心欣舒膠囊對實驗性心肌梗死大鼠的保護作用及機制

申旭霽，?！櫍垺?，李西寬，孫　強*

(1.西安醫(yī)學(xué)院，西安　710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，西安　710061； 3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安　710061)

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心欣舒膠囊對實驗性心肌梗死大鼠的保護作用及機制

申旭霽1,3，常潤2，茍偉3，李西寬3，孫強3*

(1.西安醫(yī)學(xué)院，西安710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，西安710061； 3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安710061)

目的探討心欣舒膠囊對實驗性心肌梗死大鼠心肌的保護作用及冠狀動脈新生血管生成的影響。方法采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法制作大鼠心肌梗死模型，觀察中成藥心欣舒膠囊對實驗性心肌梗死大鼠心肌梗死面積及血管生成的影響。建立心肌梗死模型4周后采用Mallory染色檢測心肌梗死面積及免疫組化染色測定梗死邊緣區(qū)血管內(nèi)皮舒張因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和Ⅷ因子的表達量以及血管面密度。結(jié)果心欣舒膠囊大、小劑量治療組大鼠心肌梗死面積均明顯小于模型組，而心肌梗死邊緣區(qū)VEGF、bFGF和Ⅷ因子的表達量以及血管面密度較對照組均明顯增加。結(jié)論心欣舒膠囊能減輕實驗性心肌梗死大鼠的梗死面積，促進心肌冠脈側(cè)枝循環(huán)的生成，對缺血心肌具有保護作用。

心欣舒膠囊； 血管生成；心肌梗死

心欣舒膠囊是臨床心內(nèi)科常用處方，其主要成分為黃芪、地黃、五味子、丹參、赤芍、桂枝和人參莖葉總皂苷等；用于氣陰兩虛所致的胸痹、心悸以及冠心病、心絞痛、心肌炎屬上述證候者[1-2]。本研究采用實驗性心肌梗死大鼠模型，研究心欣舒膠囊對心肌梗死大鼠心肌梗死面積及冠脈血管再生的影響及其可能的機制。

1　儀器與材料

1.1儀器BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；IX-70熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPLUS有限公司)。

1.2試藥心欣舒膠囊(陜西東科制藥有限責(zé)任公司，批號：140603)；肝素鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：140601)；重組牛堿性成纖維細胞成長因子(rb-bFGF，貝復(fù)濟，珠海億勝生物制藥有限公司，批號：20141003)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，堿性成纖維細胞因子(bFGF)，Ⅷ因子試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3動物健康SPF級8周齡SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250g，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供。

2　方法

2.1動物造模成年SD大鼠用乙醚麻醉，在左側(cè)第4肋間隙鈍性分離胸廓，打開胸腔，輕輕擠壓暴露心臟，剪開心包后在肺動脈圓錐與左心耳交界稍下1～2mm處用5號外科手術(shù)縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，當(dāng)縫合線結(jié)扎以下心肌變白、搏動減弱且心電圖檢測ST段弓背向上抬高則為造模成功[3]。造模當(dāng)天開始每天肌注青霉素1次(20萬u)，共3d。

2.2實驗分組及給藥大鼠造模成功后將存活的大鼠47只分為5組:心欣舒小劑量組(1組)、心欣舒大劑量組(2組)、陽性對照組(3組)、模型組(4組)、假手術(shù)對照組(5組)，每組8～10只，分別按照下述方法給藥。心欣舒大、小劑量組在心梗造模后開始分別每天給予心欣舒(心欣舒膠囊成人用量為每日口服6.0g，按照體表面積換算成大鼠劑量)0.625和1.25g·kg-1(加入生理鹽水制成2mL的混懸液)灌胃給藥，持續(xù)4周。陽性對照組在開胸結(jié)扎冠脈后給予結(jié)扎噴灑rb-bFGF1撳(125AU)，并于術(shù)后每天皮下注射普通肝素 1 250u·kg-1，共5d；模型組為不給藥組，造模后每天給予2mL生理鹽水灌胃，共4周。假手術(shù)組開胸后不結(jié)扎冠脈，僅用外科縫針空穿1次即縫合胸壁。4周后處死動物，取心臟標本放入體積分數(shù)為15%的福爾馬林中固定備用。

2.3蘇木素-伊紅(H-E)染色及Mallory三色染色心肌標本固定后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片后免疫組化H-E染色及Mallory染色，在光鏡下觀察實驗各組心肌壞死及膠原纖維形成情況。采用ImageJ細胞圖像分析軟件分別測定心肌梗死面積和心室總面積，梗死面積(%)=心肌梗死面積/總面積×100%。

