種材料各取5粒種子進行碘液染色,如果藍色與棕紅色都出現(xiàn),則再隨機選擇5粒進行染色觀察。

1.3基因組DNA的提取及PCR擴增

采用CTAB法[20]提取谷子葉片基因組DNA。NanoDrop ND-2000C測定其濃度,將樣品濃度稀釋為100 ng/μL。

waxy-TSI2/int1標記的引物核苷酸序列是:上游引物5′-GAAGTGGAGGATACTGATGGG-3′,下游引物5′-GGATTTGACTGCATGAAAATG-3′;waxy-int1-1F/4R標記的引物核苷酸序列是:上游引物5′-CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG-3′,下游引物5′-AGTG GGTTCGATGTTTGAAC-3′。

以提取的基因組DNA為模板,按下列反應體系進行PCR:

引物對waxy-TSI2/int1和引物對waxy-int1-1F/4R的PCR反應體系(20 μL)為:100 ng基因組DNA模板2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、10×PCR Buffer 2 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL，TaqDNA聚合酶 0.3 μL，補純水至20 μL。PCR擴增程序為:95 ℃,4 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 35～60 s,35個循環(huán);72 ℃,延伸10 min。

引物對ex1/ex2、ex2int2/ex4r、M5/R7和M7/R10的PCR反應體系(20 μL)為:100 ng基因組DNA模板2 μL、2.5 μmol/L dNTPs 3.2 μL、10× LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+Plus)2 μL、10 μmol/L 上下游引物各2 μL，LATaqDNA聚合酶 0.2 μL，補純水至20 μL。PCR擴增程序為:94 ℃ 1 min;98 ℃ 15 s,68 ℃ 10 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

2　結(jié)果與分析

2.1糯質(zhì)遺傳分析群體

從谷子種質(zhì)資源中選出優(yōu)質(zhì)糯谷子十里香,將其與梗質(zhì)谷子品種豫谷1號配制正反交雜交組合F1。收獲正反交F1后再自交,構(gòu)建糯質(zhì)基因的F2分離群體,在五葉期之前取葉片以提取基因組DNA,并收獲F3種子。利用I2-KI溶液對400份F2單株的種子胚乳中淀粉進行顏色反應,碘遇直鏈淀粉變深藍色,否則變棕紅色。F3種子胚乳顏色出現(xiàn)深藍色和棕紅色的分離,包括3種情況:15個籽粒胚乳全部變藍,全部變棕紅色,或者部分藍色部分棕紅色,藍色明顯多于棕紅色,如表1所示。F3種子的胚乳性質(zhì)由F2基因型決定,出現(xiàn)深藍色胚乳的單株數(shù)與棕紅色胚乳單株數(shù)的比例符合3∶1,說明糯質(zhì)對梗質(zhì)是由單基因控制的隱性性狀。

表1　F2梗糯表型統(tǒng)計表

2.2十里香糯質(zhì)基因型的鑒定

Kawase等[21-23]認為糯質(zhì)基因waxy是由于轉(zhuǎn)座子插入到基因GBSS1(編碼顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶)后,造成基因低表達或不表達從而減弱或喪失功能引起的。根據(jù)插入的轉(zhuǎn)座子類型及插入位點的不同,糯質(zhì)基因可以分為7種類型。根據(jù)文獻[21]提供的區(qū)分糯質(zhì)類型的4對引物序列(ex1與ex2、ex2int2與ex4r、M5與R7、M7與R10,序列未附),合成該4對引物,分別在親本十里香和豫谷1號基因組DNA中進行PCR擴增(圖1),只有ex1/ex2引物組合對谷子父本糯質(zhì)十里香與母本梗質(zhì)豫谷1號的基因組DNA擴增產(chǎn)物不同(其他3組引物擴增產(chǎn)物均相同),前者擴增片段在5 kb左右,后者擴增片段是828 bp。通過對父本PCR產(chǎn)物部分測序證實,擴增片段序列與gi|62318482|dbj|AB210215.1| Setaria italica GBSS1 gene,transposable element TSI-2 in intron 1完全匹配,說明十里香屬于Ⅳ型糯質(zhì)基因[24],是由TSI-2轉(zhuǎn)座子插入到淀粉合成酶基因(Si006103m)內(nèi)元1形成的,TSI-2轉(zhuǎn)座子大小是5 251 bp。

