探討長期酒精暴露對視網(wǎng)膜的損傷

楊海霞　張洪亮　吳　?！≮w國強

1)河南新密市鄭州新華醫(yī)院　新密　452370　2)河南省省直第二醫(yī)院　鄭州 450003　3)鄭州大學第二附屬醫(yī)院　鄭州　450014　4)鄭州大學基礎醫(yī)學院　鄭州　450001

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探討長期酒精暴露對視網(wǎng)膜的損傷

楊海霞1)張洪亮2)吳睿3)趙國強4)

1)河南新密市鄭州新華醫(yī)院新密4523702)河南省省直第二醫(yī)院鄭州 4500033)鄭州大學第二附屬醫(yī)院鄭州4500144)鄭州大學基礎醫(yī)學院鄭州450001

目的探討患者長期酒精暴露對視網(wǎng)膜的損傷。方法選取野生型(wild type，WT)小鼠27只，酒精暴露建立動物模型，利用熒光抗體染色法觀察視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞的變化。結果長期酒精暴露后，小鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞出現(xiàn)損傷，如Müller細胞GS染色減弱、星形膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，并且呈劑量依賴性(P< 0.05)。結論長期酒精暴露可通過改變視網(wǎng)膜的膠質(zhì)細胞Müller細胞和星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量和形態(tài)對視網(wǎng)膜造成損傷，且呈劑量依賴性。

酒精暴露；視網(wǎng)膜；膠質(zhì)細胞；熒光抗體染色法

哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，視網(wǎng)膜內(nèi)含有豐富的谷氨酸，在生理情況下，它傳遞神經(jīng)信號，是一種神經(jīng)遞質(zhì)。正常情況下，視網(wǎng)膜細胞間質(zhì)中的谷氨酸濃度較高，通過神經(jīng)膠質(zhì)細胞膜上的谷氨酸轉運體轉進入細胞內(nèi)，經(jīng)由谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)轉化為谷氨酰胺，而使其毒性作用大大減弱或消失，從而保護神經(jīng)節(jié)細胞免受谷氨酸的毒性損害作用。一些病理情況下，如眼外傷、高眼壓、糖尿病等，視網(wǎng)膜內(nèi)谷氨酸濃度異常升高，過度刺激神經(jīng)節(jié)細胞表面的谷氨酸受體，從而進一步通過胞內(nèi)信號傳導通路，導致細胞膜內(nèi)的鈣離子通道開放，細胞內(nèi)的鈣離子升高超載，引起興奮性的毒性作用，從而導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞死亡及視網(wǎng)膜功能障礙。

在視網(wǎng)膜內(nèi)，神經(jīng)膠質(zhì)細胞Müller細胞的作用非常重要，它維持視網(wǎng)膜內(nèi)谷氨酸的平衡，進一步保護視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細胞，免受谷氨酸的興奮性毒性作用；視網(wǎng)膜內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞參與血-視網(wǎng)膜屏障的形成，是神經(jīng)元同血管細胞之間的橋梁，也發(fā)揮著對神經(jīng)元細胞活動的調(diào)節(jié)作用，另外還對一些大分子物質(zhì)在膠質(zhì)細胞間的擴散進行調(diào)節(jié)，且具有神經(jīng)元營養(yǎng)保護作用。長期酒精暴露是否對視網(wǎng)膜Müller細胞和星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生損傷，目前無明確報道。本研究探討酒精暴露對視網(wǎng)膜的損傷情況，以利于臨床有關疾患的診治預防。

1　材料與方法

1．1動物標本選取成年小鼠(其基因型為C57BL/6J)。小鼠分區(qū)分籠飼養(yǎng)在標準化的條件下，小鼠可自由進食、飲水，晝夜節(jié)律是自然狀態(tài)(小鼠和標準飼料均購自河南省實驗動物中心)。所有的小鼠需要排除全身和眼部疾病。小鼠的墊料定期更換、動物實驗室定期消毒。實驗模型建立后，制作小時視網(wǎng)膜標本，其具體步驟：(1)通過腹腔注射異戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將小鼠麻醉；(2)經(jīng)心灌流4%的多聚甲醛(pH 7.2)，從而固定標本；(3)取出完整的雙側眼球；(4)一只眼球再用4%多聚甲醛繼續(xù)浸泡固定0.5 h(4 ℃)后，去除角膜與晶狀體，解剖取出完整的視網(wǎng)膜，以視盤為中心，呈放射狀剪成四葉，4%的多聚甲醛固定1 d后，做成視網(wǎng)膜鋪片，4 ℃保存?zhèn)溆?；另一只眼?%的多聚甲醛浸泡固定2 d(4 ℃)，做成石蠟切片，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2主要儀器設備(1)熒光顯微鏡(Olympus，BX61，Japan)；(2)振蕩器(VG 3 S25，IKA，Germany)；(3)石蠟切片機(LR 59590型，USA)；(4)微量加樣槍(Eppendorf Germany)；(5)振蕩切片機(LR 59590型，USA)；(6)微量高速離心機(TG 16W型，長沙)。

