益氣血補肝腎方對胚胎著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3和胞飲突表達的影響

李海霞，夏正明，張金玉，郭新宇，鄧偉民，夏薇，盛立紅

（1.廣州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東廣州　510180；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東廣州　510260；3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東廣州　510010）

益氣血補肝腎方對胚胎著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3和胞飲突表達的影響

李海霞1，夏正明2，張金玉3，郭新宇3，鄧偉民3，夏薇1，盛立紅1

（1.廣州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東廣州510180；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東廣州510260；3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東廣州510010）

【目的】觀察中藥益氣血補肝腎方對胚胎著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3表達的影響，探討其改善胚胎著床的分子基礎?！痉椒ā繉?0只雌鼠隨機分為正常組、模型組和治療組3組，每組30只，其中，治療組小鼠予以中藥益氣血補肝腎方治療（包括經(jīng)后增殖方8 mg/kg和促黃體方8 mg/kg），在妊娠第4天（Pd4）上午8∶00采用米非司酮誘導模型組和治療組小鼠胚胎著床障礙，12 h后處死小鼠（每組20只），剖腹取小鼠子宮，小心刮取子宮內(nèi)膜，采用Real-time PCR和Western Blot的方法分別在mRNA和蛋白水平上檢測整合素β3在各組小鼠子宮內(nèi)膜中的表達情況。其余小鼠（每組10只）于Pd4剖腹取小鼠子宮，固定于體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液中，行掃描電鏡觀察?！窘Y(jié)果】Real-time RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示：模型組整合素β3 mRNA與蛋白表達顯著低于正常組（P＜0.05）；治療組可顯著升高整合素β3 mRNA與蛋白表達水平，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。胞飲突在模型組中的表達少于治療組和正常組，而胞飲突在治療組和正常組的表達相似?！窘Y(jié)論】中藥益氣血補肝腎方可上調(diào)子宮內(nèi)膜中整合素β3的表達，對胞飲突在Pd4小鼠子宮內(nèi)膜中的表達有正調(diào)節(jié)作用。

