野生小豆和栽培小豆microRNA全基因組鑒定與比較分析

馬燕明陳春海楊 凱李奕松趙 波李 江李永強萬 平，*

1北京農(nóng)學(xué)院 / 北京農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室， 北京102206；2深圳華大基因科技有限公司， 廣東深圳518083

野生小豆和栽培小豆microRNA全基因組鑒定與比較分析

馬燕明1陳春海2楊 凱1李奕松1趙 波1李 江2李永強1萬 平1，*

1北京農(nóng)學(xué)院 / 北京農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室， 北京102206；2深圳華大基因科技有限公司， 廣東深圳518083

MicroRNA （miRNA）是一種非編碼的小RNA分子， 對真核生物基因表達起著非常重要的調(diào)控作用， miRNA系統(tǒng)鑒定對于研究其功能及作用機制具有重要意義。本研究分別以栽培小豆京農(nóng)6號（JN6）和野生小豆CWA108為試驗材料， 進行了深度miRNA測序。系統(tǒng)鑒定和注釋這2個物種的miRNA， 并分析了其miRNA種類的異同、表達量的差異和靶基因在功能富集上的差別。鑒定出了JN6和CWA108共有和特有的miRNA， 明確了它們之間差異表達的miRNA， 以及這些特有和差異miRNA的靶基因在功能富集上的差異， 發(fā)現(xiàn)可能和抗病與抗逆途徑相關(guān)。

miRNA； 栽培小豆（Vigna angularis）； 野生小豆（Vigna angularis var. nipponensis）

MicroRNA （miRNA）是一類長度為20～25 nt的內(nèi)源單鏈非編碼調(diào)控小分子RNA。1993年， miRNA首次在秀麗線蟲（Caenorhadits elegans）中被克隆，發(fā)現(xiàn)其在胚胎后期發(fā)育中起到重要的階段性調(diào)控作用［1］。隨后研究表明， 幾乎所有真核生物中都存在miRNA， 可以通過與靶mRNA互補配對而在轉(zhuǎn)錄水平上對基因的表達進行負調(diào)控， 導(dǎo)致 mRNA的翻譯抑制或降解［2-3］。因此， miRNA在真核生物的基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。迄今研究結(jié)果表明， miRNAs可以影響生物體的各個方面，其功能可以分為以下幾個方面： （1）調(diào)節(jié)生物的生長發(fā)育， 如細胞生長、器官的形成與分化、新陳代謝、育性轉(zhuǎn)換以及激素的信號傳導(dǎo)等； （2）參與脅迫反應(yīng)，包括生物脅迫和非生物脅迫， 如養(yǎng)分脅迫、低溫脅迫、干旱脅迫、病蟲害害脅迫和輻射脅迫等； （3）調(diào)節(jié)小 RNAs的合成， miRNA不僅可以調(diào)節(jié)其他小RNA （如 siRNAs）的合成， 同時也反饋調(diào)節(jié)自身合成； （4）沉默基因組中的重復(fù)序列， 如轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子等［4-5］。

鑒于miRNA在生物體中的重要作用， 其鑒定和功能分析得到了越來越多的重視。研究結(jié)果表明，一方面， 不同物種中存在一定量的保守 miRNA， 目前在不同的動物之間發(fā)現(xiàn)一些保守的miRNA， 在不同的植物之間也發(fā)現(xiàn)一些保守的miRNA， 然而在動物和植物之間保守的miRNA非常少； 另一方面， 在保守miRNA存在的同時， 也存在大量的物種特異性miRNA［6-7］。例如， 在擬南芥的約100個miRNA基因家族中， 只有 21個是和水稻共有的［8］。甚至即使是親緣關(guān)系非常近的擬南芥的2個種（A. thaliana和A. lyrata）之間， 也存在較多的物種特異 miRNA［9］。一般而言， 大多數(shù)古老的miRNA在物種間是高度保守的， 這暗示了其功能的重要性； 而年輕的 miRNA通常是弱表達， 加工不嚴密， 分化程度較高， 趨向于缺少靶標， 但是它們可能對物種特有新功能的產(chǎn)生具有重要意義［10-11］。這些結(jié)果一方面暗示miRNA的進化速率是非常快的， 另一方面也提示不同物種特異 miRNA的鑒定對于該物種功能基因組的研究具有重要意義［12］。

