T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎早期診斷中的價值

崔中鋒　劉春禮　李　格　李　寧　張　瑩　姜　瑜　李洋瑩

鄭州市第六人民醫(yī)院　鄭州　450000

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T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎早期診斷中的價值

崔中鋒劉春禮李格李寧張瑩姜瑜李洋瑩

鄭州市第六人民醫(yī)院鄭州450000

目的探討T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎早期診斷中的價值，為結(jié)核性腦膜炎的早期診斷提供有效檢查方法。方法選擇結(jié)核性腦膜炎40例(患者組)及非結(jié)核性腦膜炎感染 66 例(對照組)進行T-SPOT.TB檢測，進一步比較多種檢查方法診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感性和特異性。結(jié)果腦脊液T-SPOT.TB實驗顯示，結(jié)核性腦膜炎組陽性檢出率為95%(38/40)，非結(jié)核性顱內(nèi)感染組為3.03%(2/66)；外周血T-SPOT.TB實驗顯示，結(jié)核性腦膜炎組陽性檢出率為72.5%(29/40)，非結(jié)核性顱內(nèi)感染組為13.64%(9/66)，均高于腦脊液抗酸染色涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、熒光定量PCR、結(jié)核抗體檢測等方法，且具有較高的特異性。外周血T-SPOT.TB實驗陽性檢出率與腦脊液陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(Fisher確切概率法，P=0.254)。結(jié)論運用T-SPOT.TB實驗檢測外周血和腦脊液單個核細胞結(jié)核桿菌感染的陽性率高于其他方法，明顯提高了結(jié)核性腦膜炎的診斷率，采用T-SPOT.TB實驗檢測腦脊液診斷結(jié)核性腦膜炎陽性率高于外周血檢測的陽性率。

結(jié)核性腦膜炎；腦脊液；T-SPOT.TB；

結(jié)核性腦膜炎是由結(jié)核分枝桿菌引起的腦膜和脊膜的非化膿性炎癥性疾病，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的一種嚴重威脅人類生命健康的疾病，同時也是病死率最高的肺外結(jié)核病。結(jié)核T細胞酶聯(lián)免疫斑點實驗是一種體外檢測T淋巴細胞針對MTB特異抗原的γ干擾素(IFN-γ)分泌實驗，為輔助診斷結(jié)核病的新技術(shù)[1-2]。本研究探討T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎的早期診斷的價值?，F(xiàn)分析如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2014-06-2015-08在我院住院確診并進行治療的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者：(1)結(jié)核性腦膜炎患者40例(患者組)，均符合結(jié)核性腦膜炎診斷標準[3]，均經(jīng)抗結(jié)核治療有好轉(zhuǎn)或痊愈，男28例，女12例；平均年齡45.6歲。(2)非結(jié)核性顱內(nèi)感染66例(對照組)，男36例，女30例；平均年齡48.3歲；其中新型隱球菌性腦膜炎4例，病毒性腦膜炎32例，化膿性腦膜炎30例。所有入選患者均同時無菌采集腦脊液和外周血標本。

1.2方法

1.2.1檢測細胞工作液制備：所有患者的腦脊液均在醫(yī)生的無菌操作下采集，把采集好的無菌腦脊液5～6mL打入含有肝素鋰抗凝劑的試管內(nèi)，并按照T-SPOT.TB的檢測流程，在Ⅱ級生物安全柜內(nèi)操作完成，并抽取含有肝素鋰抗凝劑的外周靜脈血4～6mL，加入4～6mL的淋巴細胞分離液，采用密度梯度離心法收集單個核細胞層。將臨床醫(yī)生無菌操作下采集的腦脊液標本，用無血清培養(yǎng)液將腦脊液細胞密度調(diào)整到 0.1×106個/mL，外周血細胞標本濃度調(diào)整到為2.5×106個/mL的工作液待檢。

1.2.2T-SPOT.TB檢測：取細胞懸液100μL鋪于預包被IFN-γ的PVDF板，每個樣本均設(shè)測試孔A、測試孔B作為陰性對照，陽性對照4個孔。放入37 ℃的5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18h，用冷去離子水裂解細胞，洗板后加入生物素標記抗體100μL/孔，培養(yǎng)箱中孵育1h，再次洗板，然后加入酶標親和素在37 ℃的5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱孵育1h，洗板后加入AEC顯色液，避光靜置30min后去離子水終止顯色，室溫晾干后計數(shù)斑點。

1.2.3T-SPOT.TB檢測結(jié)果判定：運用全自動讀板儀計數(shù)斑點。陽性結(jié)果：①如果陰性對照孔斑點數(shù)為 0～5，用測試A和(或)測試孔B的斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點數(shù)≥6；②如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6，測試孔A和(或)測試孔B的斑點數(shù)必須≥2倍陰性對照孔斑點數(shù)。腦脊液標本和用外周血調(diào)整好的工作液的結(jié)核抗體診斷方法均為進口免疫色譜層析法。

腦脊液標本和外周血涂片抗酸桿菌染色嚴格按照臨床檢驗標準實驗操作規(guī)程進行。腦脊液標本和外周血結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)嚴格按照臨床檢驗標準(SOP)實驗操作規(guī)程進行。腦脊液標本和外周血的TB-DNA熒光定量PCR試劑由泰普生物科學有限公司提供，腦脊液TB-DNA(PCR)水平≥500copies/mL判定為陽性，<500copies/mL判定為陰性。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分率(%)表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1不同方法對腦膜炎患者腦脊液標本檢測結(jié)果T-SPOT.TB在40例結(jié)核性腦膜炎患者中檢出陽性率為95%(38/40)，明顯高于其他方法。見表 1。