益氣血補肝腎方；整合素β3；胞飲突；子宮內(nèi)膜容受性；胚胎著床；子宮/超微結(jié)構(gòu)；疾病模型，動物；小鼠

隨著輔助生殖技術的發(fā)展，受精率逐漸提高，而胚胎的著床率和臨床妊娠率卻長期得不到很好的提高。胚胎著床的低效性使助孕技術的發(fā)展進入了“瓶頸期”，影響了輔助生殖技術的進一步發(fā)展，胚胎著床是影響不孕癥患者治療結(jié)局的重要環(huán)節(jié)［1］。眾所周知，著床期子宮內(nèi)膜容受性的建立是影響胚胎種植率和臨床妊娠率的一個重要因素［2］。近年來，中醫(yī)中藥在輔助生殖技術中發(fā)揮著越來越重要的作用，并在實際的臨床工作中逐漸顯現(xiàn)出成效［3］。本研究通過建立著床障礙的小鼠模型，觀察中藥益氣血補肝腎方對著床障礙小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜整合素β3和胞飲突表達的影響，進一步闡明益氣血補肝腎方改善子宮內(nèi)膜容受性以促進胚胎著床的分子基礎，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1主要藥物、試劑與儀器益氣血補肝腎方（包括經(jīng)后增殖方和促黃體方），由廣東一方制藥廠生產(chǎn)。其中，經(jīng)后增殖方（批號：Q1201005）含有：炙甘草6 g、黨參15 g、當歸6 g、川芎6 g、白芍12 g、白術12 g、茯苓12 g、菟絲子15 g、熟地黃12 g、杜仲15 g、鹿角霜10 g、山萸肉10 g、川椒3 g，煎成20 mL，制成顆粒劑10 g，相當于生藥量134 g；促黃體方（批號：Q1203026）含有：熟地黃15 g、山藥15 g、枸杞子15 g、山萸肉10 g、菟絲子15 g、鹿角膠10 g、龜板12 g、黨參15 g、白術15 g、扁豆15 g、薏苡仁15 g、茯苓15 g，煎成20 mL，制成顆粒劑10 g，相當于生藥量167 g；將米非司酮片（湖北葛店人福藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，批號：150703）碾碎，溶解于丙二醇（國產(chǎn)分析純）中，配成濃度為0.8 mg/mL的懸混液。整合素β3單克隆抗體購自美國 Abcam公司（批號：ab75872）；整合素β3引物由上海生工公司設計合成。ABI PRISM7900熒光定量PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2動物模型復制［4-5］及處理SPF級昆明小鼠，雌性小鼠未交配，雄性小鼠證明有生育能力，鼠齡6～8周，體質(zhì)量20～25 g，由本院動物實驗中心提供，動物合格證號：0060092/0060933。雌雄分籠飼養(yǎng)，小鼠被適應性飼養(yǎng)7 d后，進入實驗階段，自然光照，自由取水和攝食。將符合條件的雌鼠隨機分為3組：正常組、模型組和治療組，每組30只。每日17∶00按雌雄比2∶1合籠，次日晨8∶00檢查雌鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠第1天（Pd1），依次計算妊娠天數(shù)。從進入實驗開始，治療組每日上午給予經(jīng)后增殖方灌胃（劑量為8 mg/kg），從Pd1開始，改為促黃體方灌胃（劑量為8 mg/kg）。正常組和模型組則灌服等體積生理鹽水。于Pd4 8∶00在治療組和模型組小鼠頸背部皮下注射米非司酮0.1 mL/只（0.8 mg/mL），正常組則注射等容積丙二醇。12 h后將小鼠60只（每組20只）頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取小鼠子宮，小心剝離子宮內(nèi)膜，須在解剖顯微鏡下剔除著床點胚胎；然后刮取蛻膜化的子宮內(nèi)膜，立即放入事先經(jīng)高壓消毒的微量離心管（Eppendorf，EP）中。每只小鼠的子宮內(nèi)膜裝進1個EP管，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｆ溆嘈∈?0只（每組10只），于Pd4剖腹取小鼠子宮，以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，縱形剖開，固定于體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液中，行掃描電鏡檢查。

1.3實時熒光定量RT-PCR檢測

1.3.1總RNA提取常規(guī)Trizol法提取總RNA，按說明書要求進行。各組小鼠子宮內(nèi)膜總RNA以一定比例稀釋，在紫外分光光度計上檢測其純度，D260/D280比值為1.8～2.0。各組總RNA保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄反應采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成整合素β3 cDNA第一鏈。反應體系：總體系20 μL。取RNA模板1 μL于微量離心管中，依次加入5×RT Buffer 4 μL，脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）mix 2 μL，Oligo（dT）181 μL，RiboLockTMRnaseInhibitor1μL，ReverTra Ace 1 μL，加Rnase free water至20 μL，輕混勻，稍離心。反應條件：65℃、5min，42℃、60 min，70℃、10 min。所得cDNA第一鏈保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3實時熒光定量RT-PCR檢測整合素β3 mRNA的表達將逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA按1∶10稀釋，依次加入以下反應體系：SYBR Green Qpcr SuperMix-UDC 5 μL，F(xiàn)orward primer 0.2 μL，Reverse primer 0.2 μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）-treated water 2.6 μL，cDNA 2 μL。引物序列：整合素β3引物：上游引物5'-TTCAATGCCACCTGCCTCAA-3'，下游引物5'-CCTTGGCCTCGATACTAAAGCTCA-3' （100 bp）；內(nèi)參照 β-actin引物：上游 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'，下游5'-TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA-3'（404 bp）。PCR反應條件為：50℃、2 min，滅活UTG活性，95℃、10 min，酶熱啟動，95℃、15 s變性，60℃、1 min，退火及延伸，35個循環(huán)。根據(jù)各組樣品的熒光信號達到設定閾值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)（Ct值），通過標準曲線計算各樣本的模板拷貝數(shù)。以整合素β3 mRNA/β-actin mRNA的拷貝數(shù)之比值（p）表示實驗結(jié)果。