2.3谷子Ⅳ型糯質(zhì)基因共分離分子標記的開發(fā)

利用轉(zhuǎn)座子TSI-2序列和Si006103m內(nèi)元1序列,設計1對InDel標記引物waxy-TSI2/int1,可以鑒別出Ⅳ型糯質(zhì)純合隱性和雜合顯性基因型;利用TSI-2插入位點所在的內(nèi)元1序列,又設計了1對InDel標記引物waxy-int1-1F/4R,可以鑒別梗質(zhì)純合和雜合基因型,即2對引物同時使用能夠排除Ⅳ型糯質(zhì)基因型中雜合基因型的干擾(圖2)。waxy-TSI2/int1標記引物能夠在父本十里香中擴增出984 bp條帶,母本豫谷1號中沒有擴增條帶;waxy-int1-1F/4R標記引物能夠在母本中擴增出540 bp條帶,父本中沒有擴增條帶。如果使用該2組InDel標記引物檢測谷子DNA,waxy-TSI2/int1引物能擴增出984 bp條帶,waxy-int1-1F/4R引物不能擴增出條帶,說明該谷子是含有純合Ⅳ型糯質(zhì)基因的糯性材料(表2)。此外,2對標記擴增結(jié)果一有一無,增加了結(jié)果的可靠性和準確性。

M.DL2000 Marker;P1.父本十里香;P2.母本豫谷1號。M.DL2000 Marker;P1.Shilixiang;P2.Yugu 1.

黑框.Si006103m基因的外元;黑線條.Si006103m基因的內(nèi)元。

表2　共分離InDel標記的基因型與表現(xiàn)型列表

注:+.標記引物能擴增出條帶;-.標記引物不能擴增出條帶。

Note:+.The labeled primers could amplify bands;-.The labeled primers couldn′t amplify bands.

2.4共分離標記在F2中的檢測

利用CTAB方法提取十里香與豫谷1號的400份F2各單株的基因組DNA,利用2組InDel標記引物進行PCR,擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析,部分檢測結(jié)果如圖3所示,發(fā)現(xiàn)該標記與糯質(zhì)性狀共分離,能對糯質(zhì)隱性基因型、梗質(zhì)純合和雜合顯性基因型進行準確鑒別。標記基因型為WxWx,F3種子胚乳中淀粉遇碘全部變深藍色;標記基因型為Wxwx,籽粒淀粉遇碘變藍或棕紅色,比例為3∶1;標記基因型為wxwx,籽粒淀粉遇碘全部變棕紅色,與十里香表現(xiàn)完全一致。標記基因型WxWx∶Wxwx∶wxwx符合1∶2∶1的分離比例。

M.DL2000 Marker;P1.父本十里香;P2.母本豫谷1號;1～14.F2的部分單株;上板是waxy-TSI2/int1檢測結(jié)果;下板是waxy-int1-1F/4R檢測結(jié)果。

M.DL2000 Marker;P1.Shilixiang;P2.Yugu 1;1-14.Some single plants from the F2;The upper plate is the detection result of waxy-TSI2/int1;The lower plate is the detection result of waxy-int1-1F/4R.

圖3標記引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R對F2擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

Fig.3The electrophoresis result of PCR products amplified by the F2using the waxy-TSI2/int1 and waxy-int1-1F/4R primers

2.5共分離標記在谷子資源中的檢測

利用本試驗開發(fā)的共分離標記對收集的100份谷子材料進行了分析,部分檢測結(jié)果如圖4所示,其中只有2份材料利用waxy-TSI2/int1標記引物能夠擴出984 bp的擴增片段,而利用waxy-int1-1F/4R標記引物沒有擴增產(chǎn)物,并且這2份材料的種子胚乳經(jīng)碘液檢測全部變?yōu)樽丶t色,說明這2份材料屬于Ⅳ型糯質(zhì)基因控制的糯質(zhì)材料。可見,該標記組合可以準確鑒別Ⅳ型糯質(zhì)基因。