小豆（Vigna angularis）起源于中國， 早在 1.2萬年前已被馴化， 俗名紅小豆、赤豆等， 是中國傳統(tǒng)小雜糧［13］。不同于大豆等其他豆科作物， 小豆脂肪含量非常低， 平均僅為0.59%， 而總淀粉含量較高， 平均為57.06%。另外， 其所含人體必需的8種氨基酸是禾谷類作物的2～3倍， 并富含維生素B、鐵、鈣等礦物質(zhì)和萜類、異黃酮、皂苷等生物活性物質(zhì)［14-15］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， 小豆具有降血糖、降血脂、減肥、抗癌等作用［16-17］。因此， 小豆是重要的高蛋白、低脂肪、補血的經(jīng)濟糧食作物。迄今， 小豆的功能基因組研究非常薄弱， 主要原因之一是長期以來缺乏完整的參考基因組。最近， 對京農(nóng) 6號的全基因組測序， 完成了小豆高質(zhì)量基因組框架圖的組裝，結(jié)果顯示小豆有 3.4萬多個基因， 進一步研究表明小豆和大豆在淀粉和油含量上的差異主要來源于淀粉和油脂合成代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平差異， 而非基因拷貝數(shù)的差異。通過對49份野生小豆、半野生小豆、栽培小豆的重測序， 證實半野生小豆與栽培小豆的關(guān)系近于野生小豆， 說明半野生小豆可能是小豆馴化過程中的初始農(nóng)家品種［18］。

在此基礎(chǔ)上， 本文對參考基因組的測序品種京農(nóng)6號和另外一個野生小豆CWA108進行了小RNA測序， 并對栽培小豆和野生小豆之間的miRNA進行了系統(tǒng)鑒定和比較， 除了共有的miRNA外， 還找到一些特有 miRNA， 并分析了它們之間靶基因的異同。這些結(jié)果為小豆功能基因組的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

北京農(nóng)學(xué)院育成的京農(nóng)6號（JN6）和來自中國的野生小豆CWA108， 2013年夏于北京農(nóng)學(xué)院試驗農(nóng)場種植。在生長季取莖、葉、花、幼莢、幼嫩籽粒等組織， 每份材料至少取自 5棵植株， 混合后迅速放入液氮中冷凍， 貯存于-80度冰箱備用。

1.2RNA的提取

將液氮冷凍的樣品置研缽中快速磨碎， 粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的2 mL離心管； 加入1 mL TRIzol試劑，振蕩混勻； 4℃條件下12 000 × g離心10 min； 取上清液移入新離心管， 加入 200 μL氯仿， 輕搖混勻；4℃條件下12 000 × g離心10 min； 取上清液移入新離心管， 加入 250 μL異丙醇和 1.2 mol L-2氯化鈉250 μL， 室溫放置3 min； 4℃條件下12 000 × g離心10 min， 去除上清液； 沉淀經(jīng) 75%乙醇洗滌兩次，4℃條件下7500 × g離心2 min， 去除上清液； 將沉淀于室溫干燥 5～10 min， 加入適量（50 μL左右）DEPC水， 置于冰上充分溶解。向提取的RNA加入DNase I （New England BioLabs）， 于37℃消化30 min，除去殘留的DNA。

1.3miRNA文庫構(gòu)建及測序

委托深圳華大基因有限公司進行小 RNA文庫構(gòu)建及測序。該公司用 Agilent2100進行樣品檢測，在RNA達到其建庫要求后構(gòu)建文庫。構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeq2000測序儀進行測序， 得到49 nt的讀段序列。