1.4免疫印跡分析法將適量小鼠子宮內(nèi)膜組織置于勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。加入含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的三去污裂解液400 μL于勻漿器中冰上勻漿，并重復碾磨，使組織盡量碾碎；裂解30 min后，用移液器將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中；然后在4℃下12 000 r/min，離心5 min，取上清提取蛋白。用考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度后，各組樣品（分別取50 μg蛋白），以100 mg/L十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，350 mA進行恒流電轉(zhuǎn)移1 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（PVDF膜）上。再根據(jù)濾膜面積以0.1 mL/cm2的量加入含50 g/L脫脂奶粉的 Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST，含體積分數(shù)0.1%Tween-20）封閉，室溫1 h。加入用50 g/L脫脂奶粉的TBST稀釋的一抗，室溫振搖，與膜共同孵育1 h，然后4℃過夜（兔抗整合素β3單克隆抗體濃度為1∶200，兔抗β-actin單克隆抗體濃度為1∶500）。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗，與膜共同孵育1 h，室溫振搖（兔抗鼠多克隆抗體濃度為1∶1 000、羊抗兔多克隆抗體濃度為1∶3 000），充分洗滌后采用電化學發(fā)光法（ECL）顯影曝光。用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)對目的條帶進行光密度掃描，然后用Quantity One軟件進行分析，以整合素β3/β-actin相對光密度值（p）作為整合素β3蛋白的相對表達值。

1.5掃描電鏡觀察子宮內(nèi)膜胞飲突各組小鼠于Pd4剖腹取子宮，PBS沖洗，縱形剖開，固定于體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液中，行掃描電鏡觀察小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突的表達。

1.6統(tǒng)計方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗法；組內(nèi)均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組實時熒光定量RT-PCR實驗結(jié)果圖1結(jié)果顯示：模型組Pd4整合素β3 mRNA表達顯著低于正常組（P＜0.05）；治療組可顯著升高整合素β3 mRNA表達水平，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1　各組小鼠Pd4子宮內(nèi)膜中整合素β3 mRNA的表達比較Figure 1　Endometrial integrin β3 mRNA expression level in the mice of different groups on Pd4?。ā纒，N=3）

2.2各組免疫印跡結(jié)果圖2、圖3結(jié)果顯示：模型組整合素β3蛋白表達較正常組顯著降低（P＜0.05）；治療組可顯著升高整合素β3蛋白表達，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2　各組整合素β3蛋白表達凝膠電泳圖Figure 2　Endometrial integrin β3 protein expression level in the mice of different groups detected by gel electrophoresis

圖3　各組小鼠Pd4子宮內(nèi)膜中整合素β3蛋白的表達比較Figure 3　Gel electrophoresis results of endometrial integrin β3 protein expression in the mice of different groups on Pd4?。ā纒，N=3）

2.3胞飲突在各組小鼠子宮內(nèi)膜中的表達圖4結(jié)果顯示：胞飲突在模型組中的表達少于治療組和正常組，而胞飲突在治療組和正常組的表達相似。提示益氣血補肝腎方對胞飲突在Pd4小鼠子宮內(nèi)膜中的表達有正調(diào)節(jié)作用，可改善子宮內(nèi)膜容受性，促進胚胎著床。

3　討論

3.1整合素β3、胞飲突與子宮內(nèi)膜容受性胚胎著床是許多物種生殖過程中最關鍵的環(huán)節(jié)。成功的著床需具備有接受性的子宮內(nèi)膜、正常并具有發(fā)育潛能的胚胎以及母—胎界面的對話。在胚胎著床的窗口期，子宮在一個極短的時期允許胚胎著床，在人類，這一時期相當于月經(jīng)周期的第20～24天，即子宮在這一特定時期對胚胎具有接受性。子宮內(nèi)膜容受性的建立是其中的一個重要環(huán)節(jié)［6］。

圖4　各組Pd4小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達比較（掃描電鏡，×5 000）Figure 4　Observation of the formation of pinopodes in mice endometrium of different groups at Pd4 under scanning electron microscope（×5 000）