3　討論

谷子的Waxy基因編碼顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶(GBSS1),決定谷子胚乳和花粉中的直鏈淀粉合成。普通谷子(WxWx)籽粒中的淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。糯谷子(wxwx)籽粒中含有少量或不含直鏈淀粉,幾乎全部由支鏈淀粉組成[21,25]。因為不同轉(zhuǎn)座子[22]插入GBSS1基因序列的不同位點,Waxy基因突變成各種不同的等位基因,減弱或消除了GBSS1基因的表達,對其編碼蛋白顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶的酶活影響為5%～95%,從而形成糯質(zhì)(waxy)或低淀粉含量(Low-amylose)性狀[21]。根據(jù)插入的轉(zhuǎn)座子類型及插入位點的不同,糯質(zhì)基因可以分為7種類型,插入轉(zhuǎn)座子的大小從1～9 kb不等,插入位點也包括了內(nèi)元區(qū)或外元區(qū)[21]。

經(jīng)過15年的傳統(tǒng)育種試驗工作,河北省農(nóng)林科學院谷子所植保室將谷子資源十里香的優(yōu)質(zhì)糯性完全轉(zhuǎn)移到高產(chǎn)、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的育成品種冀創(chuàng)1號上,目前,后者以其優(yōu)質(zhì)的糯性在食品加工領(lǐng)域潛力無限[13]。為了更好更快地將該糯性基因應用到育種領(lǐng)域,培育更多的優(yōu)質(zhì)糯性品種,進行了分子標記輔助選擇育種的嘗試。基于十里香含有Ⅳ型糯質(zhì)基因,本試驗的目的就是開發(fā)一種基于PCR的實用經(jīng)濟型標記,可以有效地從谷子材料中鑒定出含Ⅳ型糯質(zhì)基因的糯質(zhì)谷子,用于谷子糯質(zhì)資源的利用及糯質(zhì)品種的選育,所開發(fā)標記為waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R。用這2對特異擴增谷子糯質(zhì)基因的共分離InDel標記引物擴增谷子的基因組DNA,若waxy-TSI2/int1引物組合能擴增出984 bp的擴增片段,并且waxy-int1-1F/4R引物組合不能擴增出540 bp的擴增片段,則該材料為含Ⅳ型糯質(zhì)基因的糯質(zhì)谷子。2對標記擴增結(jié)果一有一無,增加了結(jié)果的可靠性和準確性。由于該標記是基于Ⅳ型糯質(zhì)基因而設計的共顯性分子標記,可以進行基因型鑒定,即可以對糯質(zhì)純合基因型和梗質(zhì)雜合基因型進行鑒別。該InDel標記的優(yōu)點還在于對PCR模板質(zhì)量要求不高,對TaqDNA聚合酶要求不高,只要能擴增出條帶即可。

此外,谷子種質(zhì)資源庫中記錄的糯質(zhì)資源大部分都是通過手搓籽粒的感覺和經(jīng)驗來判斷,并沒有嚴格的標準,利用I2-KI溶液檢測糯質(zhì)資源籽粒時發(fā)現(xiàn)部分材料是梗質(zhì)或雜合不純,結(jié)果在本研究中也證實了這一點。另外,I2-KI溶液檢測方法只能判斷出該品種是糯或梗,具體糯質(zhì)類型并不能判斷,所以也不好加以利用;而且,在選育糯質(zhì)品種時雜交當代不穩(wěn)定,種子數(shù)量有限,如果利用I2-KI直接來篩選非常不可取。所以,開發(fā)優(yōu)質(zhì)糯性基因的分子標記作為糯質(zhì)資源篩選或糯質(zhì)品種選育的輔助手段,既方便簡單,又縮短了常規(guī)育種的時間[18,26]。

