達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞消化分離和超低溫冷凍保存

頡　璇,厲　萍,席萌丹,3,郭　威,3,喬新美,杜　浩,劉志剛,危起偉,3

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶　400715；2.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢　430223；3.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢　430072)

?

達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞消化分離和超低溫冷凍保存

頡璇1,2,厲萍2,席萌丹2,3,郭威2,3,喬新美2,杜浩2,劉志剛2,危起偉1,2,3

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715；2.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢430223；3.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072)

通過研究?jī)煞N酶對(duì)精巢細(xì)胞的消化效果，探究抗凍劑、降溫程序、糖類和卵磷脂對(duì)達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)精巢細(xì)胞凍存效果的影響，獲得消化凍存后高存活率的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)使用0.25%胰蛋白酶和2 mg/mL膠原酶 H+500 U/mL中性酶II的組合酶對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞進(jìn)行消化，獲得不同消化時(shí)間內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)量。另外，還研究了冷凍稀釋液中分別添加10% 二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甲醇(MET)作為抗凍劑，采用-1 ℃/min慢速降溫以及直接投入液氮中的快速降溫方法凍存，冷凍稀釋液采用D-海藻糖或同濃度D-蔗糖，以及添加5%、8%、11%卵磷脂對(duì)凍存效果的影響。結(jié)果顯示：兩種消化酶在同一時(shí)間消化所得的活細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞率無(wú)顯著差異，并且都在3 h獲得最多活細(xì)胞。慢速降溫的凍存效果極顯著地好于快速降溫(P=0.01)。不同抗凍劑的保存效果差異顯著，復(fù)蘇后細(xì)胞相對(duì)存活率EG(51.70%±5.24%)>MET(45.09%±3.15%)>DMSO(40.18%±3.90%)。不同糖對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞凍存效果無(wú)顯著影響；不同濃度的卵磷脂凍存效果有極顯著差異。含8%卵磷脂的凍存液對(duì)細(xì)胞的凍存效果最好，細(xì)胞存活率可達(dá)(93.55±2.56)%，培養(yǎng)10 d后細(xì)胞數(shù)目為0 d時(shí)的3.19倍。

達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)；胰蛋白酶；冷凍保存；抗凍劑；卵磷脂

達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)屬鱘形目鱘科鱘屬，又名沙臘子、長(zhǎng)江鱘，是我國(guó)特有物種，為淡水定居性鱘魚類[1]，主要分布于金沙江下游及長(zhǎng)江上游，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值。近30年來(lái)，由于葛洲壩工程的興建以及長(zhǎng)江上游的環(huán)境污染、過度捕撈等原因，達(dá)氏鱘的資源已極為稀少[2-3],1990年以來(lái)未發(fā)現(xiàn)其自然繁殖，物種以人工群體維持延續(xù)，亟待加強(qiáng)其保護(hù)及其相關(guān)研究。

魚類種質(zhì)資源保護(hù)和利用的策略包括個(gè)體水平以及細(xì)胞水平上的遺傳保護(hù)。目前魚類精子的超低溫保存技術(shù)已較為成熟，近年有關(guān)其他種質(zhì)細(xì)胞的研究也逐步深入，其中有不少學(xué)者將研究集中于魚類生殖細(xì)胞的體外保存，與細(xì)胞移植技術(shù)結(jié)合，為魚類種質(zhì)細(xì)胞的保存開辟了新的領(lǐng)域[4]。由于達(dá)氏鱘個(gè)體較大，性成熟時(shí)間長(zhǎng)，因此養(yǎng)殖成本較高，通過對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的保存可以有效地降低成本；此外，保存達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞可以保護(hù)達(dá)氏鱘的遺傳多樣性，同時(shí)還可借助同種生殖細(xì)胞移植技術(shù)產(chǎn)生具有遺傳多樣性的可育后代，應(yīng)用于保種和人工增殖放流。

