正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選健腎Ⅰ號(hào)膠囊水煎提取工藝

陳夢(mèng)鈺，牛倩倩，焦海勝

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州　730000；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，蘭州　730030)

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正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選健腎Ⅰ號(hào)膠囊水煎提取工藝

陳夢(mèng)鈺1，2，牛倩倩1，焦海勝2*

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州730000；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，蘭州730030)

目的優(yōu)選健腎Ⅰ號(hào)膠囊水煎提取工藝。方法采用正交實(shí)驗(yàn)L934法，以干浸膏得率和沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸含量的綜合評(píng)分為指標(biāo)，考察提取時(shí)間、液料比和提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果影響水煎提取工藝的因素次序依次為提取時(shí)間(A)>提取次數(shù)(C)>液料比(B)。最佳提取工藝條件為A3B1C3，即處方藥材加6倍量水，水煎提取3次，每次3 h。結(jié)論優(yōu)選的水煎提取工藝穩(wěn)定，合理可行，可用于健腎Ⅰ號(hào)膠囊的實(shí)際配制。

健腎Ⅰ號(hào)膠囊；正交實(shí)驗(yàn)法；水煎提取

健腎Ⅰ號(hào)膠囊(Jianshen CapsulesⅠ，JCⅠ)為蘭州大學(xué)第二醫(yī)院自制的中藥制劑，由忍冬藤、地榆、紅景天、龍葵、烏藥、石韋、海金沙和益智仁8味中藥制成，具有清熱解毒、利濕通淋的功效，主要用于尿道炎、膀胱炎、急性腎盂腎炎和前列腺炎的治療。為了更好地發(fā)揮其臨床療效，保證其臨床療效的穩(wěn)定性，本文用HPLC法同時(shí)測(cè)定健腎Ⅰ號(hào)膠囊中沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸的含量，采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)其提取工藝進(jìn)行了考察，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀，G1314B-VWD檢測(cè)器，ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱 (美國(guó)安捷倫公司，250 mm×4.6 mm，5 μm)；ME215S型吉尼斯系列電子分析天平(德國(guó)賽多利斯儀器有限公司)；CQ50超聲波清洗機(jī)(上海超聲波儀器廠)；202A-00型恒溫干燥箱(上海新正機(jī)械儀器制造有限公司)；BD-11多功能紫外分析儀(北京啟航博達(dá)科技有限公司)。

1.2試藥方中藥材均購(gòu)自甘肅隴脈藥材有限公司，均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)照品：沒(méi)食子酸(批號(hào)110831-201204，供含量測(cè)定用)，紅景天苷(批號(hào)110818-201206，供含量測(cè)定用)，綠原酸(批號(hào)110753-200413，供含量測(cè)定用)，咖啡酸(批號(hào)110885-200102，供含量測(cè)定用)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究所；甲醇、乙腈(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)為色譜純；水為蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1含量測(cè)定

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 供試品溶液的制備 分別稱取正交實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下9份供試品浸膏各1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲10 min，提取3次，合并濾液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm濾膜，取濾液作為供試品溶液。

2.1.1.2混合對(duì)照品溶液的制備精密稱取沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸對(duì)照品，加甲醇制成含沒(méi)食子酸2.13 mg·mL-1、紅景天苷0.60 mg·mL-1、綠原酸1.62 mg·mL-1和咖啡酸0.91 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.1.1.3陰性樣品溶液的制備取除地榆、忍冬藤、紅景天和石韋外的其他處方藥材，依法制備缺少地榆、忍冬藤、紅景天和石韋的水提取物陰性樣品，按照2.1.1.1項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.1.2色譜條件色譜柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相[1，3]：乙腈-1 mol·L-1磷酸溶液(5∶95)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)[2-4]：0～28 min(273 nm)，28～60 min(325 nm)；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。理論板數(shù)均不低于3 000，對(duì)應(yīng)色譜峰的分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.沒(méi)食子酸；2.紅景天苷；3.綠原酸；4.咖啡酸

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.gallic acid；2.salidroside；3.chlorogenic acid；4.caffeic acid

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取2.1.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液梯度稀釋制成4份不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別吸取不同體積的對(duì)照品溶液進(jìn)樣[5-7]，照2.1.2項(xiàng)下色譜條件，以進(jìn)樣量(μg)對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1線性關(guān)系結(jié)果