M.DL2000 Marker;P1.父本十里香;P2.母本豫谷1號;1～2和17～29.糯質(zhì)谷子;3～16.梗質(zhì)谷子;30～31.不純谷子;上板是waxy-TSI2/int1檢測結(jié)果;下板是waxy-int1-1F/4R檢測結(jié)果;1～2.共2份糯質(zhì)材料帶型一致,含有Ⅳ型糯質(zhì)基因;3～16.共14份梗質(zhì)材料帶型一致;17～27.共11份糯質(zhì)材料沒有擴增條帶；28～29.共2份糯質(zhì)材料帶型一致,均不含Ⅳ型糯質(zhì)基因;30～31.共2份不純材料帶型一致,均是雜合子基因型。

M.DL2000 Marker;P1.Shilixiang;P2.Yugu 1;1-2 and 17-29.Waxy foxtail millet;3-16.Non-waxy foxtail millet;30-31.Impure foxtail millet;The upper plate is the detection result of waxy-TSI2/int1;The lower plate is the detection result of waxy-int1-1F/4R;1-2.2 waxy materials containing the type Ⅳwaxygene;3-16.14 non-waxy materials with the same bands;17-27.11 waxy materials without bands；28-29.2 waxy materials with the same bands,both of them don′t contain the type Ⅳwaxygene;30-31.2 impure materials containing the heterozygouswaxygene.

圖4標記引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R對31份谷子材料擴增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.4The agarose electrophoresis result of PCR products amplified by the thirty-one materials of foxtail millet using the waxy-TSI2/int1 and waxy-int1-1F/4R primers

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Research on Co-segregated Molecular Markers of waxy Gene in Foxtail Millet

BAI Hui,LI Zhiyong,WANG Yongfang,SHI Can,LIU Lei,QUAN Jianzhang,DONG Zhiping

(Institute of Millet Crops,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,National Foxtail Millet Improvement Center,Minor Cereal Crops Laboratory of Hebei Province,Shijiazhuang050035,China)

The study provided a molecular marker technology to identify the waxy foxtail millet,which could be used to utilize the excellent waxy resources of foxtail millet and to breed the waxy varieties.Firstly,through the iodine solution detection of the F3seeds endosperm from F2constructed from the hybridization of waxy foxtail millet,Shilixiang,and non-waxy foxtail millet,Yugu 1.Results showed that the ratio of plant numbers with dark blue and brownish red endosperm was 3∶1,indicated that the waxy phenotype was a recessive trait controlled by a single gene.Then using waxy genotyping primers,the genomic DNA of Shilixiang was amplified by PCR and the products were sequenced.The results showed that the waxy trait was controlled by a Ⅳ type waxy gene,namely a TSI-2 transposon was inserted into the first intron of the starch synthase gene (Si006103m).Therefore,the InDel molecular markers,waxy-TSI2/int1 and waxy-int1-1F/4R,were developed based on the gene sequence of Si006103m,and then the genomic DNA of foxtail millet was amplified by them.If there was an product with 984 bp amplified by the waxy-TSI2/int1 primer and no product with 540 bp amplified by the waxy-int1-1F/4R primer,the material was identified as a waxy foxtail millet containing the type Ⅳwaxygene.Furthermore,we identified 2 waxy materials controlled by the Ⅳ typewaxygene from 100 foxtail millet resources using two pairs of waxy primers.Therefore,the InDel markers can be used to accurately identify the Ⅳ typewaxygene from foxtail millet.

Foxtail millet;waxygene;Molecular marker;Co-segregated

2016-03-11

國家現(xiàn)代谷子糜子產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設項目(CARS-07-12.5-A8);科技部“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2011BAD06B01-1)

白輝(1980-),女,河北石家莊人,副研究員,博士,主要從事谷子抗病分子生物學研究。

董志平(1964-),女,河北邢臺人,研究員,碩士,主要從事谷子病害研究。

全建章(1964-),男,河北石家莊人,研究員,碩士,主要從事谷子種質(zhì)資源和育種研究。

S515.03;S326;Q78

A

1000-7091(2016)04-0007-06

10.7668/hbnxb.2016.04.002