對(duì)于細(xì)胞的超低溫冷凍保存研究，在哺乳動(dòng)物中，目前已經(jīng)有胚胎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞及生殖細(xì)胞凍存的報(bào)道[5-9]。在魚類中，丁鱥[10]、虹鱒[11]等魚類成功地保存了生殖細(xì)胞。目前，有學(xué)者研究了西伯利亞鱘精原細(xì)胞與卵原細(xì)胞的分離保存方法[12]，將分離后的細(xì)胞移植入小體鱘體內(nèi)并成功增殖[13]，而對(duì)于達(dá)氏鱘種質(zhì)細(xì)胞保存等方面的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)研究了兩種酶對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的消化效果，并從抗凍劑、降溫程序、糖類和卵磷脂四個(gè)角度探討了最適宜達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的冷凍保存方案。為鱘魚類精巢細(xì)胞的體外保存提供有效的理論依據(jù)和技術(shù)方案，為達(dá)氏鱘的生殖細(xì)胞移植做必要準(zhǔn)備。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用達(dá)氏鱘來(lái)自長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所荊州市太湖中華鱘養(yǎng)殖基地。所用精巢樣本采集自20—24月齡雄性達(dá)氏鱘，該年齡的達(dá)氏鱘精巢處于II期末期。共12尾，體質(zhì)量為( 6.27±0.83) kg；全長(zhǎng)為( 107.33±2.11) cm。

1.2主要試劑

胰蛋白酶粉末(Worthington)；2.5% 胰蛋白酶-EDTA (Gibco)；膠原酶H(Roche)；D-海藻糖(Biosharp)；胎牛血清(FBS,四季青)；二甲基亞砜(DMSO,Wako)；Dipsae II，L-15 培養(yǎng)液，DNase I，D-蔗糖，卵磷脂，牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)自Sigma公司。表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)自普飛生物。甲醇(MET)、乙二醇(EG)為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3溶液配制

(1)冷凍稀釋液I：50 mmol/L D-海藻糖，5 mg/mL BSA，200 mL/L胎牛血清，溶于PBS (pH 8.0)；再加入青霉素 200 units/mL，鏈霉素 20 mg/L，兩性霉素B 50 mg/L；于0.2 μm過濾滅菌。

冷凍稀釋液II：50 mmol/L D-蔗糖，5 mg/mL BSA，200 mL/L胎牛血清，溶于PBS (pH 8.0)；再加入青霉素 200 units/mL，鏈霉素 20 mg/L，兩性霉素B 50 mg/L；于0.2 μm過濾滅菌。

(2)消化酶溶液：

a.5% 胰蛋白酶溶液 50 μL；胎牛血清 50 μL；膠原酶 H 100 μL；1% DNaseI 50 μL ；L-15培養(yǎng)液 750 μL，制成1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液。于0.2 μm無(wú)菌過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配。

B.50 μL 40 mg/mL膠原酶H，50 μL 10 000 U/mL 中性酶II，900 μL L-15 培養(yǎng)液；制成1 mL 2 mg/mL膠原酶 H+500 U/mL中性酶II組合酶溶液。于0.2 μm無(wú)菌過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4方法

1.4.1達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞懸液制備

將雄性達(dá)氏鱘魚體全身消毒，帶入無(wú)菌間。迅速摘取無(wú)菌雙側(cè)精巢，置于盛有適量磷酸緩沖液(PBS,pH7.2～7.4)和抗生素(青霉素、鏈霉素及兩性霉素B)的培養(yǎng)皿中；剝?nèi)ソM織外膜和血管，將精巢組織剪碎至1 mm3小塊。精巢組織塊用L-15培養(yǎng)液加抗生素反復(fù)清洗，1 000 r/min，4 ℃離心5 min；重復(fù)清洗三次以上。將精巢組織放入事先稱重的離心管內(nèi)稱重，以組織塊∶消化液=1∶4(w/v)分別加入胰蛋白酶溶液及組合酶溶液，將其移至六孔板內(nèi)，分別放置于20 ℃和25 ℃(分別為0.25%胰蛋白酶和組合酶的最適溫度)培養(yǎng)箱中消化，每30 min吹打一次。消化2、3、4、5 h時(shí)加入胎牛血清終止消化，40 μm濾網(wǎng)過濾；濾液以1 000 r/min，4 ℃離心5 min。再用1 mL L-15+20% FBS溶液重懸細(xì)胞。并于顯微鏡下測(cè)定細(xì)胞活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，用于實(shí)驗(yàn)的雄性達(dá)氏鱘6尾。

1.4.2細(xì)胞存活率測(cè)定

取少量細(xì)胞懸液和0.4% 臺(tái)盼藍(lán)溶液1∶1(v/v)混合后，顯微鏡下(40×,Leica,Germany)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)細(xì)胞總數(shù)以及細(xì)胞存活率。