Tab.1 The results of linear relationship

成分回歸方程r線性范圍/μg沒(méi)食子酸Y=2677.8X+129.70.99950.1078～10.65紅景天苷Y=207.93X+1.94820.99990.0101～6.00綠原酸Y=2729.0X-16.8080.99970.0273～8.10咖啡酸Y=4635.3X-28.5050.99980.0154～4.55

2.1.4精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一水提供試品溶液，按照2.1.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣5μL。沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD值分別為0.57%，0.65%，0.51%和0.60%(n=6)。

2.1.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批水提供試品溶液，按照2.1.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，每次進(jìn)樣5μL。沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD值分別為0.92%，1.23%，1.01%和1.15%(n=6)。2.1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一水提供試品溶液，分別在0，2，4，8，16，24和48h進(jìn)樣5μL，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD值分別為1.29%，0.96%，0.72%和0.75%。

2.1.7回收率實(shí)驗(yàn)稱取已知含量的同一批水提供試品各0.1g，共6份，分別精密加入沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸混合對(duì)照品溶液1mL(其中沒(méi)食子酸1.12mg·mL-1、紅景天苷0.13mg·mL-1、綠原酸0.12mg·mL-1和咖啡酸0.05mg·mL-1)，按照供試品溶液制備方法和測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，記錄沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2Theresultsofrecovery

成分樣品中的量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%沒(méi)食子酸0.91201.122.022398.9498.360.800.92601.122.030798.350.90351.122.016399.200.91901.122.028598.860.90431.121.999897.290.91141.122.008997.53紅景天苷0.10420.130.233198.8497.601.010.10550.130.233397.910.10530.130.232297.050.10570.130.234198.490.10780.130.234697.030.10990.130.235896.27綠原酸0.10850.120.227899.3598.171.230.10770.120.224597.030.10560.120.222697.160.10620.120.223197.080.10490.120.223798.860.10890.120.228499.54咖啡酸0.04370.050.092396.8097.341.710.04490.050.093095.770.04510.050.093897.120.04620.050.094295.670.04480.050.094398.880.04310.050.093099.77

2.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)按照處方量稱取處方藥材，共9份，依次按照正交實(shí)驗(yàn)表法進(jìn)行水煎提取，合并濾液，濃縮，移至蒸發(fā)皿，置于烘箱中，60 ℃烘干至恒定質(zhì)量[8]。精密稱取浸膏適量，置于錐形瓶中，依法測(cè)定沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸含量，計(jì)算浸膏得率。以干浸膏得率和沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸含量的綜合評(píng)分為指標(biāo)[9]，以提取時(shí)間、液料比和提取次數(shù)為考察因素，因素水平、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表3～5。

表3健腎Ⅰ號(hào)膠囊的提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平

Tab.3TheextractionprocessfactorandlevelofJianshenCapsulesⅠ

水平因素A,提取時(shí)間/hB,液料比/倍C,提取次數(shù)/次1161228233103

表4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.4Resultsoftheorthogonaltests

編號(hào)ABCD(空白)沒(méi)食子酸量/mg·g-1紅景天苷量/mg·g-1綠原酸量/mg·g-1咖啡酸量/mg·g-1干浸膏得率/%綜合評(píng)分111110.3810.0311.3890.21514.4116.725212227.2490.3990.9410.13420.2532.896313336.3970.4480.6580.09223.6928.949421238.9680.4412.5810.22721.2950.436522316.9540.4613.2090.10326.2746.613623127.8210.9201.1530.11916.2744.788731329.1621.0341.0840.43624.3959.191832137.1050.2291.0660.48315.6941.003933219.4480.5261.5190.29622.9648.579K126.19042.11734.17237.306K247.27940.17143.97045.625K349.59140.77244.91840.129R23.4011.94610.7468.319

注：綜合評(píng)分=沒(méi)食子酸量/9.448×20+紅景天苷量/1.034×15+綠原酸量/3.209×20+咖啡酸量/0.443×15+干浸膏得率/26.27×30

表5方差分析結(jié)果

Tab.5Resultsofanalysisofvariance

方差來(lái)源SSfFF臨界值PA997.6982167.37119.000<0.05B5.96121.00019.000>0.05C212.374235.62719.000<0.05D(誤差)5.9602

