蘇黃止咳膠囊對咳嗽變異性哮喘豚鼠模型療效的實驗研究

張忠德，高明，李際強，劉云濤，李洪濤

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州　510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)2014級碩士研究生，廣東廣州　510405；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國家重點實驗室，廣東廣州　510230）

蘇黃止咳膠囊對咳嗽變異性哮喘豚鼠模型療效的實驗研究

張忠德1，高明2，李際強1，劉云濤1，李洪濤3

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)2014級碩士研究生，廣東廣州510405；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國家重點實驗室，廣東廣州510230）

【目的】 觀察蘇黃止咳膠囊對咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）豚鼠模型的療效，探討蘇黃止咳膠囊的作用機制。【方法】將50只豚鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、醋酸潑尼松組及蘇黃止咳膠囊高、低劑量組，復(fù)制CVA豚鼠模型，檢測各組豚鼠咳嗽反應(yīng)、肺組織病理學(xué)、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸粒細胞百分率及血清中白細胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IgE的水平變化?！窘Y(jié)果】與正常對照組比較，模型對照組豚鼠咳嗽次數(shù)顯著增多（P＜0.05）；與模型對照組比較，蘇黃高劑量組咳嗽次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型對照組BALF中嗜酸性粒細胞百分率顯著上升（P＜0.05）；3個治療組嗜酸性粒細胞百分率均較模型組顯著降低（P＜0.05）。治療組肺組織病理改變較模型對照組減輕。與正常對照組比較，模型對照組血清中IL-4、TNF-α、IgE水平顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，醋酸潑尼松組血清中IL-4、TNF-α水平顯著下降，蘇黃高劑量組血清中TNF-α、IgE水平顯著下降（P＜0.05）。【結(jié)論】蘇黃止咳膠囊可能通過降低血清中TNF-α和IgE的水平，改善CVA豚鼠的咳嗽癥狀、氣道炎癥及肺組織病理變化，從而達到治療CVA的目的。

蘇黃止咳膠囊；咳嗽變異性哮喘；細胞因子；肺/病理學(xué)；疾病模型，動物；豚鼠

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）主要表現(xiàn)為反復(fù)不斷的干咳為主，伴有咽喉部發(fā)癢感，偶有難咳出的少量的白痰，咳嗽一般呈陣發(fā)性、攣急性，劇烈咳嗽時可伴有氣急、氣不得續(xù)，亦有“語言不得競”等癥狀，甚至有的患者以夜間劇烈咳嗽為主，嚴重影響睡眠［1］。全國名老中醫(yī)晁恩祥教授針對咳嗽變異性哮喘研制了蘇黃止咳膠囊，臨床上獲得滿意的臨床療效［2-3］。本研究從CVA豚鼠的咳嗽反應(yīng)、肺組織病理學(xué)、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸粒細胞百分率及血清中白細胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、免疫球蛋白（IgE）的水平變化，探討蘇黃止咳膠囊治療CVA的療效及可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1實驗動物普通級雌性豚鼠50只，體質(zhì)量（300±50）g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：44002100006813。

1.2實驗試劑與儀器雞卵清白蛋白（OVA）溶液（OVA購自美國GBCBIO Technologies公司）：將1 g雞卵清白蛋白干粉溶于25 mL的生理鹽水中先配置成40 g/L OVA溶液，并用生理鹽水稀釋20 g/ L OVA溶液；氫氧化鋁干粉（購自天津惠瑞化工科技有限公司，批號：20141111）；辣椒素溶液：取辣椒素（購自美國Sigma公司）30.5 mg，依次加入吐溫-80溶液及無水乙醇各1 mL溶解，再加入生理鹽水8.0 mL，配成10-2mol/L的辣椒素原液，取1 mL的辣椒素原液，稀釋至100 mL成10-4mol/L溶液；IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒（購自武漢華美公司）；IFN-γ、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（購自美國LifeSpan公司）。1205型壓縮霧化吸入機（德國PARI公司）；1.0LPM小動物無創(chuàng)肺功能儀（美國DSI BUXCO公司）；FinePointe氣道阻力和肺順應(yīng)性檢測系統(tǒng)（RC系統(tǒng)）（美國DSI BUXCO公司）。