1．3免疫組化試劑抗體稀釋液和多聚賴氨酸，均購置于福州邁新生物技術有限公司；載玻片、蓋玻片購置于鄭州玻璃儀器廠；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氫氧化鈉(NaOH)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、多聚甲醛、異戊巴比妥鈉、乙醇均購于開封開化公司；鼠抗GS多抗和兔抗GFAP單抗購于Abcam公司；Alexa 568驢抗兔IgG、Alexa568驢抗鼠IgG、Alexa488驢抗鼠IgG購于Invitrogen公司。

1．4實驗操作主要試劑的配制詳見各說明書。選取27只成年C57BL/6J小鼠，隨機分為3組，每組9只：(1)高劑量酒精組(high ethyl alcohol group，H-EtOH)，每天每只小鼠胃飼濃度25%的酒精，4.0 g/kg，連續(xù)胃飼3個月；(2)低劑量酒精組(low ethyl alcohol group，L-EtOH)，每天每只小鼠胃飼濃度25%的酒精，2.0 g/kg，連續(xù)胃飼3個月；(3)對照組(control group)，每天每只小鼠胃飼蒸餾水，4.0 g/kg，連續(xù)胃飼3個月。視網(wǎng)膜石蠟切片、整體鋪片、及免疫組化熒光染色等詳見實驗記錄。

1．5統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)用Means±SD表示，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件單因素方差分析及隨后的LSD檢驗高劑量酒精組、低劑量酒精組和對照組。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2．1長期酒精暴露對小鼠視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞的影響星型膠質(zhì)細胞的足板是血-視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分[1]。視網(wǎng)膜鋪片中，可觀察到星型膠質(zhì)細胞的免疫染色顯示在視網(wǎng)膜表面，正常情況下，星形膠質(zhì)細胞的染色強，胞體很小，分支較多，突起非常明顯。低劑量酒精組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)染色有所減弱，高劑量酒精組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞GFAP染色顯著降低，同時，還伴膠質(zhì)細胞肥大改變，胞體明顯增粗，突起與分支減少(圖1)。統(tǒng)計結果顯示：酒精暴露可劑量依賴性地使視網(wǎng)膜內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)改變和數(shù)量減少(圖3，P<0.05)。

2．2長期酒精暴露對視網(wǎng)膜Müller細胞的影響視網(wǎng)膜中Müller細胞是一種特殊的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，大致可分為胞體、內(nèi)側突起和外側突起；胞體主要分布在內(nèi)核層，胞體呈橢圓形或者多角形，核周胞質(zhì)較少，胞體向內(nèi)外兩側發(fā)出突起，占據(jù)從內(nèi)界膜到外界膜整個視網(wǎng)膜厚度。低劑量酒精組小鼠視網(wǎng)膜Müller細胞GS染色減弱，高劑量酒精組小鼠視網(wǎng)膜Müller細胞GS染色明顯降低(圖2)。統(tǒng)計結果顯示，酒精暴露可劑量依賴性地使視網(wǎng)膜Müller細胞數(shù)量減少(圖4，P<0.05)。

圖1　長期酒精暴露對小鼠視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞數(shù)量的影響(GFAP標記)

圖2　長期酒精暴露對小鼠視網(wǎng)膜Müller細胞數(shù)量的影響(GS標記)

圖3　長期酒精暴露對小鼠視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞數(shù)量的影響　圖4　長期酒精暴露對小鼠視網(wǎng)膜Müller細胞數(shù)量的影響

3　討論

研究表明，脊椎動物的視網(wǎng)膜，主要是有三種不同的神經(jīng)膠質(zhì)細胞：Müller細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞[2]。長期酒精暴露后，小鼠視網(wǎng)膜的膠質(zhì)細胞，出現(xiàn)損傷，如Müller細胞和星形膠質(zhì)細胞均減少，并伴有肥大改變，表現(xiàn)為胞體增粗與突起分支減少。