2.4心肌梗死邊緣區(qū)血管面密度測定免疫組化心肌組織Ⅷ因子染色，ImageJ細胞圖像分析軟件測量左室梗死邊緣區(qū)Ⅷ因子陽性染色血管數(shù)，選擇梗死區(qū)周圍血管密度最高的5個區(qū)域，并計數(shù)血管數(shù)目，每份標本取計數(shù)平均值，以平均微血管數(shù)/mm2表示微血管面密度(200×高倍視野等于0.042 6mm2)。2.5心肌梗死邊緣區(qū)VEGF、bFGF及Ⅷ因子表達量的測定心肌組織按照標準流程免疫組化染色，具體步驟見博奧森公司試劑盒操作說明。染色后采用細胞圖像分析系統(tǒng)對VEGF、bFGF和Ⅷ因子進行定量分析。計算陽性區(qū)域所占總面積，每張切片隨機選3個視野取平均值。

3　結(jié)果

3.1蘇木素-伊紅染色(H-E染色)H-E染色在心肌梗死大鼠左心室可見一定范圍的缺血壞死區(qū)心肌纖維溶解斷裂，心肌纖維橫紋消失、腫脹，心肌細胞膠原纖維及部分心肌核溶解消失，可見輕度炎細胞浸潤，缺血區(qū)有心肌纖維化形成，梗死區(qū)內(nèi)外兩側(cè)尚有部分存活心肌。見圖1。

圖1蘇木素-伊紅染色(HE×200)

A.假手術(shù)組；B.模型組

Fig.1Hematoxylin-eosinstain(HE×200)

A.shamoperationgroup；B.modelgroup

3.2心欣舒對心肌梗死區(qū)梗死范圍的影響顯微鏡下Mallory染色心肌纖維組織呈紅色，而膠原纖維呈藍色，見圖2。各組梗死面積結(jié)果見表1。由表1可知，心欣舒大、小劑量組及肝素組梗死面積均較模型組明顯減少，心欣舒小劑量組與肝素組比較心肌梗死面積無明顯差異(P>0.05)，而心欣舒大劑量組與肝素組比較心肌梗死面積減少(P<0.05)。

圖2Mallory三色染色

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.肝素組；D.心欣舒大劑量組；E.心欣舒小劑量組

Fig.2Mallory′strichromestain

A.shamoperationgroup；B.modelgroup；C.heparingroup；D.highdosegroupofXinxinshuCapsules；E.lowdosegroupofXinxinshuCapsules

表1心欣舒對心肌梗死大鼠左室梗死面積的影響

注：與模型組比較aP<0.05，dP<0.01；與肝素組比較bP<0.05；與心欣舒小劑量組比較cP<0.05。-表示未給藥或用生理鹽水灌胃。

3.3心肌梗死邊緣區(qū)血管面密度檢測鏡下給藥組可見較多微小血管均勻分布在心肌組織，給藥組與模型組比較有明顯差異(P<0.01)；心欣舒組與肝素組比較血管生成增多(P<0.01)；心欣舒大、小劑量組血管密度有明顯差異(P<0.01)。見表2。

表2心欣舒對心肌梗死邊緣區(qū)血管面密度的影響

注：與模型組比較aP<0.01；與心欣舒小劑量組對比bP<0.01；與肝素組比較cP<0.01。-表示未給藥或用生理鹽水灌胃。

3.4心肌梗死大鼠左室梗死邊緣區(qū)VEGF、bFGF和Ⅷ因子表達量鏡下VEGF和bFGF陽性染色區(qū)域呈棕黃色，彌散分布于心肌細胞與間質(zhì)，而Ⅷ因子陽性染色區(qū)域則位于血管內(nèi)皮細胞內(nèi)。給藥組陽性染色區(qū)域面積較模型組明顯增加(P<0.01)；而心欣舒大、小劑量組陽性染色面積具有明顯差異，心欣舒小劑量組與肝素組陽性面積差異不明顯(P>0.05)。見表3。

表3心欣舒對左室梗死邊緣區(qū)VEGF、bFGF和Ⅷ因子表達量的影響

Tab.3EffectofXinxinshuCapsulesontheexpressionsofVEGF，bFGFandⅧintheedgeofinfarctsection(μm2)