1.3實驗藥物蘇黃止咳膠囊（由麻黃、紫蘇葉、地龍、蜜枇杷葉、炒紫蘇子、蟬蛻、前胡、炒牛蒡子、五味子等組成），成人用量每次3粒，每日3次，每粒0.45 g。生產(chǎn)批號：15060312。

1.4模型制作與分組實驗動物隨機分為正常對照組，模型對照組，蘇黃止咳膠囊高、低劑量組，醋酸潑尼松組。造模組動物在第1～28天，每天熏煙半小時；第15天每只豚鼠注射20 g/L OVA 1 mL和200 mg氫氧化鋁的混懸液；第22天每只豚鼠注射20 g/L OVA 1 mL和200 mg氫氧化鋁的混懸液加強致敏1次；第29天用10 g/L OVA霧化攻擊，連續(xù)7 d，每天1次；正常對照組給予相同體積的生理鹽水。所有動物飼養(yǎng)在普通環(huán)境，12 h/ 12 h光照循環(huán)，自由飲水和食用顆粒飼料。

熏煙箱及使用方法：熏煙箱為定制的長、寬、高分別為100 cm×60 cm×60 cm的不銹鋼箱體。本研究所用香煙為“紅梅”過濾嘴香煙（紅塔煙草有限責(zé)任公司；烤煙型香煙，焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.7 mg，煙氣一氧化碳量12 mg）。每次在熏煙箱中點燃10根香煙，將香煙點燃后，通過300 mL注射器和三通管的人工操作將煙霧排入熏煙箱，直至香煙燃完。

1.5給藥在第29天霧化攻擊當(dāng)天開始給藥，給藥劑量：蘇黃止咳膠囊高劑量組為6 g/kg，低劑量組為2 g/kg，醋酸潑尼松組為3 mg/kg。灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)7 d。正常對照組和模型對照組給予相同體積的生理鹽水。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1咳嗽敏感性的測定（CRS）［4-6］通過辣椒素咳嗽激發(fā)試驗判斷氣道的咳嗽敏感性。采用全身體積描記法（Buxco Electronics），10 g/L OVA最后1次霧化攻擊后的第2天，將豚鼠放入體描箱內(nèi)，用10-4mol/L辣椒素溶液霧化2 min后觀察并記錄豚鼠5 min的咳嗽次數(shù)。

1.6.2支氣管肺泡灌洗液的收集和支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)分類待激發(fā)試驗完成后，支氣管肺泡灌洗3次，每次2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），并回收支氣管肺泡灌洗液（BALF）。將收集的BALF取200 μL，并以3 000 r/min離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液，加入紅細胞裂解液后，3 000 r/min離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液，加入等量PBS涂片，蘇木精—伊紅（HE）染色；在顯微鏡下計連續(xù)視野中每200個細胞中嗜酸性粒細胞的數(shù)量，并計算出嗜酸性細胞的百分率。將收集的BALF取100 μL，以3 000 r/min離心10 min；轉(zhuǎn)移上清液，加入紅細胞裂解液后，再以3 000 r/min離心10 min；加入等量PBS，取10 μL進行細胞計數(shù)。其余BALF離心后取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3酶聯(lián)免疫吸附法測定豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α、IgE的含量采用腹主動脈采血法，采血5 mL放入促凝管，靜置后離心（3 000 r/min）10 min，分離血清，檢測IL-4、IFN-γ、TNF-α、IgE含量。測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6.4肺組織病理學(xué)觀察常規(guī)固定、石蠟切片、HE染色，在顯微鏡下觀察氣管的組織學(xué)病理情況。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組豚鼠CRS測定表1結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組咳嗽次數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的咳嗽次數(shù)顯著低于模型組，蘇黃高劑量組的咳嗽次數(shù)與模型對照組和蘇黃低劑量組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3個治療組之間比較，表明蘇黃止咳膠囊能抑制豚鼠的咳嗽反應(yīng)，具有鎮(zhèn)咳的作用，止咳的效果與蘇黃止咳膠囊的劑量有一定的關(guān)系。

表1　各組豚鼠咳嗽次數(shù)比較Table 1　Comparison of cough frequency of guinea pigs of different groups?。ā纒）