Müller細胞的分布，是從外界膜到內(nèi)界膜的整個視網(wǎng)膜厚度，并其突起包繞與聯(lián)系視網(wǎng)膜上之各類神經(jīng)細胞，及與視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的交互作用發(fā)生多種功能，參與形成血視網(wǎng)膜屏障。近年研究表明，Müller細胞是可以用來修復一些受損傷的神經(jīng)元[3-4]。目前Müller細胞的具體功能尚未形成統(tǒng)一的定論，但傳統(tǒng)研究認為：視網(wǎng)膜中Müller細胞，一般主要起支持和營養(yǎng)作用，作為神經(jīng)元的起支架作用，保持視網(wǎng)膜的完整性及儲存大量糖原，部分為神經(jīng)元提供能量等。近期不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，Müller細胞不僅簡單的起支持營養(yǎng)作用，且具有更為復雜的生理功能與病理意義[5]。近來，有大量研究發(fā)現(xiàn)，如果Müller細胞外面的谷氨酸濃度升高，則會造成神經(jīng)元的損傷與死亡；并且視網(wǎng)膜中，Müller細胞是能夠表達高親和力的谷氨酸轉運體，然后將細胞外高濃度的谷氨酸進一步轉運至細胞內(nèi)，通過谷氨酰胺合成酶，將其轉化為谷氨酰胺，消除其對神經(jīng)元細胞的毒性作用[6]，進而可以減輕對視網(wǎng)膜的毒性作用。另外，Müller細胞也能夠通過合成谷胱甘肽，從而消除自由基等對神經(jīng)元的損傷作用[7]。

視網(wǎng)膜內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞，則是可以參與血-視網(wǎng)膜屏障的形成，且能對其功能進行調(diào)控。星形膠質(zhì)細胞也是神經(jīng)元細胞同血管壁細胞等活動之間的橋梁，主要作用也是通過高效率的表達谷氨酸轉運體，進一步參與谷氨酸的代謝，再通過產(chǎn)生的鈣調(diào)節(jié)，發(fā)揮其對神經(jīng)元細胞的活動的調(diào)節(jié)作用。另外星形膠質(zhì)細胞還對一些大分子物質(zhì)，在膠質(zhì)細胞間的擴散進行調(diào)節(jié)。星形膠質(zhì)細胞還具有神經(jīng)元營養(yǎng)保護作用。因此認為，如視網(wǎng)膜內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞發(fā)生損傷，那么視網(wǎng)膜內(nèi)的血管與神經(jīng)元細胞，則都會產(chǎn)生很大影響。GFAP(glial fibrillary acidic protein)是一種中間絲蛋白，正常情況下，在視網(wǎng)膜中，只有星形膠質(zhì)細胞才可以表達，但是目前國內(nèi)外，GFAP在視網(wǎng)膜中的功能，均無明確定論。通過對敲除GFAP基因的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，在這些小鼠的大腦海馬處，它們的突觸傳遞發(fā)生了明顯改變，且血-腦屏障也發(fā)生了一定程度的損害[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，一些培養(yǎng)的大腦星形膠質(zhì)細胞，其膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，可以參與細胞內(nèi)谷氨酰胺含量的調(diào)節(jié)[9]。這說明，GFAP不僅可誘導大動脈的內(nèi)皮細胞分化，進而形成血-腦屏障，同時GFAP還參與了β淀粉蛋白的反應性調(diào)節(jié)[10-11]。因此，如果視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞中GFAP的表達減少，則表明其代謝功能已經(jīng)發(fā)生了改變，其主要表現(xiàn)是誘導內(nèi)皮細胞表達的血-視網(wǎng)膜屏障特性功能降低。本研究實驗中發(fā)現(xiàn)，長期的酒精暴露后，能夠劑量依賴性地使視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量明顯減少，提示其對血-視網(wǎng)膜屏障造成了損傷。

綜上，本實驗表明，長期的酒精暴露能夠造成視網(wǎng)膜Müller細胞和膠質(zhì)細胞的呈劑量依賴性損傷，提示長期飲酒人員可能對視網(wǎng)膜的累積損傷及其影響。

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(收稿2015-09-12)

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1673-5110(2016)18-0067-03