1.4.3細(xì)胞凍存

(1)抗凍劑和降溫方法篩選

在冷凍稀釋液I中分別添加10% DMSO，10% EG及10% MET作為抗凍劑，制成三種細(xì)胞冷凍保存液。設(shè)置兩種降溫程序：Cryo-I：慢速降溫：冰上平衡15 min，然后使用程序降溫盒，以1 ℃/min的速率降溫至-80 ℃，在-80 ℃停留30 min，投入液氮中。Cryo-II：快速降溫：冰上平衡15 min，然后直接投入液氮中。將以上三種細(xì)胞冷凍保存液和兩種降溫程序兩兩配伍，共設(shè)置6種保存方法。將精巢組織用0.25%胰酶消化2 h，檢測(cè)細(xì)胞活率后重新離心，用細(xì)胞冷凍保存液以1×105個(gè)/mL重懸細(xì)胞，分裝至凍存管中，再分別用兩種降溫方式凍存。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本保存3管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用于實(shí)驗(yàn)的雄性達(dá)氏鱘3尾。

(2)糖和卵磷脂濃度篩選

在冷凍稀釋液I和冷凍稀釋液II中分別添加10% EG。制成兩種細(xì)胞冷凍保存液。在冷凍保存液中分別添加0%(空白對(duì)照)，5%，8%，11% 卵磷脂，于0.2 μm過濾除菌。將以上兩種細(xì)胞冷凍保存液和4個(gè)濃度的卵磷脂兩兩配伍，共設(shè)置8種保存方法。將精巢組織用0.25%胰酶消化2 h，檢測(cè)細(xì)胞活率后重新離心，用細(xì)胞冷凍保存液以1×105個(gè)/mL重懸細(xì)胞，分裝至凍存管中。冰上平衡15 min，然后使用程序降溫盒，以1 ℃/min的速率降溫至-80 ℃，在-80 ℃停留30 min，投入液氮中。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本保存3管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用于實(shí)驗(yàn)的雄性達(dá)氏鱘3尾。

1.4.4細(xì)胞復(fù)蘇及復(fù)蘇率測(cè)定

從液氮中取出冷凍管，迅速放置于37 ℃水浴35 s，使其恰好融化，用適量L-15+10% FBS離心清洗細(xì)胞3次(1000 r，4 ℃離心5 min)；顯微鏡下臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活率，觀察復(fù)蘇細(xì)胞形態(tài)，每次取樣統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)不低于800個(gè)。并將上述實(shí)驗(yàn)方案細(xì)胞存活率最高的復(fù)蘇后接種于12孔板中，L-15+20% FBS+25 ng/mL EGF+25 ng/mL bFGF作為培養(yǎng)液，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)中，不同酶對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的消化效果結(jié)果采用t-檢驗(yàn)(t-test)分析；降溫方式、抗凍劑、糖及卵磷脂對(duì)精巢細(xì)胞凍存效果的研究采用雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均應(yīng)用spss 19.0軟件執(zhí)行。

2　結(jié)果

2.1不同酶對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的消化效果

兩種酶在不同時(shí)間的消化效果如表1。通過t檢驗(yàn)分析，0.25% 胰蛋白酶和膠原酶+中性酶的組合酶在同一時(shí)間消化獲得的活細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。兩種酶均在精巢組織被消化3 h可獲得最多的活細(xì)胞。

2.2降溫方法和抗凍劑對(duì)細(xì)胞活率的影響

學(xué)生要提高自我約束的能力。[4]高職院校管理相對(duì)高中較為松散，而學(xué)生的自我控制能力較差，容易導(dǎo)致整體學(xué)習(xí)積極性不高，學(xué)習(xí)風(fēng)氣差。因此，學(xué)校要加強(qiáng)管理，學(xué)生要強(qiáng)化自我約束意識(shí)，加強(qiáng)紀(jì)律觀念，時(shí)刻銘記校風(fēng)校紀(jì)，并以校風(fēng)校紀(jì)約束自己。