表1　各組豚鼠咳嗽次數(shù)比較Table 1　Comparison of cough frequency of guinea pigs of different groups　（±s）

①P＜0.05，與正常對照組比較；②P＜0.05，與模型對照組比較；③P＜0.05，與蘇黃低劑量組比較

組別正常對照組模型對照組醋酸潑尼松組蘇黃低劑量組蘇黃高劑量組N 8 8 8 9 8 n咳嗽/（次·min-1）0.66±0.50 3.03±0.91①2.20±0.96 2.96±1.32 1.33±0.77②③

2.2各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞百分率的測定表2結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型對照組的嗜酸性粒細胞百分率顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對照組比較，3個治療組嗜酸性粒細胞百分率顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3個治療組之間比較，醋酸潑尼松組嗜酸性粒細胞百分率下降明顯，與蘇黃低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　各組豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞百分率比較Table 2　Comparison of the percentage of eosinophils in BALF of guinea pigs of different groups?。ā纒）

表2　各組豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞百分率比較Table 2　Comparison of the percentage of eosinophils in BALF of guinea pigs of different groups　（±s）

①P＜0.05，與正常對照組比較；②P＜0.05，與模型對照組比較；③P＜0.05，與蘇黃低劑量組比較

組別正常對照組模型對照組醋酸潑尼松組蘇黃低劑量組蘇黃高劑量組N 8 8 6 7 6 p嗜酸性粒細胞/% 0.04±0.01 0.23±0.03①0.09±0.06②③0.14±0.03②0.12±0.03②

2.3各組豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α和IgE水平的檢測結(jié)果表3結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型對照組IL-4、TNF-α、IgE水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對照組比較，醋酸潑尼松組可顯著降低IL-4、TNF-α的水平，蘇黃高劑量組可顯著降低TNF-α、IgE的水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3　各組豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α和IgE含量的檢測結(jié)果比較Table 3　Comparison of serum IL-4，IFN-γ，TNF-α and IgE of guinea pigs of different groups?。ā纒）

表3　各組豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α和IgE含量的檢測結(jié)果比較Table 3　Comparison of serum IL-4，IFN-γ，TNF-α and IgE of guinea pigs of different groups?。ā纒）

①P＜0.05，與正常對照組比較；②P＜0.05，與模型對照組比較；③P＜0.05，與蘇黃高劑量組比較

組別正常對照組模型對照組醋酸潑尼松組蘇黃低劑量組蘇黃高劑量組N 6 6 6 6 6 ρIL-4/（pg·mL-1）7.64±3.69 18.95±10.40①2.93±1.67②③17.67±3.98 12.80±9.38 ρIFN-γ/（pg·mL-1）165.92±66.10 146.77±34.92 162.76±19.84 174.76±58.05 190.66±16.25 ρTNF-α/（pg·mL-1）15.12±5.92 25.01±11.16①15.36±3.31②19.75±2.83 16.48±3.31②ρIgE//（mg·L-1）33.58±2.10 59.85±8.87①70.47±5.90 62.80±9.67③47.26±10.80②

2.4各組豚鼠肺組織病理學(xué)圖1結(jié)果顯示：正常對照組肺組織黏膜上皮正常，管腔內(nèi)脫落細胞少，大部分管腔內(nèi)無脫落細胞；模型對照組肺組織管腔內(nèi)有脫落細胞，黏膜層不完整，細支氣管杯狀細胞增生，平滑肌肥厚，管壁增厚，管周較多嗜酸性粒細胞浸潤，鄰近肺組織、肺泡腔內(nèi)可見組織細胞及中性粒細胞滲出，肺間隔較多嗜酸性粒細胞及少許淋巴細胞浸潤，血管壁增厚；醋酸潑尼松組肺組織管腔內(nèi)少量脫落細胞，管腔內(nèi)少量的黏性分泌液，少量炎性細胞浸潤；蘇黃低劑量組肺組織細支氣管腔不規(guī)則，管周少量淋巴細胞及個別嗜酸性粒細胞浸潤，肺組織腔內(nèi)見少量炎性滲出物，間質(zhì)有嗜酸性粒細胞浸潤；蘇黃高劑量組肺組織管腔內(nèi)少量脫落細胞，管周嗜酸性粒細胞浸潤，血管壁增厚。