由表4～5可知,各因素對(duì)提取工藝的影響順序?yàn)锳>C>B；因素A和C具有顯著性影響，因素B不具有顯著性影響。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用與配制，將水煎提取最佳工藝確定為A3B1C3，即加6倍量水，水煎提取3次，每次3h。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)稱取處方藥材，共3份，按照最佳工藝進(jìn)行提取，結(jié)果測(cè)得干浸膏得率分別為23.90%，24.35%和24.41%；沒(méi)食子酸的含量分別為9.260，9.170和9.095mg·g-1；紅景天苷的含量分別為1.031，1.043和1.052mg·g-1；綠原酸的含量分別為1.082，1.079和1.057mg·g-1；咖啡酸的含量分別為0.433，0.446和0.439mg·g-1。結(jié)果表明，該提取工藝穩(wěn)定可行。

3　討論

健腎Ⅰ號(hào)膠囊組方是蘭州大學(xué)第二醫(yī)院在醫(yī)藥辨證施治原則的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)以及現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果化裁而來(lái)。為了保持中藥湯劑的特點(diǎn)，發(fā)揮中藥復(fù)方功效及其整體調(diào)理作用，結(jié)合實(shí)際中藥湯劑用藥情況，選取水煎提取法。健腎Ⅰ號(hào)膠囊，由忍冬藤、地榆、紅景天、龍葵和烏藥等8味中藥組成。其中，忍冬藤為君藥，其有效成分綠原酸和咖啡酸具有抗炎[10-11]、抗菌活性[12-14]，具有清熱解毒、通風(fēng)通絡(luò)功能[15]；地榆、紅景天為方中臣藥，其中地榆的有效成分為沒(méi)食子酸，具有涼血止血的功效[15]；紅景天的有效成分為紅景天苷，具有益氣活血、抗炎和增強(qiáng)免疫力[16-18]等作用；4種成分相輔相成發(fā)揮健腎功效。因此，選擇沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸和紅景天苷作為篩選健腎Ⅰ號(hào)膠囊水煎提取工藝的主要指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選健腎Ⅰ號(hào)膠囊水煎提取最佳工藝。結(jié)果顯示，優(yōu)選的健腎Ⅰ號(hào)膠囊水煎提取工藝穩(wěn)定，合理可行，為配制該制劑提供了理論依據(jù)，可用于健腎Ⅰ號(hào)膠囊的實(shí)際配制。

沒(méi)食子酸、紅景天苷、綠原酸和咖啡酸均為水溶性成分，采用水煎提取工藝，既符合中藥湯劑的特點(diǎn)，又能將藥材的有效成分提取得比較完全，避免了使用其他有機(jī)溶媒可能帶入的污染及毒性。符合醫(yī)院制劑實(shí)際配制情況，便于患者使用和接受。綜上所述，優(yōu)選的健腎Ⅰ號(hào)膠囊水煎提取工藝穩(wěn)定，合理可行，為配制該制劑提供了理論依據(jù)，可用于健腎Ⅰ號(hào)膠囊的實(shí)際配制。

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Optimization of water extraction procedure for Jianshen CapsulesⅠwith orthogonal experimental design

CHEN Mengyu1,2，NIU Qianqian1，JIAO Haisheng2*

(1.College of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.Department of Pharmacy，the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China)

Objective To optimize the water decocting extraction procedure for Jianshen CapsulesⅠ.Method With the comprehensive score of the yield of dry extract，gallic acid，salidroside， chlorogenic acid，and caffeic acid as index，L934orthogonal experimental design was carried out to optimize the extraction process by taking the extraction time， liquid-solid ratio and extraction times as factors. Results The influencing order of the factors was A>C>B(A: extracting time，B: liquid-solid ratio，C: extracting times). The optimal extraction conditions were A3B1C3.The optimal extraction process was as follows: the ratio of liquid-solid was 6，the extraction times were 3，the extraction time was 3 h.Conclusion This optimal water decocting extraction procedure was stable and feasible. It can be used in the real preparation for Jianshen Capsules Ⅰ.

Jianshen CapsulesⅠ；orthogonal design test；water decocting extraction

陳夢(mèng)鈺，女，在讀碩士研究生

焦海勝，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.004

R284

A

1004-2407(2016)05-0451-05

2015-11-23)