對(duì)降溫方法、抗凍劑進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果顯示，降溫方法、抗凍劑交互作用不顯著(P>0.05)，兩種降溫方法對(duì)凍存細(xì)胞存活率的影響差異極顯著(P<0.05)，三種抗凍劑對(duì)細(xì)胞的保存效果也具有顯著差異(P<0.05)；從表2可看出，使用慢速降溫法的細(xì)胞存活率都高于使用快速降溫法的細(xì)胞；其中，EG作為抗凍劑保存的細(xì)胞凍存效果最好；復(fù)蘇后活細(xì)胞率為凍存前活細(xì)胞率的(51.70±5.24)%；而MET作為抗凍劑凍存的效果差于EG，DSMO的凍存效果最差。使用DMSO、EG、MET作為抗凍劑，通過快速降溫法保存的細(xì)胞相對(duì)存活率較低。顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用慢速降溫復(fù)蘇后的細(xì)胞多數(shù)呈現(xiàn)透明、圓形飽滿良好的活細(xì)胞形態(tài)，而采用快速降溫保存的細(xì)胞復(fù)蘇后形態(tài)都有不同程度的破壞，細(xì)胞發(fā)生變形、破碎。

表1　不同酶消化達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)量Tab.1　The quantity of living cells digested with two different types of enzymes.

注：圖中顯示數(shù)據(jù)表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)。兩種酶消化效果無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2　不同抗凍劑和降溫方式保存細(xì)胞相對(duì)存活率 (n=3)Tab.2　Relative percentage of living cells cryopreserved by different cryoprotectants and freezing rate (n=3)

注：如圖所示細(xì)胞相對(duì)存活率±標(biāo)準(zhǔn)差；雙因素方差分析得出降溫方法、抗凍劑交互作用不顯著(P>0.05)，不同降溫方法對(duì)凍存細(xì)胞存活率的影響差異極顯著(P≤0.01)，不同抗凍劑對(duì)細(xì)胞的保存效果具有顯著差異(P<0.05)。

2.3糖和卵磷脂濃度對(duì)精巢細(xì)胞活率的影響

將細(xì)胞復(fù)蘇后檢測(cè)細(xì)胞活率，通過雙因素方差分析(two-way ANOVA)顯示，糖和卵磷脂交互作用顯著(P<0.05)。冷凍稀釋液中添加海藻糖與添加蔗糖的保存效果差異不顯著(P>0.05)，而不同濃度卵磷脂的添加對(duì)細(xì)胞凍存的影響差異極顯著(P<0.01)。從表3可看出，冷凍稀釋液使用海藻糖并添加8%的卵磷脂時(shí)，保存效果最好，細(xì)胞相對(duì)存活率可達(dá)(93.55±2.56)%。

表3　不同糖和卵磷脂濃度保存細(xì)胞相對(duì)存活率 (n=3)Tab.3　Relative percentage of living cells cryopreserved by different sugars and concentration of lecithin (n=3)

注：如圖所示細(xì)胞相對(duì)存活率±標(biāo)準(zhǔn)差；雙因素方差分析得出糖、卵磷脂濃度交互作用顯著(P<0.05)，不同糖對(duì)凍存細(xì)胞存活率的影響差異不顯著(P>0.05)，不同濃度卵磷脂的添加對(duì)細(xì)胞凍存的影響差異極顯著(P<0.01)。

冷凍稀釋液使用海藻糖時(shí)，添加卵磷脂的凍存效果普遍好于未添加卵磷脂組。用含11%卵磷脂的細(xì)胞保存液凍存細(xì)胞，細(xì)胞相對(duì)存活率低于含8%卵磷脂組。

冷凍稀釋液使用蔗糖，添加8%卵磷脂凍存細(xì)胞時(shí)凍存效果最好，復(fù)蘇后的細(xì)胞活率是凍存前的(90.78±1.36)%；用含11%卵磷脂的細(xì)胞保存液凍存細(xì)胞，細(xì)胞相對(duì)存活率低于含8%卵磷脂組。顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，可見復(fù)蘇后添加卵磷脂的處理組細(xì)胞大多都狀態(tài)良好，呈現(xiàn)活細(xì)胞形態(tài)，復(fù)蘇培養(yǎng)2 d后，可見細(xì)胞分裂增殖，細(xì)胞數(shù)目增多。將添加8%卵磷脂的海藻糖組細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，10 d后細(xì)胞總數(shù)為0 d時(shí)的3.19倍(圖1)。

圖1　復(fù)蘇后培養(yǎng)的精巢細(xì)胞Fig.1　Testicular cells cultured after thawing A.復(fù)蘇培養(yǎng)0 d的精巢細(xì)胞；B.復(fù)蘇培養(yǎng)10 d的精巢細(xì)胞