1.4miRNA鑒定

對測序得到的原始數(shù)據(jù)， 經(jīng)過一系列的數(shù)據(jù)處理， 去除測序質(zhì)量較低、有 5′接頭污染、沒有 3′接頭序列、沒有插入片段和包含polyA的reads， 去除小于18 nt的小片段。之后， 通過與各類已知的數(shù)據(jù)庫進行比對、尋找樣品與數(shù)據(jù)庫之間在基因組位置上的覆蓋等方法， 對各類小RNA注釋分類， 同時選取沒有被注釋上的小RNA， 使用華大自主開發(fā)的軟件Mireap預(yù)測新的miRNA。

1.5miRNA靶基因的預(yù)測

首先分別用 psRobot［19］和 TargetFinder［6，20］預(yù)測miRNA靶基因， 然后取并集作為預(yù)測結(jié)果［21-22］。

1.6表達差異分析

將栽培和野生小豆中 miRNA的表達量均一化到同一個量級（TPM［23］）。均一化的表達量 = miRNA表達量/樣品總表達量×均一量級。使用標準化后的結(jié)果統(tǒng)計 fold_change和 P-value［24］及繪圖。Fold_ change公式為： Fold_change = log2（野生/栽培）

1.7miRNA靶基因KEGG代謝通路分析

在生物體內(nèi)， 不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能， 基于 pathway的分析有助于更進一步了解基因的生物學(xué)功能。KEGG是有關(guān)通路的主要公共數(shù)據(jù)庫， 通路顯著性富集分析以KEGG中的通路為單位， 應(yīng)用超幾何檢驗， 找出與整個參考基因相比較在候選靶基因中顯著性富集的通路， 參照已報道的研究方法［25］。FDR≤0.05的通路被認為在候選靶基因中顯著富集。通過通路顯著性富集分析能確定候選靶基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2　結(jié)果與分析

2.1小RNA測序數(shù)據(jù)的概括分析

為了系統(tǒng)鑒定小豆的miRNA， 并對野生和栽培種中miRNA進行比較， 選取了小豆栽培品種京農(nóng)6號（JN6）和野生小豆CWA108作為研究材料， 在生長期采取莖、葉、花、幼莢、籽粒等不同組織樣品， 提取RNA， 等量RNA混樣， 測序小RNA （sRNA）。測序結(jié)果表明， 栽培品種京農(nóng) 6號獲得 22.4百萬（million， M） sRNA讀段， 去掉冗余后， 單一特異sRNA讀段為7.0 M； 在野生小豆CWA108獲得24.3 M sRNA讀段， 去掉冗余后， 單一特異sRNA讀段為6.3 M （表1）。在總的sRNA讀段中， 野生和栽培小豆共有的占了兩者之和的63.51%， JN6和CWA108特異sRNA在中分別占據(jù)了15.13%和21.35%。而在單一特異的讀段總和中， 野生和栽培小豆共有的占了兩者之和的15.02%， JN6和CWA108特異sRNA在中分別占據(jù)了45.41%和39.57% （圖1）。

進而 sRNA與基因組序列進行比對， 發(fā)現(xiàn)這些sRNA分別比對到了基因組上外顯子的正義鏈、外顯子的反義鏈、內(nèi)含子正義鏈、內(nèi)含子反義鏈、核糖體RNA、小核RNA、小核仁RNA、轉(zhuǎn)運RNA、重復(fù)序列和一些未知的RNA區(qū)域（表1）?？梢钥闯?， 雖然在特異的sRNA中， JN6和CWA108的miRNA分別為 0.93%和 0.90%， 非常接近； 然而， 在總的sRNA中， JN6和CWA108的miRNA分別為17.42% 和 9.57%（表 1）， 暗示野生種和栽培品種小豆的miRNA在表達量上存在一定的差異。

圖1　野生和栽培小豆小RNA測序數(shù)據(jù)Fig. 1 miRNA data of wild and cultivated adzuki beanA： 總sRNA讀段分析； B： 單一特異sRNA讀段分析； C： 栽培和野生小豆中已知miRNA比較； D： 栽培和野生小豆中未知miRNA比較。A： reads analysis of total miRNA； B： reads analysis of single specific miRNA； C： comparison of conserved miRNA between cultivated and wild adzuki beans； D： comparison of new miRNA between cultivated and wild adzuki beans.