整合素分子是一組由多種跨膜糖蛋白受體組成的家族，廣泛存在于細胞表面，可介導細胞與細胞外基質(zhì)及細胞與細胞之間的粘附，并參與細胞內(nèi)外信息傳遞。研究［7］證實，整合素β3在子宮內(nèi)膜的表達呈高度時空特異性，分泌中晚期，表達于子宮內(nèi)膜腺上皮，此時恰與人植入窗期一致，子宮內(nèi)膜容受性最佳。Lessey等［8］研究發(fā)現(xiàn)，整合素β3在著床窗的出現(xiàn)與子宮內(nèi)膜孕激素受體（PR）表達調(diào)節(jié)有關。國外學者通過對66名婦女接受體外受精與胚胎移植（IVF-ET）前后子宮內(nèi)膜行整合素β3檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IVF-ET術后妊娠的婦女子宮內(nèi)膜整合素β3的表達顯著高于非妊娠組。提示種植窗期子宮內(nèi)膜整合素β3表達減少所導致的子宮內(nèi)膜容受性低下，是IVF-ET失敗的原因之一［9］。胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育與相互協(xié)調(diào)對于胚胎的植入是至關重要的。其中子宮內(nèi)膜容受性是一個關鍵性的因素。Srinivasan等［10］采用免疫組織化學、免疫細胞化學及流式細胞學檢測整合素β3在小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞中表達，進一步證實了整合素β3是子宮內(nèi)膜容受性的標志，并且是胚胎著床過程中所不可缺少的。Lessey等［8］認為，整合素有助于子宮內(nèi)膜由非粘附到粘附狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，為胚泡的粘附、植入做準備。此外，植入期滋養(yǎng)層的侵入性受整合素表達或分布的影響。認為整合素β3除影響子宮內(nèi)膜容受性外，還能決定胚胎滋養(yǎng)層細胞的侵入能力。整合素的異常表達與子宮內(nèi)膜容受性缺陷有關。更為特異的是，經(jīng)治療后最終成功妊娠的患者在分泌期整合素β3的表達顯著增高，支持整合素β3作為子宮內(nèi)膜容受性分子標記一說［11］。

胞飲突（pinopode）是在掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscopy，SEM）下可見的子宮內(nèi)膜上皮細胞表面大而平滑的泡狀突起，由Nelson首先在小鼠子宮內(nèi)發(fā)現(xiàn)。有研究證實，胞飲突出現(xiàn)的時間與“種植窗”出現(xiàn)的時間相吻合，且表達在囊胚著床的部位，參與了胚胎著床的過程，為子宮內(nèi)膜容受性的形態(tài)學標志。胞飲突的出現(xiàn)時間與子宮內(nèi)膜“著床窗”出現(xiàn)的時間相吻合，為子宮內(nèi)膜容受性的形態(tài)學標志［2，12］。

3.2益氣血補肝腎方改善著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜的容受性中藥治療不孕有悠久的歷史，中醫(yī)對各種原因的不孕癥有不同的辨證論治方法。益氣血補肝腎方中的經(jīng)后增殖方著重于益氣血，同時促進子宮內(nèi)膜的的正常生長，方中用黃芪、黨參、白術、茯苓、甘草健脾益氣，熟地黃、肉桂、當歸、白芍、川芎補血和血，全方使氣血旺盛，沖任得滋，胎孕易成。促黃體方著重于補肝腎。當婦女受孕后，胎元的健康成長就需要腎水的封藏功能和脾土承載功能的正常運行，故此期的治療主要著重于補肝滋腎水兼以健脾，使雌激素及孕酮維持較高水平，調(diào)補肝腎為主，以維持黃體功能，促使胚胎的著床。全過程先補益氣血，后滋補肝腎，共達調(diào)經(jīng)種子之效［13］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)許多中藥能興奮下丘腦—垂體—性腺系統(tǒng)，顯示激素樣作用，能改善組織供血及子宮內(nèi)膜的微環(huán)境，增強子宮內(nèi)膜的容受性，提高著床率及臨床妊娠率。經(jīng)后增殖方及促黃體方中的許多中藥都有這樣的功效，研究［14-15］表明，益氣血補肝腎方能顯著提高卵泡液轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和促黃體生成素（LH）水平，能適當提高垂體降調(diào)節(jié)后人絨毛膜促性腺激素（HCG）日的LH水平，減少促性腺激素（Gn）用量和使用天數(shù)，從而提高胚胎的著床率。前期的研究［16］表明，經(jīng)后增殖方及促黃體方能誘導超促排卵小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3的表達，提高超促排卵小鼠的胚胎著床率，提示該方可能具有改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。

