鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球滴眼劑的制備及初步刺激性考察

黃　燚，侯冬枝*，潘育方，劉　莉，桂茹藝，胡　晟，田雙艷，平其能,陳燕忠

(1.廣東藥學院藥科學院，廣州　510006；2.中國藥科大學藥學院，南京　210009)

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·藥劑·

鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球滴眼劑的制備及初步刺激性考察

黃燚1，侯冬枝1*，潘育方1，劉莉1，桂茹藝1，胡晟1，田雙艷1，平其能2,陳燕忠1

(1.廣東藥學院藥科學院，廣州510006；2.中國藥科大學藥學院，南京210009)

目的制備新型鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球滴眼劑并研究其初步刺激性。方法以蒙脫石為離子交換載體材料，用2種處方以O1/O2溶劑揮發(fā)法制備鹽酸倍他洛爾緩釋微球；對比微球的載藥量和包封率等物化性能以得到最優(yōu)處方，并將最優(yōu)處方制備的微球制成滴眼劑以研究其初步刺激性。結果最優(yōu)處方為丙烯酸樹脂300mg(RS∶RL=1∶3)，檸檬酸三乙酯60mg，甘油30mg，乳化劑400mg(吐溫-80∶司盤-80=1∶2)，鹽酸倍他洛爾30mg，蒙脫石50mg，內外相體積比為1∶6。最優(yōu)處方制得的微球載藥量和包封率分別為14.31%和94.35%，初步刺激性實驗顯示微球滴眼劑對眼部組織無明顯刺激性。結論微球制備方法簡便易行，重復性好；制備的微球滴眼劑無明顯刺激性，具有廣闊的應用前景。

蒙脫石；鹽酸倍他洛爾；微球；刺激性

青光眼是由于眼壓增高而引起視盤凹陷、視野缺損，威脅視神經功能最終導致失明的嚴重眼病。鹽酸倍他洛爾(betaxololhydrochloride，BH)是一種選擇性β1受體阻滯劑，具有一定的鈣通道阻滯功能，可通過減少房水的生成起到降眼壓的作用，并使神經節(jié)細胞內谷氨酸鹽引起的鈣超載減輕，細胞凋亡減少[1]，臨床上常用于治療青光眼。但鹽酸倍他洛爾滴眼液揮發(fā)迅速，起始作用可以在30min內出現(xiàn)，因此考慮將緩釋技術用于滴眼液，希望可以有效控制其在眼部的釋放，延長其在眼部的滯留時間，達到溫和持久的藥效[2]。蒙脫石(montmorillonite，MMT)是一類具有天然納米粒特性的硅酸鹽礦石膨潤土的主要成分，具有良好的吸水膨脹性、流體觸變性[3-5]、陽離子交換性[6-8]和吸附性[9-11]；此外，蒙脫石的綠色無毒性和抗紫外特性已用于化妝品和醫(yī)藥行業(yè)[12-13]。因此，蒙脫石作為一種新型藥物載體應用于離子交換給藥緩釋系統(tǒng)，具有巨大潛力。本文以蒙脫石為離子交換載體材料，以O1/O2型乳化-溶劑揮發(fā)法制備鹽酸倍他洛爾緩釋微球，通過測定微球的載藥量、包封率、體外釋放性能和掃描電鏡下微球的形態(tài)等物化性能來對比2種處方。最后將最優(yōu)處方制備的鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球制備成滴眼劑，考察其對眼部組織的初步刺激性。

1　儀器與試藥

1.1儀器UV754N紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；BL-220H電子天平(日本島津公司)；ClassicaE103G光學顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；QUANTA400F掃描電鏡(美國FEI公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠)；XW-80A旋渦混合儀(海門市米其林貝爾儀器有限公司)；KQ-5200超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設備有限公司)；RCT安全型磁力攪拌器(德國IKA公司)。

1.2試藥鹽酸倍他洛爾(質量分數(shù)99.5%，批號20110615，濟南浩化實業(yè)有限公司)；丙烯酸樹脂(eudragitRS/RL，德國Degussa公司)；MMT-BH(實驗室自制)；液體石蠟、正己烷、甘油、司盤-80和吐溫-80等(分析純，天津大茂試劑有限公司)。