3　討論

咳嗽變異性哮喘（CVA）臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性、刺激性干咳，遇冷空氣、灰塵、油煙等容易誘發(fā)或加重咳嗽，常伴有咽癢等癥。晁恩祥教授根據(jù)其臨床特點，認為與中醫(yī)單純外邪犯肺，肺失宣肅，氣逆而咳不同，亦與哮喘宿痰伏肺有別；該咳嗽的病因與“風(fēng)邪”相關(guān)，與風(fēng)性“善行而數(shù)變”、“風(fēng)盛則癢”、“風(fēng)盛則攣急”相符，屬于“風(fēng)咳”的范疇；其病因病機為風(fēng)邪犯肺，邪阻肺絡(luò)，肺氣失宣，肺管不利，氣道攣急所致，據(jù)此創(chuàng)立從風(fēng)論治的治療大法，以“疏風(fēng)宣肺，解痙止咳”為法，研制了蘇黃止咳膠囊，臨床上對患者咳嗽、咽癢、氣急等癥狀有顯著療效［7-8］。藥理學(xué)試驗表明，蘇黃止咳膠囊具有止咳、平喘、祛痰、抗氣道炎癥和調(diào)節(jié)免疫的作用［9］。

圖1　各組豚鼠肺組織病理形態(tài)比較（HE染色，×100）Figure 1　Pathological changes in guinea pig lung tissues of different groups（by HE staining，×100）

目前認為在CVA發(fā)病過程中，IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)起了主要作用，以嗜酸性粒細胞浸潤為主的變應(yīng)性氣道炎癥是CVA的主要病理基礎(chǔ)［10］，模型對照組豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞百分率顯著升高，給予治療后中藥組和醋酸潑尼松組有所下降，并且蘇黃高劑量組相對于蘇黃低劑量組下降明顯，表明蘇黃止咳膠囊可以減輕嗜酸性粒細胞的浸潤狀況，但醋酸潑尼松效果更理想。長期氣道慢性非特異性炎癥的刺激，出現(xiàn)不同程度的氣道黏膜上皮損傷、纖毛脫落和炎性細胞浸潤、氣道黏膜水腫與肥厚和氣道內(nèi)炎性分泌物阻塞等一系列的病理改變［11］。與模型對照組比較，各治療組肺組織病理變化得到改善。而氣道上皮受損脫落，會導(dǎo)致上皮下的迷走神經(jīng)末梢暴露，容易接受物理或化學(xué)等微小的刺激激惹，使CVA患者咳嗽敏感性升高［12］。CRS的測定是通過霧化吸入特異性的刺激物，激活氣道感覺神經(jīng)末梢的咳嗽感受器，誘發(fā)咳嗽的產(chǎn)生，以激發(fā)物的濃度和咳嗽程度判斷CRS。辣椒素是紅辣椒的刺激成分提取物，因為其安全、劑量依賴性和重復(fù)性好，所以很適合用作CRS的評價［13］。本研究中造模組的豚鼠咳嗽次數(shù)顯著升高，說明造模是成功的，而經(jīng)過中藥和醋酸潑尼松治療的豚鼠的咳嗽次數(shù)明顯減少，并且蘇黃高劑量組豚鼠的咳嗽次數(shù)較醋酸潑尼松組少，表明蘇黃止咳膠囊能有效緩解豚鼠的咳嗽癥狀，并與蘇黃止咳膠囊的劑量有一定的相關(guān)性。

