NET基因甲基化與職業(yè)緊張性高血壓的關(guān)聯(lián)性研究

李　榕， 高曉燕， 劉　波， 熊　菲， 劉繼文

(新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院， 2第五附屬醫(yī)院， 烏魯木齊　830011)

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NET基因甲基化與職業(yè)緊張性高血壓的關(guān)聯(lián)性研究

李榕1， 高曉燕1， 劉波1， 熊菲2， 劉繼文1

(新疆醫(yī)科大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院，2第五附屬醫(yī)院， 烏魯木齊830011)

目的比較不同職業(yè)緊張程度和血壓水平下去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體(NET)基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平，探討表現(xiàn)遺傳學(xué)在職業(yè)緊張與高血壓相關(guān)性中的作用。方法采用亞硫酸氫鹽克隆測(cè)序法處理基因組DNA，隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。結(jié)果各組間NET基因啟動(dòng)子區(qū)CpG1 及CpG7的DNA甲基化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)LSD兩兩比較，對(duì)照組-高職業(yè)緊張組、高血壓-高職業(yè)緊張組甲基化水平高于高血壓-低職業(yè)緊張組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他不同組合組間的CpG位點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論職業(yè)緊張組中高血壓醫(yī)務(wù)人員其N(xiāo)ET基因啟動(dòng)子區(qū)CpG1及CpG7位點(diǎn)DNA甲基化水平與對(duì)照組不同，提示表觀遺傳學(xué)在職業(yè)緊張與高血壓之間起一定的調(diào)控作用。

職業(yè)緊張； 高血壓； 甲基化

隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)于職業(yè)精神應(yīng)激的關(guān)注度越來(lái)越高。同時(shí)，職業(yè)精神應(yīng)激所導(dǎo)致的原發(fā)性高血壓(EH)及其遺傳發(fā)病機(jī)制方面的研究也取得了很大的進(jìn)展。目前普遍認(rèn)為高血壓是一種復(fù)雜性的疾病，環(huán)境和遺傳因素共同影響高血壓的發(fā)生和發(fā)展[1]。表觀遺傳學(xué)是指在基因堿基序列發(fā)生改變的情況下，由于環(huán)境和遺傳因素相互作用，從而導(dǎo)致基因功能產(chǎn)生了某些可遺傳或可逆的變化。目前，DNA甲基化是一個(gè)研究熱點(diǎn)。

流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究發(fā)現(xiàn)，在遺傳素質(zhì)相同的職業(yè)人群中，職業(yè)精神應(yīng)激不同，則 EH 的患病率也不同。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，職業(yè)應(yīng)激與EH之間存在顯著關(guān)聯(lián)性[2-4]。但亦有研究發(fā)現(xiàn)，高緊張狀態(tài)的職業(yè)人群不會(huì)都發(fā)生高血壓，同時(shí)兩者之間呈現(xiàn)時(shí)間和程度上的依賴(lài)性[5-10]。

此外，遺傳因素或者相關(guān)基因也影響著高血壓的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體(NET)基因與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體是將突觸間隙的去甲腎上腺素重?cái)z取到突觸前神經(jīng)末梢的可溶性載體蛋白，其編碼基因NET位于染色體16q12.2[11]。Markus等[12]研究表明，高血壓患者NET基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平明顯高于健康受試者，且伴隨著結(jié)合于該區(qū)域的CpG結(jié)合蛋白含量增加，甲腎上腺素(NE)再攝取減少，從而使細(xì)胞外NE水平升高、交感神經(jīng)興奮性增加。這可能是與甲基化介導(dǎo)的基因沉默導(dǎo)致NET功能出現(xiàn)異常有關(guān)。而Keller等[13]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)NET基因敲除后，會(huì)表現(xiàn)出心動(dòng)過(guò)速和血壓升高的現(xiàn)象。本研究擬通過(guò)比較不同職業(yè)緊張程度和血壓水平下NET基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平的差異，初步探討表觀遺傳學(xué)在職業(yè)緊張與高血壓相關(guān)性中的作用。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象按照職業(yè)緊張程度及高血壓危險(xiǎn)因素分層，其中以確診為高血壓的20例患者作為本次研究的病例組，并從調(diào)查人群中選取同性別、年齡相差3歲、同民族的醫(yī)務(wù)人員20名作為對(duì)照組進(jìn)行病例對(duì)照研究，最終共納入40名研究對(duì)象。按照職業(yè)緊張程度高低和有無(wú)高血壓分為高血壓-低職業(yè)緊張組、高血壓-高職業(yè)緊張組、對(duì)照組-低職業(yè)緊張組、對(duì)照組-高職業(yè)緊張組4組，每組10例。所有研究對(duì)象均為自愿參加本次研究，并簽署知情同意書(shū)，本研究承諾對(duì)研究對(duì)象的個(gè)人信息嚴(yán)格保密。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)病例組：根據(jù)2012年高血壓防治指南規(guī)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)選取病例組研究對(duì)象，包括：(1)未使用降壓藥物者，不在同一天，且3次坐位測(cè)量的血壓值為收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg者；(2)既往有高血壓史，雖正服降壓藥，且血壓<140/90 mmHg者，仍診斷為高血壓。排除有繼發(fā)性高血壓、嚴(yán)重腎病、肝功能障礙、瓣膜性心臟病、心肌病患者；6個(gè)月內(nèi)發(fā)生過(guò)不穩(wěn)定性心絞痛者；孕婦及哺乳期婦女；酗酒者、濫用藥物或精神疾病史者。對(duì)照組：無(wú)高血壓降壓藥物治療史，無(wú)繼發(fā)性高血壓、糖尿病、其他心血管疾病、肝腎疾病史等，無(wú)慢性疾病者。