2　方法與結果

2.1標準曲線的制備精密稱取10mg鹽酸倍他洛爾原料藥，置于10mL量瓶中，用去離子水定容，得到質量濃度為1mg·mL-1的儲備液。精密吸取儲備液0.2，0.4，0.8，1.2和1.6mL，分別置于10mL量瓶中，定容至刻度，得到質量濃度分別為0.02，0.04，0.08，0.12和0.16mg·mL-1的標準溶液，在274nm處測定吸光度值A，以A值對質量濃度C作線性回歸，得標準曲線方程：A=3.543 3 C+0.037(r=0.999 8)。結果表明，待測液中BH的質量濃度在0.02～0.16mg·mL-1范圍內與吸光度的線性關系良好。2.2表觀溶解度測定將過量的BH加入一定體積的去離子水中，渦旋5min，置于34 ℃恒溫水浴中振蕩，每隔30min取樣200μL，稀釋適當倍數(shù)并同時補充相同體積的去離子水，測定吸光度A，由標準曲線換算出藥物質量濃度，當測得相鄰2次時間點樣品質量濃度相差不超過5%時，判斷溶解達到平衡，此時質量濃度視為平衡溶解度，測定BH在水中的表觀溶解度為16.94mg·mL-1。

2.3MMT-BH微球的制備處方A[14]:精密稱取MMT-BH50mg，BH30mg，丙烯酸樹脂(RS∶RL=1∶3)300mg，檸檬酸三乙酯60mg，甘油30mg，吐溫-80 150mg和乙腈5mL。二氯甲烷(4∶1)作為內相O1；外相O2為含有300mg司盤-80的30mL輕質液體石蠟。將內相逐滴滴加到外相中，冰水浴(5～10 ℃)超聲乳化5min，在800r·min-1的轉速下磁力攪拌乳化10min，后將轉速調至300r·min-1，室溫揮發(fā)有機溶劑至溶液澄清，用正己烷清洗微球，抽濾，晾干，備用。

處方B：在內相O1中加入MMT-BH30mg，BH35mg，丙烯酸樹脂(RS∶RL=1∶1)400mg，檸檬酸三乙酯80mg，甘油80mg，吐溫-80 124mg和乙腈5mL；外相O2為輕質液體石蠟10mL和司盤-80 248mg的混合液。將O1緩慢滴加到O2中，冰水浴(5～10 ℃)超聲乳化15min，在800r·min-1的轉速下磁力攪拌乳化90min，后將轉速調至650r·min-1，室溫攪拌至有機溶劑揮發(fā)完全，待溶液澄清，用正己烷清洗微球，抽濾，晾干備用。

2.4鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球物化性能

2.4.1微球形態(tài)學測定肉眼觀察，2種處方制備的蒙脫石載藥微球均為白色粉末，且均勻細膩；光學顯微鏡下觀察到微球為圓整的球形，相互之間無粘連，分散性較好；掃描電鏡放大后可看出處方A微球致密均勻，表面較為圓滑，無藥物顆粒的吸附；處方B微球表面有顆粒析出，且整個微球的圓整性不如前者完美，見圖1。

圖1掃描電鏡照片

A.處方A制備微球;B.處方B制備微球

Fig.1Scanningelectronmicrographs

A.microspherespreparedbyprescriptionA;B.microspherespreparedbyprescriptionB

2.4.2微球載藥量和包封率的測定精密稱取微球30mg，加入1mL二氯甲烷，超聲使微球完全溶解，再向其中移取30mL去離子水，渦旋2～5min，34 ℃恒溫振蕩2h，離心，取上清液，過濾，稀釋適當倍數(shù)，在274nm波長處測定其A值，代入標準曲線中計算BH的質量濃度C，并按照公式(1)和(2)計算載藥量與包封率：

(1)

(2)

按照上述測定載藥量和包封率的方法分別對處方A和B制備的載藥微球進行測定，測得處方A的載藥量和包封率分別為14.31%和64.92%，處方B的載藥量和包封率分別為5.21%和64.92%。

2.4.3體外釋放性能考察精密稱取微球30mg，置于含有5mL人工淚液的透析袋中，扎緊透析袋兩端，將透析袋置于35mL人工淚液中，在34±1 ℃水浴中恒溫振蕩，在規(guī)定時間精密移取5mL外相介質，并同時補充5mL新鮮介質，在274nm處測定樣品吸光度。以微球的累積釋放量對時間作曲線圖，見圖2。2.5微球滴眼劑的制備先制備質量濃度為1.5g·L-1的卡波姆934P溶液，將最優(yōu)處方A制備的MMT-BH微球、質量濃度為0.1mg·mL-1的吐溫-80、適量甘露醇和氫氧化鈉溶液加入卡波姆溶液中，置于分散均質機中,以10 000r·min-1轉速均質10min制備混懸液。制得混懸液呈白色，均勻細膩，BH質量濃度為2.790±0.006mg·mL-1，沉降體積比大于0.9，分散性良好，pH值為7.0，黏度為4.5mPa·s左右，滲透壓在270～400mOsm·kg-1之間，滿足眼用滴眼劑要求。