3　討論

3.1不同酶對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的消化效果

采用適當(dāng)?shù)某绦蚣跋椒ㄒ彩侵苽淞己脝渭?xì)胞懸液的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。檢驗(yàn)不同種類的酶和不同消化時(shí)間對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的消化效果的影響，可為精原細(xì)胞的純化做準(zhǔn)備，得到高活率的細(xì)胞是純化后實(shí)現(xiàn)精原細(xì)胞高存活率的保證。

目前，分離各種動(dòng)物細(xì)胞普遍采用胰蛋白酶、膠原酶或幾種酶的組合。在魚類中，Lacerda 等[14]用膠原酶、胰蛋白酶和DNase I組合酶消化尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)精巢細(xì)胞，再梯度離心分離精原細(xì)胞，最后得到的細(xì)胞活細(xì)胞率較高。Shikina等[11]同樣用胰蛋白酶、膠原酶、中性酶及其組合酶分離虹鱒(Oncorhynchusmykiss)精巢細(xì)胞，得到的細(xì)胞通過原代培養(yǎng)仍可增殖。Linhartova 等[10]用0.1% 膠原酶和胰蛋白酶消化分離丁鱥(Tincatinca)性腺，并通過Percoll 密度梯度離心純化精原細(xì)胞。王愛珍[15]對(duì)吉富羅非魚精原細(xì)胞分離培養(yǎng)的研究中，分別用0.1%膠原酶IV，0.25%胰蛋白酶，0.04% EDTA·Na2及其組合酶消化吉富羅非魚精巢，其中經(jīng)過胰蛋白酶消化活細(xì)胞率最高，為86.60%。

本研究采用的是0.25% 胰蛋白酶和膠原酶與中性酶的組合酶消化達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種酶消化相同重量的精巢組織時(shí)，可獲得的活細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異，但這兩種酶消化所得的細(xì)胞數(shù)會(huì)隨時(shí)間變化。由此可見，兩種酶的消化效果都比較溫和，經(jīng)過2～3 h才可獲得最多的活細(xì)胞。因此在消化過程中膠原酶與中性酶的組合酶對(duì)精巢細(xì)胞的損傷較小。但是由于組合酶消化過程耗時(shí)較長(zhǎng)，而且組合酶中的膠原酶價(jià)格昂貴，而采用胰蛋白酶分離精巢細(xì)胞不僅得到的活細(xì)胞率高、操作方便，而且消化時(shí)間相對(duì)較短。

3.2不同冷凍方案的凍存效果比較

影響細(xì)胞凍存效果的因素主要有抗凍劑、降溫方式及冷凍稀釋液種類[16]?？箖鰟儆跐B透性冷凍保護(hù)劑，近年來(lái)常用的抗凍劑有DMSO、EG、MET及甘油(GLY)。滲透性冷凍保護(hù)劑對(duì)不同物種的保存效果存在很大的差異，因此選擇恰當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑對(duì)其冷凍保存效果至關(guān)重要[17]。Yoshizaki等[4]采用1.8 mol/L EG，0.5% BSA，5.5 mmol/L D-葡萄糖作為凍存液保存虹鱒生殖細(xì)胞，復(fù)蘇后存活率為45.4%。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)幾種抗凍劑對(duì)精巢細(xì)胞凍存的研究，結(jié)果顯示，用EG的冷凍效果最好，可達(dá)(51.70±5.24)%。有研究顯示EG也是西伯利亞鱘生殖細(xì)胞的最佳抗凍劑，用1.5 mol/L EG，0.5% BSA，5.5 mmol/L D-葡萄糖保存西伯利亞鱘生殖細(xì)胞，復(fù)蘇率為61.75%[5]?？梢妼?duì)于鱘來(lái)說，EG可能是較為合適的細(xì)胞抗凍劑。

降溫速率直接關(guān)系到冷凍效果，降溫速率過快或過慢都會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷。不同的組織細(xì)胞中均有一個(gè)存活率最高的冷凍速率范圍，稱為“適宜冷凍速率”[18]。本研究選擇了緩慢冷凍法和快速冷凍法兩種降溫方式，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種方法差異較大，通過慢速冷凍的手段可得到較高的細(xì)胞復(fù)蘇率?？梢?1 ℃/min 對(duì)于達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞來(lái)說是較為適宜的降溫速率。Linhartova等[10]對(duì)丁鱥原始生殖細(xì)胞凍存的研究，同樣采用-1 ℃/min的降溫速率降至-80 ℃可獲得較好的凍存效果(57.69±16.85)%。