2.2miRNA基因鑒定

利用華大基因自主開發(fā)軟件 Mireap對 miRNA進行了預(yù)測， 在栽培小豆JN6中發(fā)現(xiàn)547個miRNA，其中341個為已知miRNA， 206個為新的miRNA； 在野生小豆CWA108中發(fā)現(xiàn)555個miRNA， 其中343個為已知miRNA， 212個為新的miRNA。在已知的miRNA中， 有238個是兩者共有的， 有103個為JN6特有， 105個為CWA108特有（圖1-C）。在新的miRNA中， 有 84個是兩者共有的， 有 122個為 JN6特有，128個為 CWA108特有（圖 1-D）。進一步對新鑒定miRNA的第一位堿基序列頻率進行分析， 發(fā)現(xiàn)21 nt 和23 nt的miRNA在野生和栽培小豆中沒有明顯區(qū)別。而20nt的miRNA兩者有明顯區(qū)別， 在JN6中以G為主（圖1-A）， 而在CWA108中以C為主（圖1-B）； 22nt的miRNA中， JN6以G的比例明顯高于CWA108， 而C的比例明顯低于CWA108 （圖2）。

2.3野生和栽培小豆中miRNA靶基因預(yù)測

miRNA的作用一般是通過調(diào)控其靶基因?qū)崿F(xiàn)的， 為了深入地了解小豆中miRNA的功能， 分別對JN6和CWA108的miRNA的靶基因進行了預(yù)測。在JN6的已知miRNA中， 預(yù)測到294個miRNA具有靶基因， 其靶基因數(shù)目總和為 3913個， 其中paRobot預(yù)測到1509個， TargetFinder預(yù)測到3263個，兩者共同預(yù)測到的靶基因有859個（圖3-A）； 在未知miRNA中， 預(yù)測到188個miRNA具有靶基因， 靶基因數(shù)目總和為 2080個， 其中 paRobot預(yù)測到 1079個， Target Finder預(yù)測到1570個， 兩者共同預(yù)測到的靶基因有669個（圖3-B）。在野生小豆CWA108的miRNA的靶基因預(yù)測中， 發(fā)現(xiàn) 303個已知 miRNA具有靶基因， 其靶基因數(shù)目總和為 4177個， 其中paRobot預(yù)測到1580個， TargetFinder預(yù)測到3500個，兩者共同預(yù)測到的靶基因有903個（圖3-C）； 在未知miRNA中， 預(yù)測到198個miRNA具有靶基因， 其靶基因數(shù)目總和為2267個， 其中paRobot預(yù)測到1130個， TargetFinder預(yù)測到1818個， 兩者共同預(yù)測到的靶基因有681個（圖3-D）。野生小豆miRNA靶基因數(shù)高于栽培小豆。

表1　栽培小豆和野生小豆小RNA測序結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Overview of small RNA-seq data from cultivated and wild adzuki bean

圖2　栽培和野生小豆新miRNA首位序列比較Fig. 2 Comparison on first sequence of new miRNAs between cultivated and wild adzuki beansA： 栽培小豆新miRNA首位序列頻率分布； B： 野生小豆新miRNA首位序列頻率分布。A： frequency distribution of first sequence of new miRNAs in cultivated adzuki bean； B： frequency distribution of first sequence of new miRNAs in wild adzuki bean.