圖2鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球累積釋放曲線

Fig.2ThecumulativereleasecurveofMMT-BHmicrospheres

2.6微球滴眼劑初步刺激性考察

2.6.1實驗動物及藥物將健康、角膜正常的家兔(廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物質量合格證編號4407207133)分組并進行編號(每組3只)：第1組為空白對照組(A)，不給藥；第2組為質量濃度為2.8mg·mL-1的BH水溶液組(B)；第3組為混懸液空白介質組(C)；第4組為鹽酸倍他洛爾微球滴眼劑組(D)；第5組為MMT-BH混懸液組(E)；第6組為市售貝特舒組(F)。

2.6.2長期給藥刺激性實驗選取6只家兔，按照2.6.1項下方法對家兔進行分組。每只家兔左眼滴入供試樣品，右眼滴入生理鹽水作為對照，每天早晚各給藥50μL，連續(xù)給藥21d，在給藥后1，2，4，24，48和72h對眼部組織進行檢查。

2.6.3單次超劑量給藥刺激性實驗另取6只家兔，同樣按照2.6.1項下方法對家兔進行分組。單次給藥1mL，在給藥后1，2，4，24，48和72h對眼部組織進行檢查。

按照Draize眼部刺激性標準，0～3分為無刺激性；4～8分為輕度刺激性；9～12分為中度刺激性；13～16分為強度刺激性。角膜各項評分均為0，表明混懸劑對角膜無刺激，B組中有1只兔眼虹膜上出現(xiàn)皺褶加深，因而得0.3分；A組和生理鹽水結膜均出現(xiàn)輕微充血狀況，給藥后充血更為嚴重，表明各樣品對結膜均有輕微的刺激作用。長期和單次大劑量刺激實驗的刺激性評分都在0～3分之間，說明鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球滴眼劑對眼部無明顯刺激性。

2.6.4眼部組織學檢查將2.6.2和2.6.3項下36只家兔進行耳緣靜脈注射空氣處死，摘取眼球并進行各組織的剝離，用質量濃度為100g·L-1的甲醛固定24h，進行石蠟包埋切片，做常規(guī)HE染色，在光學顯微鏡中觀察組織的細胞病變情況。結果見圖3～4。

圖3　家兔角膜HE切片(HE×400)

A.空白對照組；B.BH水溶液；C.混懸液空白介質；D.鹽酸倍他洛爾微球滴眼劑；E.MMT-BH混懸液；F.市售貝特舒；G.鹽酸倍他洛爾微球滴眼劑單次大劑量；H.MMT-BH混懸液單次大劑量；I.生理鹽水

Fig.3RabbitcorneaHEsection(HE×400)A.controlgroup；B.BHsolution；C.suspensionofblankmedia；D.betaxololhydrochloridemicrosphereseyedrops；E.MMT-BHsuspension；F.betopic；G.thesinglehighdoseofbetaxololhydrochloridemicrosphereseyedrops；H.thesinglehighdoseofMMT-BHsuspension；I.normalsaline

圖4結膜HE切片(HE×200)

A.空白對照組；B.水溶液；C.混懸液空白介質；D.鹽酸倍他洛爾微球滴眼劑；E.MMT-BH混懸液；F.市售貝特舒；G.鹽酸倍他洛爾微球滴眼劑單次大劑量；H.MMT-BH混懸液單次大劑量；I.生理鹽水

Fig.4RabbitconjunctivaHEsections(HE×200)

A.controlgroup；B.BHsolution；C.suspensionofblankmedia；D.betaxololhydrochloridemicrosphereseyedrops；E.MMT-BHsuspension；F.betopic；G.thesinglehighdoseofbetaxololhydrochloridemicrosphereseyedrops；H.thesinglehighdoseofMMT-BHsuspension；I.normalsaline