糖類，例如海藻糖和蔗糖，屬于非滲透保護(hù)劑，添加糖類的凍存液配方可顯著提高多種類型細(xì)胞的凍存效果，包括胚胎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞及生殖細(xì)胞[5-8]。Aurich等[19]認(rèn)為，動(dòng)物細(xì)胞膜中含有的卵磷脂具有親脂親水的特性，細(xì)胞凍存液中添加卵磷脂，可以有效保持水分不至過多流失，提供能源，從而保護(hù)細(xì)胞減少冷凍傷害。本文對(duì)于細(xì)胞凍存液的進(jìn)一步研究顯示，含海藻糖或蔗糖的冷凍稀釋液在凍存達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞時(shí)無(wú)顯著差異，在相同卵磷脂濃度下，復(fù)蘇后的相對(duì)存活率差異較??；0%卵磷脂的蔗糖組細(xì)胞相對(duì)存活率最低，添加8%卵磷脂時(shí)，細(xì)胞的相對(duì)存活率最高。有研究指出，卵磷脂沒有冷凍毒性[20]，但是在我們的研究中顯示當(dāng)卵磷脂濃度升高至11%時(shí)細(xì)胞復(fù)蘇后存活率反而降低，同樣的結(jié)果出現(xiàn)在用卵磷脂冷凍保存馬精液[21]的研究中，這可能是由于當(dāng)卵磷脂的濃度增加時(shí)，稀釋液中的糖和鹽類析出形成沉淀引起滲透壓下降，從而造成細(xì)胞損傷。

4　結(jié)論

本研究通過探討兩種酶消化分離達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞的效果以及比較抗凍劑、降溫程序、糖類和卵磷脂對(duì)達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞凍存效果的影響，得出保存達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞效果最佳方法為：先用0.25%胰蛋白酶消化3 h分離達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞，再用50 mmol/L D-海藻糖，5 mg/mL BSA，200 mL/L胎牛血清，10% EG及8%卵磷脂作為冷凍保存液，以-1 ℃/min慢速降溫保存達(dá)氏鱘精巢細(xì)胞效果最佳。

[1]丁瑞華．四川魚類志[M]．成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1994：29．

[2]Zhang H，Wei Q W，Du H，et al．Present status and risk for extinction of the Dabry′s sturgeon (Acipenserdabryanus) in the Yangtze River watershed：A concern for intensified rehabilitation needs[J]．J Appl Ichthyol，2011，27(2)：181-185．

[3]Zhuang P，Ke F E，Wei Q W，et al．Biology and life history of Dabry′s sturgeon，Acipenserdabryanus，in the Yangtze River[J]．Environ Biol Fish，1996，48(1-4)：257-264．

[4]Yoshizaki G，F(xiàn)ujinuma K，Iwasaki Y，et al．Spermatogonial transplantation in fish：A novel method for the preservation of genetic resources[J]．Comp Biochem Physiol Part D，2011，6(1)：55-61．

[5]Oberstein N，O’Donovan M K，Bruemmer J E，et al．Cryopreservation of equine embryos by open pulled straw，cryoloop，or conventional slow cooling methods[J]．Theriogenology，2001，55(2)：607-613．

[6]Eroglu A，Toner M，Toth T L．Beneficial effect of microinjected trehalose on the cryosurvival of human oocytes[J]．Fertil Steril，2002，77(1)：152-158．

[7]Izadyar F，Matthijs-Rijsenbilt J J，den Ouden K，et al．Development of a cryopreservation protocol for type A spermatogonia[J]．J Androl，2002，23(4)：537-545．

[8]Lee Y A，Kim Y H，Ha S J，et al．Cryopreservation of porcine spermatogonial stem cells by slow-freezing testis tissue in trehalose[J]．J Anim Sci，2014，92(3)：984-995．

[9]Mrowiec Z R，F(xiàn)ernandez-DeLeon M，Marchioni M，et al．Comparison of controlled vs non-controlled rate freezing of umbilical cord blood units[J]．Ashmtg，2004，104(11)：5011-5021．