接下來， 比較了JN6和CWA108中特有miRNA（圖1-C和1-D） 的靶基因的功能。發(fā)現(xiàn)JN6特有的103個已知 miRNA的靶基因多富集于 RNA轉(zhuǎn)運（RNA-transport）通路（圖 4-A）； 而 CWA108特有的105個已知miRNA的靶基因多富集于與抗病抗逆相關(guān)的植物-病原菌互作（Plant-pathogen interaction）通路（圖4-B）。對于新的miRNA， JN6特有的122個已知 miRNA的靶基因多富集于代謝途徑（Metabolic Pathway）等通路（圖4-C）， 而CWA108特有的128個已知 miRNA的靶基因同樣多富集于抗病相關(guān)的Plant-pathogen interaction等通路（圖4-D）。

圖3　栽培和野生小豆小RNA靶基因預(yù)測Fig. 3 Prediction of miRNA targets in cultivated and wild adzuki beansA： JN6已知miRNA靶基因預(yù)測； B： JN6新miRNA靶基因預(yù)測；C： CW108已知miRNA靶基因預(yù)測； D： CW108新miRNA靶基因預(yù)測。A： prediction of conserved miRNA targets in cultivar Jingnong 6；B： prediction of new miRNA targets in cultivar Jingnong 6； C： prediction of conserved miRNA targets in wild adzuki bean CWA108；D： prediction of new miRNA targets in wild adzuki bean CWA108.

圖4　栽培和野生小豆特有miRNA靶基因的功能富集分析Fig. 4 KEGG enrichment analysis of specific miRNAs in cultivated and wild adzuki beansA： 栽培小豆JN6已知miRNA靶基因KEGG功能富集分析； B： 野生小豆CWA108已知miRNA靶基因KEGG功能富集分析；C： 栽培小豆JN6新的miRNA靶基因KEGG功能富集分析； D： 野生小豆CWA108新的miRNA靶基因KEGG功能富集分析。A： KEGG enrichment analysis of conserved miRNA targets in cultivar Jingnong 6； B： KEGG enrichment analysis of conserved miRNA targets in wild adzuki bean CWA108； C： KEGG enrichment analysis of new miRNA targets in cultivar Jingnong 6； D： KEGG enrichment analysis of new miRNA targets in wild adzuki bean CWA108.

2.4野生和栽培小豆中差異表達的已知 miRNA分析

為了進一步揭示野生和栽培小豆中 miRNA可能的功能差異， 對它們共有miRNA在表達上的差異進行了分析， 找出了差異表達的 miRNA。JN6和CWA108相比， 在已知的miRNA中， 有69個顯著上調(diào)， 25個顯著下調(diào)（圖5）。

進一步對這些表達差異 miRNA的靶基因分析發(fā)現(xiàn)69個顯著上調(diào)的已知miRNA的靶基因多富集于植物-病原菌互作（plant-pathogen interaction）和嘧啶代謝（pyrimidine metabolism）等通路（圖 6-A）， 而25個顯著下調(diào)的已知 miRNA的靶基因多富集于植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）等通路（圖6-B）。

2.5野生和栽培小豆中差異表達的新miRNA分析

對野生和栽培小豆中共有的新 miRNA在表達上的差異分析發(fā)現(xiàn) JN6和 CWA108相比， 在新的miRNA中， 有29個顯著上調(diào)， 21個顯著下調(diào)（圖7）。

圖5　栽培和野生小豆已知miRNAs差異表達分析Fig. 5 Differential expression analysis of conserved miRNAs in cultivated and wild adzuki beans

圖6　栽培小豆已知miRNAs靶基因KEGG功能富集分析Fig. 6 KEGG enrichment analysis of conserved miRNAs analysis of conserved miRNAs in cultivated and wild adzuki beansA： 栽培小豆上調(diào)已知miRNAs靶基因KEGG功能富集分析； B： 栽培小豆下調(diào)已知miRNA靶基因KEGG功能富集分析。A： KEGG enrichment analysis of conserved miRNAs up-regulated targets in cultivated adzuki beans； B： KEGG enrichment analysis of conserved miRNAs down-regulated targets in cultivated adzuki beans.