由圖3～4可知，正常角膜表面光滑平整，各層組織排列規(guī)則；C組角膜表面局部凹凸不平，較多上皮細胞體積增大、腫脹、變形、核周蒼白且后彈力層似與內皮細胞層脫離，損傷最為嚴重；A組結膜亦有輕度炎癥反應，表現(xiàn)為個別上皮細胞溶解消失；B組結膜組織上皮少量淋巴細胞浸潤，商品貝特舒結膜組織內有部分淋巴細胞浸潤，但D和E組只出現(xiàn)了與生理鹽水組相當?shù)妮p度炎癥反應，說明原料藥溶液和貝特舒對結膜有刺激作用，且刺激程度均大于D和E組。

3　討論

乳化溶劑揮發(fā)法是制備微球最為常見的方法。本文采用2種處方以O1/O2溶劑揮發(fā)法制備鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球，以微球的載藥量、包封率、體外釋放性能和形態(tài)為指標進行物化性能的對比。其中測得最優(yōu)處方A制備微球的載藥量和包封率分別為14.31%和94.35%，是處方B的2.75和1.45倍；體外釋放性能顯示，處方B在15min時累積釋放量達到43.05%，存在明顯的突釋；結合SEM圖片，可以觀察到處方B微球表面有顆粒的吸附，且整個微球的圓整性不如處方A完美；由BH在水中溶解度為16.94mg·mL-1可知，該藥物為水溶性藥物，且研究表明MMT具有可以減小水溶性藥物微球突釋的特性[15]；處方A和B在BH的用量方面差異不大，但處方A蒙脫石用量為B的1.7倍。通過以上結果探討出：處方B制備的MMT-BH微球載藥量和包封率低是因為BH被MMT吸附進去的較少，藥物大多停留在微球表面；同時也證明MMT作為緩控釋載體的巨大潛能。后續(xù)還需繼續(xù)探討制備微球的更好方法，爭取在載藥量和粒徑上有更大的突破。

初步刺激性考察實驗中，生理鹽水組炎癥反應超過實驗組，這可能是由于結膜被環(huán)境中的病原微生物感染而導致結膜部位有輕微炎癥。通過對兔眼眼部組織進行檢查，可以得出制備的鹽酸倍他洛爾/蒙脫石微球滴眼劑對眼部無明顯刺激性，且刺激性明顯低于市售貝特舒。這只是對兔眼進行初步刺激性考察，存在一定的局限性，后期還需要對該制劑進行細胞毒性實驗、雞胚刺激性實驗以及藥動學的研究。

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Studies on the preparation and irritation of betaxolol hydrochloride microspheres loaded by montmorillonite

HUANG Yi1，HOU Dongzhi1*，PAN Yufang1，LIU Li1，GUI Ruyi1，HU Sheng1，TIAN Shuangyan1，PING Qineng2，CHEN Yanzhong1

(1.College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

ObjectiveTopreparetheeyedropsofbetaxololhydrochloridemicrospheresloadedbymontmorilloniteandtostudyitsirritation.MethodsMontmorilloniteswereusedasionexchangecarriermaterialforhydrochloridemicrospheresinthisstudy.ThebetaxololhydrochloridemicrosphereswerepreparedwithO1/O2solventevaporationmethodusingtwodifferentformulations.Toobtaintheoptimalformulations，thepreparationparameterswereinvestigated，suchasdrug-loadingrate，andtheencapsulationefficiency，etc.Theoptimalformulationwasadoptedtopreparethetheeyedropsofbetaxololhydrochloridemicrospheresloadedbymontmorillonite.Theirritationofthepreparedeyedropswasresearched.ResultsTheoptimalfomulationwasdescribedasfollows:300mgofacrylicresin(RS∶RL=1∶3)，60mgoftriethylcitrate，30mgofglycerin，400mgofemulgator(Tween-80∶Span-80=1∶2)，30mgofbetaxololhydrochlorideand50mgofmontmorillonite.Inaddition，thevolumeratioofinternalphasetoexternalphasewas1∶6.Thedrug-loadingrate，andtheencapsulationefficiencyofmicrospherespreparedbytheoptimalformulationwere14.31%and94.35%，respectively.Theirritationtestsshowedthattheeyedropshadnoobviousirritationforeyetissues.ConclutionsThepreparationofmicrospheresissimpleandreproducibleandtheeyedropshasnoobviousirritation.

montmorillonite；betaxololhydrochloride；microspheres；irritation

國家自然科學基金項目(編號：51102052)；廣東省醫(yī)學科學技術研究基金(立項編號：A2016275)

黃燚，女，碩士研究生

侯冬枝，女，博士，副教授

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.016

R944

A

1004-2407(2016)05-0493-04

2015-12-15)