[10]Linhartová Z，Rodina M，Guralp H，et al．Isolation and cryopreservation of early stages of germ cells of tench (Tincatinca)[J]．Czech J Anim Sci，2014，59(8)：381-390．

[11]Shikina S，Ihara S，Yoshizaki G．Culture conditions for maintaining the survival and mitotic activity of rainbow trout transplantable type A spermatogonia[J]．Mol Reprod Dev，2008，75(3)：529-537．

[14]Lacerda S M S N，Batlouni S R，Silva S B G，et al．Germ cells transplantation in fish：The Nile-tilapia model[J]．Anim Reprod，2006，3(2)：146-159．

[15]王愛珍．吉富羅非魚精原干細(xì)胞分離與體外培養(yǎng)的研究[D]．廣東湛江：廣東海洋大學(xué)，2013．

[16]Watson P F．The causes of reduced fertility with cryopreserved semen[J]．Anim Reprod Sci，2000，60-61：481-492．

[18]Mazur P．Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing[J]．J Gen Physiol，1963，47(2)：347-369．

[19]Aurich C，Seeber P，Müller-Schl?sser F．Comparison of different extenders with defined protein composition for storage of stallion spermatozoa at 5 ℃[J]．Reprod Domest Anim，2007，42(4)：445-448．

[20]Fiume Z．Final report on the safety assessment of Lecithin and Hydrogenated Lecithin[J]．Int J Toxicol，2000，20(S1)：21-45．

(責(zé)任編輯：鄧薇)

Digestion,isolation and cryopreservation of testicular cells from Dabry sturgeon (Acipenser dabryanus)

XIE Xuan1,2,LI Ping2,XI Meng-dan2,3,GUO Wei2,3,QIAO Xin-mei2,DU Hao2,LIU Zhig-ang2,WEI Qi-wei1,2,3

(1.SchoolofLifeScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina;YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China3.InstituteofHydrobiology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430072,China)

In this study,to obtain high recovery ratio of living cells after thawing for Dabry′s sturgeon (Acipenserdabryanus) testicular cells,we evaluate the effect of enzymatic dissociation on testicular cells,and the influence of cryoprotectants,freezing ratio,sugars and lecithin on testicular cells cryopreservation.Testes were dissociated and digested with 0.25% trypsin or a combination of 2 mg/mL collagenase H and 500 U/mL Dispase II.The number of testicular cells was counted respectively when tests were dissociated by these two enzymes for 2,3,4 and 5 h.The result showed that there was no significant difference between those enzymes.Per gram testis can obtain 1.27×107living cells dissociated by 0.25% trypsin and 1.07×107by the combined enzymes on average.We also investigate the effect of cryoprotectants,freezing rate,sugars and lecithin on testicular cells cryopreservation.Cells was diluted in 50 mM D-trehalose,5 mg/mL Bovine serum albumin,200 mL/L fetal bovine serum (pH 8.0) supplemented with 10% dimethyl sulfoxide (DMSO),ethylene glycol (EG) or methanol (MET) respectively,freezing on a cooling protocol from 0 ℃ to -80 ℃at a rate of -1 ℃/min,or transferring into liquid nitrogen (LN2) directly.The results demonstrated that cryopreservation with those cryoprotectants significantly influenced recovery rate of living cells,in the following sequence:EG(51.70%±5.24%)>MET(45.09%±3.15%)>DMSO(40.18%±3.90%).And freezing on slow rate,-1 ℃/min,showed obviously high rate of living cells after thawing.Based on the previous study,D-trehalose in the extenders was replaced by D-sucrose,and supplemented 0%,5%,8%,11% lecithin.Almost the same viability rates were obtained with no significant differences among tested sugars,but the differences performed obviously on lecithin.The results showed that (93.55±2.56)% living cells can be obtained after thawing when 8% lecithin was supplemented.The number of testicular cells increased 3.19 times for 10 days culture.

Acipenserdabryanus;trypsin;cryopreservation;cryoprotectant;lecithin

2016-03-01；

2016-03-23

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2015B02YQ01)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203086)；國(guó)家自然基金青年項(xiàng)目(31402301)

頡璇(1991-)，女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)。E-mail:xiexuan_1111@163.com

危起偉。E-mail:weiqw@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2016)05-0019-06