圖7　栽培和野生小豆新miRNAs差異表達分析Fig. 7 Differential expression analysis of new miRNAs in cultivated and wild adzuki beans

對這些表達差異新 miRNA的靶基因分析發(fā)現(xiàn)29個顯著上調(diào)的新miRNA的靶基因多富集于RNA運輸（RNA transport）和抗病相關(guān)Plant-pathogen interaction）等通路（圖8-A）； 而21個顯著下調(diào)的新miRNA的靶基因也多富集于RNA transport， Plant-pathogen interaction等通路（圖 8-B）。有意思的是它們不屬于相同miRNA調(diào)控。

圖8　栽培小豆新miRNAs靶基因KEGG功能富集分析Fig. 8 KEGG enrichment analysis of new miRNAs in cultivated adzuki beansA： 栽培小豆上調(diào)新miRNAs靶基因KEGG功能富集分析； B： 栽培小豆下調(diào)新miRNA靶基因KEGG功能富集分析。A： KEGG enrichment analysis of new miRNAs up-regulated targets in cultivated adzuki beans； B： KEGG enrichment analysis of new miRNAs down-regulated targets in cultivated adzuki beans.

3　討論

miRNA對于基因功能的調(diào)控具有重要作用， 其種類和數(shù)量的系統(tǒng)鑒定是功能分析的基礎(chǔ)。迄今仍未見小豆miRNA的分析報道， 本研究利用小RNA測序技術(shù)， 系統(tǒng)鑒定了栽培小豆和野生小豆中miRNA的種類、數(shù)量和表達量， 發(fā)現(xiàn)兩物種存在一定量的保守miRNA， 同時新的特異性miRNA存在很大的比例； 其他物種的研究結(jié)果表明各物種除了保守 miRNA， 也有自身特異的 miRNA［6-9］， 進一步說明miRNA的進化速率是非常快的［12，26］。

很多物種在馴化過程中， 野生種和栽培種會發(fā)生很多基因組的演化， 其中重要的一個現(xiàn)象是從野生種到栽培種會伴隨大量抗病基因的丟失和一些其他基因的獲得［27-28］。通過栽培和野生小豆特異miRNA 靶基因的比較發(fā)現(xiàn)， 野生小豆特有的miRNA的靶基因多富集于與抗病、抗逆相關(guān)的通路，可見野生小豆中保有大量抗病和抗逆基因， 在小豆從野生種到栽培種的演化進程中， 由于人工選擇使得許多抗病和抗逆相關(guān)基因丟失， 與之相關(guān)的miRNA同樣也會在馴化中丟失。但人為選擇和品種改良也可以導(dǎo)致一些新基因產(chǎn)生， 本研究發(fā)現(xiàn)栽培小豆京農(nóng)6號可能演化出一些新的miRNA， 其更多地參與調(diào)控有關(guān)RNA-transport通路。不僅如此， 研究還發(fā)現(xiàn)即使是野生小豆和栽培小豆共有的miRNA， 也會通過上調(diào)和下調(diào)基因的表達來完成功能的演化。在野生和栽培小豆共有miRNA差異表達的分析中， 發(fā)現(xiàn)了一些上調(diào)和下調(diào)基因， 有意思的是它們的靶基因功能都富集于 Plant-pathogen interaction通路， 說明這些共有miRNA通過上調(diào)和下調(diào)的演化模式， 實現(xiàn)對抗病基因的不同調(diào)控， 增加栽培小豆和野生小豆對環(huán)境的適應(yīng)性。本研究為野生小豆的抗病、抗逆基因發(fā)掘、相關(guān)等位基因及其功能鑒定和育種應(yīng)用， 小豆功能基因組學(xué)研究， 奠定了重要基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

鑒定出了野生小豆343個已知miRNA， 栽培小豆340個已知miRNA， 其中包括238個共有的已知miRNA； 野生小豆和栽培小豆特有的 miRNA分別為212個和206個， 共有的特異miRNA有84個。找出了它們之間差異表達的miRNA， 發(fā)現(xiàn)2個物種之間 miRNA無論在種類和表達量上的分化都與抗病和抗逆通路相關(guān)。