1.3方法

1.3.1血壓測(cè)量測(cè)量前，囑被調(diào)查者靜坐10 min，由體檢中心醫(yī)務(wù)人員采用汞柱式血壓計(jì)對(duì)其進(jìn)行血壓測(cè)量。測(cè)量時(shí)，研究對(duì)象行坐位，肘部和心臟同一水平，測(cè)量右上臂血壓3次，若血壓≥140/90 mmHg，讓其靜坐休息15 min后再次測(cè)量2次，取平均值。

1.3.2一般資料主要包括研究對(duì)象的一般人口學(xué)特征資料和生活行為習(xí)慣資料的收集。一般人口學(xué)特征資料包括：年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)；生活行為習(xí)慣資料包括：吸煙、飲酒及運(yùn)動(dòng)量。職業(yè)緊張分組：主要是根據(jù)工作緊張測(cè)量問(wèn)卷(JSS)中的工作緊張指數(shù)得分對(duì)職業(yè)緊張程度進(jìn)行分組，采用四分位節(jié)點(diǎn)法將其劃分為低職業(yè)緊張組、中職業(yè)緊張組、高職業(yè)緊張組。

1.3.3血樣采集研究對(duì)象在采血前3天禁止高鹽高脂飲食，采血當(dāng)日早晨禁食，于8∶00到9∶30間靜脈穿刺采血5 mL于EDTA抗凝管，并-80℃保存待測(cè)。體格檢查及信息采集均在上午完成。

1.3.4目標(biāo)序列確定通過(guò)檢索UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行確定。并經(jīng)PubMed、CpG Island Searcher檢索后發(fā)現(xiàn)NET基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島主要集中于-501～+1 175 bp(NCBI序列登錄號(hào)AF061198和NC_000016)之間，并且以往研究主要集中于-872～-514 bp、-515～-215 bp和-180～+167 bp這3個(gè)區(qū)域的DNA甲基化研究。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)-180～+167 bp區(qū)域的甲基化程度極低，-872～-514 bp區(qū)域處于CpG島邊緣，檢測(cè)難度較大，因此選擇-515～-215 bp區(qū)域進(jìn)行DNA甲基化分析。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.5NET基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平測(cè)定目前最常用的DNA甲基化測(cè)定手段有MSP(methylation specific, PCR)和DNA測(cè)序等。本研究采用的是焦磷酸測(cè)序技術(shù)，它是基于DNA序列分析技術(shù)，是4種酶催化同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)反應(yīng)，焦磷酸基團(tuán)最終轉(zhuǎn)化成的可見(jiàn)光信號(hào)，并轉(zhuǎn)化為峰值，通過(guò)儀器檢測(cè)DNA甲基化位點(diǎn)的峰值比值來(lái)確定甲基化水平[8]。

1.4質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制嚴(yán)格遵守分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的操作規(guī)則和流程。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的一次性槍頭、EP管、PCR管及容器等均在使用前進(jìn)行高壓滅菌，避免污染。所有試劑、樣品加樣前均進(jìn)行離心、吹打混勻后使用，在使用前，保證所有溶液都達(dá)到室溫。在焦磷酸測(cè)序反應(yīng)中，在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，反復(fù)預(yù)試驗(yàn)后，摸索最適宜的擴(kuò)增條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。而PCR未擴(kuò)增出條帶的樣品，重新進(jìn)行PCR，合格后進(jìn)行下一步焦磷酸測(cè)序反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