諸多證據(jù)表明，免疫功能紊亂在CVA發(fā)病機制中起重要作用。TH1/TH2失衡尤其是TH1下降，可導(dǎo)致大量炎性介質(zhì)生成，造成慢性氣道炎癥。TH1細胞亞群主要分泌IFN-γ，介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；TH2細胞亞群主要產(chǎn)生IL-4等細胞因子，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生和聚集，輔助B細胞產(chǎn)生IgE等，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)［14］。TNF-α是各種細胞因子的啟動因子，促進炎性細胞的浸潤和活化，具有廣泛的生物活性，能夠刺激炎癥細胞釋放各種炎性介質(zhì)，Brightling等［15］研究證實CVA患兒血清TNF-α較健康兒童顯著升高，說明TNF-α的釋放是CVA發(fā)病的重要機制之一。本研究選擇了代表TH1型細胞因子IFN-γ和TH2型細胞因子IL-4，以及TNF-α、IgE來觀察蘇黃止咳膠囊治療豚鼠模型的免疫作用機制，實驗結(jié)果表明：模型對照組中IL-4水平顯著升高，治療組IL-4水平下降，醋酸潑尼松組效果較為顯著；模型對照組IFN-γ水平下降，經(jīng)過治療，蘇黃高劑量組上升明顯，但無統(tǒng)計學(xué)意義；模型對照組TNF-α水平顯著升高，醋酸潑尼松組與蘇黃高劑量組顯著降低TNF-α水平；模型對照組IgE水平升高，蘇黃高劑量組IgE水平顯著低于模型對照組。由于經(jīng)費有限，每一組隨機選取6個樣本，樣本數(shù)目相對較少，實驗操作中仍會存在一定的誤差，相關(guān)數(shù)據(jù)尚需通過進一步實驗再次驗證。

本研究應(yīng)用蘇黃止咳膠囊干預(yù)后，可以顯著改善豚鼠的咳嗽癥狀，肺組織學(xué)病理改變較模型對照組顯著減輕，BALF中嗜酸性粒細胞百分率及血清中TNF-α、IgE水平降低，提示蘇黃止咳膠囊對CVA豚鼠有治療作用，其作用機制可能與降低血清中的TNF-α、IgE的含量，從而調(diào)節(jié)TH1與TH2的平衡狀態(tài)，減輕嗜酸性粒細胞浸潤，減輕氣道炎癥有關(guān)。IFN-γ在CVA發(fā)病過程中起重要作用，藥物是否通過升高IFN-γ的水平而達到治療CVA目的，尚需進一步證實。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Experimental Study of Therapeutic Effect of Suhuang Zhike Capsules for Guinea Pig Model with Cough Variant Asthma

ZHANG Zhongde1，GAO Ming2，LI Jiqiang1，LIU Yuntao1，LI Hongtao3
（1.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120 Guangdong，China；2.Postgraduates Enrolled in 2014，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；3.The State Key Laboratory of Respiratory Disease of the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510230 Guangdong，China）

ObjectiveTo observe the effects of Suhuang Zhike capsules（SZC）on theguinea pig model of cough variant asthma（CVA），and to explore its therapeutic mechanism.Methods Fifty guinea pigs were randomly divided into normal control group，model group，prednisone acetate tablets group，and high-and low-dose SZC groups.With reference to the related literatures，we set up the guinea pig model of CVA.The observation indexes included cough frequency，lung histopathology，the percentage of eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid （BALF），and the serum levels of interleukin 4（IL-4），interferon gamma（IFN-γ），tumor necrosis factor alpha （TNF-α），and immunoglobumin E（IgE）.Results Compared with the normal control group，the cough frequency of the model group was significantly increased（P＜0.05）；compared with the model group，the cough frequency of high-dose SZC group was reduced obviously（P＜0.05）.Compared with the normal control group，the percentage of eosinophils in BALF of the model group was significantly increased（P＜0.05）；the percentage of eosinophils of the three medication groups was lower than that of the model group（P＜0.05）.The pathologicalchanges of lung tissue in the medication groups were relieved compared to the model group.Compared with the normal control group，the serum IL-4，TNF-α and IgE levels of the model group were increased significantly （P＜0.05）；compared with the model group，the serum IL-4 and TNF-α levels of prednisone acetate tablets group were significantly decreased，and the serum TNF-α and IgE levels of high-dose SZC group were decreased significantly（P＜0.05）.Conclusion SZC could reduce the serum，TNF-α and IgE levels，and relieve the cough symptom，airway inflammation and the lung tissue pathology in CVA guinea pig，so as to achieve the therapeutic effect on CVA.

SuhuangZhikecapsules；coughvariantasthma；cytokines；lung/pathology；diseasemodels，animal；guinea pigs

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0693-05

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．018

2016-04-27

張忠德（1964-），男，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師；E-mail:doctorzzd99@163.com

李際強（1972-），男，主任中醫(yī)師；E-mail:1728183346@qq.com

廣東省自然科學(xué)基金資助項目（編號:S2013010012179、2014A030313412）