本研究中，采用米非司酮建立胚胎著床障礙的小鼠模型，旨在研究中藥益氣血補肝腎方對著床障礙小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜整合素β3表達的影響，從而闡明其改善胚胎著床的分子基礎，為臨床實踐提供更充分的理論依據(jù)。實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：經(jīng)米非司酮的作用，在Pd4模型組小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3 mRNA的表達較正常組顯著降低，治療組可顯著升高整合素β3 mRNA的表達，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫印跡檢查結(jié)果顯示整合素β3的表達趨勢與實時熒光定量RT-PCR結(jié)果無顯著性差異。本研究結(jié)果提示：中藥益氣血補肝腎方可上調(diào)著床障礙小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜中整合素β3及胞飲突的表達，改善子宮內(nèi)膜容受性，使內(nèi)膜與胚胎趨于同步化，從而促進胚胎著床。

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【責任編輯：黃玲】

Effect of Yiqixue Buganshen Recipe on Endometrial Integrin β3 Expression and Pinopode Formation in Mice with Embryo Implantation Dysfunction

LI Haixia1，XIA Zhengming2，ZHANG Jinyu3，GUO Xinyu3，DENG Weimin3，XIA Wei1，SHENG Lihong1
（1.Medical Reproduction Center，Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou 510000 Guangdong，China；2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000 Guangdong，China；3.Medical Reproduction Center，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

ObjectiveTo observe the effect of Yiqixue Buganshen Recipes（YBR），the compound recipes of Chinese herbal medicine with the actions of replenishing Qi and blood and tonifying liver and kidney，on the endometrial integrin β3 of the mice with embryo implantation dysfunction，and to explore the molecular mechanism of YBR in improving embryo implantation.Methods Ninety mice were divided normal group，model group，and YBR group，30 mice in each group.YBR group was given Jinghou Zengzhi granules 8mg/kg for promoting post-menstruation proliferation and Cuhuangti granules 8mg/kg for promoting the formation of corpora luteum.At 8∶00 am of pregnant day 4（Pd4），subcutaneous injection of mifepristone was used for inducing embryo implantation dysfunction in the model group and YBR group.Twenty mice from each group were executed 12 hours after subcutaneous injection of mifepristone，and the uterus was isolated for the detection of mice endometrial integrin β3 mRNA and protein expression with real-time RT-PCR and Western blotting method respectively.Ten mice from each group at Pd4 were executed，and the uterus was isolated and then fixed in 2.5%glutaraldehyde solution for the detection of the formation of pinopode in mice endometrium under scanningelectron microscope.Results The detection by real-time PCR and Western blotting method revealed that integrin β3 mRNA and protein expression levels of the model group were significantly lower than those of the normal group（P＜0.05），and YBR group had higher integrin β3 mRNA and protein expression levels than the model group（P＜0.05）.The formation of pinopodes in the model group was less than the normal group and YBR group，but the number of formed pinopodes in YBR group was similar to that in the normal group.Conclusion YBR can up-regulate the expression of integrin β3 in the endometrium of mice with embryo implantation dysfunction，and have positive regulatory effect on the formation of pinopodes on Pd4.

Yiqixue Buganshen Recipe；integrin β3；pinopode；endometrial receptivity；embryo implantation；uterus/ultrastructure；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0688-05

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．017

2016-05-01

李海霞（1978-），女，碩士研究生，主治醫(yī)師；E-mail:278941085@qq.com

張金玉（1965-），女，主任醫(yī)師；E-mail:haixialitj@sina.com

國家自然科學基金資助項目（編號:30973929）；國家青年科學基金資助項目（編號:81403249）；廣東省中醫(yī)藥管理局課題（編號:20141045）