表1　引物設(shè)計(jì)

2　結(jié)果

2.1均衡性分析高血壓發(fā)病年齡病例組與對(duì)照組在不同年齡組、性別、民族在的分布上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，病例組與對(duì)照組組間均衡可比,見(jiàn)表2。

表2　均衡性分析/例

2.2亞硫酸氫鈉修飾電泳結(jié)果隨機(jī)抽取8個(gè)樣，取PM134-1和PM134-2 PCR產(chǎn)物各5 μL ，分別進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 電泳20 min后觀察。見(jiàn)圖1和圖2。

2.3焦磷酸測(cè)序方法(Pyrophosphate sequencing method，PM)-測(cè)序樣品結(jié)果圖3中的4個(gè)峰高從左至右分別代表CpG1、CpG2、CpG3、CpG4，其甲基化程度分別為61%、62%、34%、19%；圖4中的5個(gè)峰高從左至右分別代表CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9，其甲基化程度分別為4%、2%、11%、3%、9%。

2.4NET基因DNA甲基化位點(diǎn)分析各組CpG1和CpG7差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高血壓-高職業(yè)緊張組、對(duì)照組-高職業(yè)緊張組甲基化水平明顯高于高血壓-低職業(yè)緊張組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但不同組間其余CpG位點(diǎn)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

高血壓組低職業(yè)緊張組高職業(yè)緊張組對(duì)照組低職業(yè)緊張組高職業(yè)緊張組F/HPCpG148.07±14.6555.24±8.23a50.20±5.1756.18±5.86b3.2970.031CpG253.73±13.4458.05±8.2355.08±8.2262.55±5.971.7370.177CpG335.28±18.5432.36±9.6732.22±4.2732.69±3.580.1770.911CpG418.72±4.5718.98±7.9419.42±2.2819.05±2.820.0340.991CpG56.01±4.078.83±3.516.84±1.988.36±2.331.8080.165CpG65.54±2.105.94±3.575.43±1.856.46±1.630.3740.772CpG711.51±2.5615.99±5.36a12.69±0.9213.00±1.75a3.7120.021CpG82.69±1.423.46±1.043.10±0.843.48±0.801.2450.308CpG99.49±3.0611.93±4.809.81±1.559.9±2.131.2650.301

注：與高血壓-低職業(yè)緊張組相比，aP<0.05。

3　討論

目前，高血壓是最常見(jiàn)的心血管疾病，高血壓為血流動(dòng)力學(xué)異常疾病，是一種與脂肪、糖代謝紊亂共存的代謝病，全世界高血壓患病率為22%～27%，其發(fā)展易導(dǎo)致心、腦、腎等臟器的損失[14-15]。高血壓是造成社會(huì)人群發(fā)病率和死亡率上升的主要因素，同時(shí)還可誘發(fā)冠心病和腦卒中等疾病的發(fā)生，因此已成為一項(xiàng)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[16]。預(yù)計(jì)到2025年其流行會(huì)增加到60%，將有15.6億人口可能會(huì)患有高血壓[17]。過(guò)去傳統(tǒng)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血壓和許多因素都有關(guān)聯(lián)，如肥胖、年齡、性別、婚姻狀況、婚姻生活的質(zhì)量、吸煙和被動(dòng)吸煙、工作場(chǎng)所的噪聲、工作負(fù)荷、飲食和體育鍛煉、輪班工作及緊張都可引起血壓的升高[18-21]。

為了更深入了解基因?qū)Ω哐獕旱挠绊懀嗟膶W(xué)者開(kāi)始利用表觀遺傳學(xué)的研究方法進(jìn)行深入的研究。表觀遺傳現(xiàn)象與遺傳DNA序列不同，其可與環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)因素的相互作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)[22]，這使人們?cè)谘芯繌?fù)雜多因素疾病(如心血管疾病)的預(yù)防治療方法時(shí)面臨著更大的挑戰(zhàn)。目前雖無(wú)學(xué)者對(duì)職業(yè)緊張和高血壓表觀遺傳學(xué)變化進(jìn)行直接研究，但Bayles等[23]研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在高血壓與驚恐障礙中發(fā)揮著相似作用，而驚恐障礙與職業(yè)緊張存在相似性。因此，本研究擬通過(guò)表觀遺傳學(xué)相關(guān)理論，假設(shè)NET基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化可能也在職業(yè)緊張與高血壓相關(guān)性中發(fā)揮調(diào)控作用，然后通過(guò)比較不同緊張程度和血壓水平狀態(tài)下NET基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的差異，從而探討表觀遺傳學(xué)在職業(yè)緊張與高血壓相關(guān)性中的所起的作用。