表1　腦脊液不同方法對于不同患者的檢測結(jié)果　(n，+/-)

2.2不同方法對外周血標本檢測結(jié)果比較T-SPOT.TB在40例結(jié)核性腦膜炎患者中檢出29例陽性，陽性率72.5%(29/40)。見表2。

表2　外周血運用T-SPOT.TB方法對于不同患者的檢測結(jié)果比較　(n，+/-)

3　討論

結(jié)核病是嚴重威脅人類生命健康的重要傳染病之一，是導致死亡人數(shù)最高的單一傳染病病種之一，全球約有2億人死于結(jié)核病，新發(fā)結(jié)核病患者絕大多數(shù)在發(fā)展中國家，目前全球大約20億的人口在受到結(jié)核桿菌的感染，每一年約有800萬新發(fā)活動性結(jié)核病例，結(jié)核病在許多國家都已成為重大的公共衛(wèi)生問題。目前，針對活動性結(jié)核的診斷與鑒別診斷仍面臨巨大問題。我國是結(jié)核病高感染率的國家之一，現(xiàn)結(jié)核桿菌感染人數(shù)已超5億，是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一，同時也是全球27個耐多藥結(jié)核高流行國家之一；活動性肺結(jié)核病患者總數(shù)居于全球第2，僅次于印度，其中結(jié)核性腦膜炎約占6%左右[4]，臨床表現(xiàn)多以兇險的Ⅱ期和Ⅲ期為多，且預后不良。結(jié)核性腦膜炎治療的成功與否，很大程度上取決于，是否能夠早期診斷和早期治療。常規(guī)的實驗室診斷方法中，結(jié)核菌素實驗診斷肺外結(jié)核分枝桿菌感染的靈敏度與特異度僅為 67.57% 和 56.67%[5]，腦脊液涂片鏡檢陽性率則更低。結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)法比涂片鏡檢法陽性率較高約為60%，但由于結(jié)核分枝桿菌生長比較緩慢，大約每18h分裂1次，所以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法檢測時間相對長(需1個半月)，而且自動化設(shè)備器械較貴，很難在常規(guī)實驗室大量開展。近年常用的PCR檢測方法，依賴于成功獲得含有結(jié)核桿菌的患者標本，如果標本中不含結(jié)核菌或含量太低，檢測結(jié)果則呈陰性。另外PCR檢測容易污染而造成假陽性率較高，很難實現(xiàn)精準、快速的結(jié)核病早期診斷。T-SPOT.TB檢測方法作為一種新的酶聯(lián)免疫檢測方法，是目前免疫學方法檢測結(jié)核病比較成熟的檢測技術(shù)，在國外已開始應(yīng)用于結(jié)核桿菌感染的檢測。因為T-SPOT.TB是從單個細胞水平檢測，因而可及時捕獲細胞周圍分泌的細胞因子，故該方法的靈敏度高，特異性強，操作簡單，耗時少，可快速出結(jié)果。本方法通過檢測IFN-γ來診斷是否存在結(jié)核桿菌感染，而不會同卡介苗和環(huán)境中的分枝桿菌發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，同時也不受機體免疫狀況的影響，其假陽性率和假陰性率顯著低于結(jié)核菌素試驗(TsT)。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測對結(jié)核性腦膜炎診斷的靈敏度在腦脊液標本中達到95%，在外周血標本中達到72.5%，明顯高于其他幾種常規(guī)檢測方法。且外周血標本采集方便，是結(jié)核性腦膜炎的重要輔助診斷方法，在依靠臨床表現(xiàn)和原有相關(guān)常規(guī)檢查檢測的基礎(chǔ)上增加T-SPOT.TB檢測，進一步綜合判斷，可提高診斷準確性，減少漏診率，對于結(jié)核性腦膜炎患者的早期診斷及早期治療具有積極意義。

[1]LalvaniA，PathanAA，MeShaneH，etal.RepiddetectionofMy-cobacteriumtuberculosisinfectionbyenumerationofantigen-specif-icTcells[J].AMJRespirCritCareMed，2001，163(4)：824-828

[2]陸建紅，陳國軍，杜開齊，等.結(jié)核T細胞酶聯(lián)免疫斑點實驗診斷結(jié)核感染的臨床應(yīng)用[J].武警醫(yī)學，2013，24(10)：866-868.

[3]DignanFL，EvansSO，EthellME，etal.AnearlyCT-diagnosis-basedtreatmentstrategyforinvasivefungalinfectioninallogeneictransplantrecipientsusingcaspofunginfirstline：aneffectivestrategywithlowmortality[J].BoneMarrowTransplant，2009，44(1)：51-56.

[4]全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導組.2010 年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J].中國防癆雜志，2012，34(8)：485-508.

[5]陸建紅，陳國軍，杜開齊，等.結(jié)核T細胞酶聯(lián)免疫斑點實驗快速診斷肺外結(jié)核感染的應(yīng)用價值[J].中國綜合臨床，2014，30(9)：945-948.

(收稿2015-12-14)

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1673-5110(2016)16-0097-02