組別動物數(shù)/只劑量VEGFbFGFⅧ因子 假手術(shù)組9—21056±291.7a23420±211.6a20819±361.7a模型組10—25741±206.127040±311.225793±452.2肝素組81250u·kg-133274±336.0a35273±204.2a34160±293.6a心欣舒小劑量100.625g·kg-135038±348.1a36081±231.7a36742±735.3a心欣舒大劑量101.250g·kg-140752±424.8ab43693±362.4ab43207±235.5ab

注：與模型組比較aP<0.01，與心欣舒小劑量組比較bP<0.05；-表示未給藥或用生理鹽水灌胃。

4　討論

心肌梗死是臨床常見的、威脅人們生命健康的心血管疾病，其主要是由于冠狀動脈供血不足引起的心肌缺血、缺氧及心肌壞死，臨床治療主要以盡快恢復(fù)患者心肌血液的灌注、減小心肌缺血的范圍和避免梗死范圍擴大等為主[1]。心欣舒膠囊主要由人參莖葉總皂苷和黃芪等組成，可明顯改善胸悶、心悸和氣短等癥狀[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，人參莖葉總皂苷和黃芪具有強心和保護心肌的作用，增強心肌收縮、減慢心率、增加心輸出量和冠脈血流量[4-5]，對心肌缺血缺氧和再灌注損傷等具有明顯保護作用，其中丹參和赤芍可改善血液循環(huán)，抑制血小板聚集，抗動脈粥樣硬化[6-8]；桂枝具有擴張冠狀動脈、增加微小血管和冠脈血流量的作用。這些均對冠心病、心絞痛的發(fā)生、發(fā)展有積極的預(yù)防和治療作用[1]。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測心肌梗死大鼠心肌內(nèi)皮細胞Ⅷ因子的表達，計算梗死灶及邊緣區(qū)的微血管密度，結(jié)果表明，心欣舒膠囊能顯著增加梗死邊緣區(qū)的血管面密度 (P<0.05)，其作用隨藥物的劑量增加而有加強趨勢。陽性對照組采用的rb-bFGF/肝素，是已知的有明確促進血管新生的藥物，而血管生長因子(VEGF和bFGF等)可促進梗死周圍心肌組織血管新生[9]，研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥有降低梗死面積和促進血管新生的作用[10]。實驗表明，心欣舒膠囊能顯著減少心肌梗死大鼠的心肌梗死面積，增加梗死邊緣區(qū)血管生長因子(VEGF，bFGF)的表達量，增加梗死邊緣區(qū)血管面密度。盡管缺血性心臟病患者存在自發(fā)形成側(cè)支循環(huán)的趨勢，但其速度與程度均不足以代償機體的需要，而血管再生性治療可促進形成和開放冠脈側(cè)支循環(huán)，為缺血心肌提供新的血液供應(yīng)[10]。因此，心欣舒膠囊有促進心肌缺血區(qū)血管生成的作用，并通過此作用保護缺血心肌，從而減少心肌梗死面積。

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Protective effect and mechanisms of Xinxinshu Capsules on experimental myocardial infarction in rats

SHEN Xuqi1,3，CHANG Run2，GOU Wei3，LI Xikuan3，SUN Qiang3*

(1.Xi′anMedicalSchool，Xi′an710021，China；2.SchoolofPharmacy，Xi′anJiaotongUniversity，Xi′an710061，China；3.SchoolofBasicMedicalSciences，Xi′anJiaotongUniversityofMedicine，Xi′an710061，China)

ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsofXinxinshuCapsulesonexperimentalmyocardialinfarctioninratsinducedbyleftanteriordescendingbranchofcoronaryartery.MethodsLeftanteriordescendingcoronaryarteriesofratswereligatedtoproduceacutemyocardialinfarctionmodel.ImmunohistochemistywasusedtodetectthecontentsofVEGF，bFGF，Ⅷfactorandvasculardensityintheedgeofinfarctsection，andtheinfarctareawasmeasured.ResultsTheinfarctareasintreatmentgroupswereobviouslylessthaninmodelgroup.ThecontentsofVEGF，bFGFandⅧfactorintheedgeofinfarctsectionandvasculardensityintreatmentgroupsweresignificantlyincreasedcomparedwiththoseinmodelgroup.ConclusionXinxinshuCapsulescandecreasetheinfarctareaandstimulateangiogenesisofthecollateralbranchofcoronaryarteryinischemicmyocardiumofrats，andshowedgoodprotectiveeffectonmyocardialischemia.

XinxinshuCapsules；angiogenesis；myocardialinfarction

申旭霽，男，碩士,講師

孫強，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.015

R965

A

1004-2407(2016)05-0489-04

2015-12-10)