Bayles等[23]以體位性心動(dòng)過(guò)速綜合征患者為試驗(yàn)組，以正常人作為對(duì)照組，同樣對(duì)兩組人群外周血淋巴細(xì)胞中NET基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化、組蛋白甲基化和乙?；竭M(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，隨著NET表達(dá)水平的下降，試驗(yàn)組患者組蛋白H3的賴(lài)氨酸-9、賴(lài)氨酸-27等三甲基化基因抑制標(biāo)志及MeCP2在NET基因啟動(dòng)子區(qū)明顯富集，而賴(lài)氨酸-9/14乙酰化和賴(lài)氨酸-4三甲基化等基因激活標(biāo)志則明顯降低。但對(duì)兩組NET基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平進(jìn)行比較，差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，該研究表明組蛋白的修飾作用可能是調(diào)控NET基因表達(dá)的主要表觀調(diào)控機(jī)制。NET基因的啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)潛在的順式作用元件，如TATA盒，Sp1結(jié)合位點(diǎn)(GC盒)、E盒等[24]，可能發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或維持正常剪接的作用。該區(qū)富含CpG二核苷酸，使其容易受到甲基化所致的基因沉默的影響。故NET基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化是否與高血壓的發(fā)生有關(guān)。因此，本研究采用焦磷酸鹽測(cè)序法分析了不同職業(yè)緊張程度及血壓水平的組合下，外周血白細(xì)胞中NET基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化在各組間的差異，結(jié)果顯示：各組CpG1和CpG7差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，對(duì)照組-高職業(yè)緊張組、高血壓-高職業(yè)緊張組甲基化水平高于高血壓-低職業(yè)緊張組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其他不同組合組間的CpG位點(diǎn)的甲基化程度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示NET基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化可能在職業(yè)緊張性高血壓中發(fā)揮著某種作用。但由于本次試驗(yàn)的樣本量太少，且9個(gè)CpG位點(diǎn)中只有2個(gè)在不同組間的甲基化程度是有差異的，而其他位點(diǎn)均未顯示甲基化異常，因此后續(xù)需要進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

已有的研究表明，人類(lèi)基因組有0.16%左右的SNP位點(diǎn)與其甲基化變化有關(guān)[25]，而這種因DNA序列發(fā)生改變所致的甲基化改變，可以通過(guò)遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)。越來(lái)越多的研究也表明，有些DNA等位基因或其單體型可能與某些特定的表觀遺傳學(xué)變化有關(guān)。因此，在研究疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行多方面的考慮，并可以從表觀遺傳學(xué)角度入手，通過(guò)基因甲基化、蛋白組學(xué)等對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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(本文編輯張巧蓮)

The regulation of the methylation of DNA on the promoter of NET gene in occupational stress and hypertension

LI Rong1, GAO Xiaoyan1, LIU Bo1, XIONG Fei2, LIU Jiwen1

(1CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity;2TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo explore the regulation of epigenetics in occupational stress and hypertension by comparing the methylation of DNA on the promoter of NET gene under different levels of tense and blood pressure. MethodsDNA was processed by bisulfite-treated genomic clone sequencing andfollowed by PCR with designed BSP primers, then PCR products were sequenced to determine whether CpG sites were methylated. ResultsThe DNA methylation of CpG1 and CpG7 between groups were analysed,and the differences were statistically significant (P<0.05). After LSD pairwise comparison, the control group-group of high occupational stress, hypertension-high occupational stress group methylation level was higher than the hypertension-low occupational stress group, and the difference was statistically significant (P<0.05). The DNA methylation on the other CpG sites were not statistically significant. ConclusionCompared the hypertension group and the control group with occupational stress, there was significant difference in the DNA methylation of GpG1 and GpG7 sites which located in the promoter region of NET gene, suggesting that epigenetic play a regulatory role in the correlation between occupational stress and hypertension.

occupational stress; hypertension; methylation

新疆醫(yī)科大學(xué)2013年科研創(chuàng)新基金(XJC201325)

李榕(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：職業(yè)緊張與健康。

劉繼文，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：liujiwendr@163.com。

R135

A

1009-5551(2016)09-1187-06

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.028

2016-04-28]