致謝： 本文在中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所田志喜研究員悉心指導(dǎo)下完成， 在此表示由衷的感謝。

References

［1］ Lee R C， Feinbaum R L， Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell， 1993， 75： 843-854

［2］ Carrington J C， Ambros V. Role of microRNAs in plant and animal development. Science， 2003， 301： 336-338

［3］ Ambros V， The functions of animal microRNAs. Nature， 2004，431： 350-355

［4］ Jones-Rhoades M W， Bartel D P， Bartel B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annu Rev Plant Biol， 2006， 57： 19-53

［5］ Zhang B， Wang Q， Pan X. MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants. J Cell Physiol， 2007， 210： 279-289

［6］ Fahlgren N， Howell M D， Kasschau K D， Chapman E J， Sullivan C M， Cumbie J S， Givan S A， Law T F， Grant S R， Dangl J L，Carrington J C. High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs： evidence for frequent birth and death of MIRNA genes. PLoS One， 2007， 2（2）： e219

［7］ Abrouk M， Zhang R， Murat F， Li A， Pont C， Mao L， Salse J. Grass microRNA gene paleohistory unveils new insights into gene dosage balance in subgenome partitioning after wholegenome duplication. Plant Cell， 2012， 24： 1776-1792

［8］ Axtell M J， Bowman J L. Evolution of plant microRNAs and their targets. Trends Plant Sci， 2008， 13： 343-349

［9］ Felippes F F， Schneeberger K， DezulianT， Huson D H，Weigel D. Evolution of Arabidopsis thaliana microRNAs from random sequences. RNA， 2008， 14： 2455-2459

［10］ Maher C， Stein L， Ware D. Evolution of Arabidopsis microRNA families through duplication events. Genome Res， 2006， 16：510-519

［11］ Meunier J， Lemoine F， Soumillon M， Liechti A， Weier M，Guschanski K， Hu H， Khaitovich P， Kaessmann H. Birth and expression evolution of mammalian microRNA genes. Genome Res，2013， 23： 34-45

［12］ Zhou Z， Wang Z， Li W， Fang C， Shen Y， Li C， Wu Y， Tian Z. Comprehensive analyses of microRNA gene evolution in paleopolyploid soybean genome. Plant J， 2013， 76： 332-344

［13］ Liu L， Bestel S， Shi J， Song Y， Chen X. Paleolithic human exploitation of plant foods during the last glacial maximum in North China. Proc Natl Acad Sci USA， 2013， 110： 5380-5385

［14］ Amarowicz R， Estrella I， HernandezT， TroszynskaA.Antioxidant activity of extract of adzuki bean and its fractions. J Food Lipids，2008， 15： 119-136

［15］ Kitano-Okada T， Kitano-Okada T， Ito A， Ai K， Nakamura Y， Han K H. Anti-obesity role of adzuki bean extract containing polyphenols： in vivo and in vitro effects. J Sci Food Agric， 2012， 92：2644-2651

［16］ Itoh T， Furuich Y. Lowering serum cholesterol level by feeding a 40% ethanol-eluted fraction from HP-20 resin treated with hot water extract of adzuki beans （Vigna angularis） to rats fed a high-fat cholesterol diet. Nutrition， 2009， 25： 318-321

［17］ Sato S， Yamate J， Hori Y， Hatai A， Nozawa M， Sagai M. Protective effect of polyphenol-containing azuki bean （Vigna angularis）seed coats on the renal cortex in streptozotocin-induced diabetic rats. J Nutr Biochem， 2005， 16： 547-553

［18］ Yang K， Tian Z， Chen C， Luo L， Zhao B， Wang Z， Yu L， Li Y，Sun Y， Li W， Chen Y， Li Y， Zhang Y， Ai D， Zhao J， Shang C， Ma Y， Wu B， Wang M， Gao L， Sun D， Zhang P， Guo F， Wang W， Li Y，Wang J， Varshney R K， Wang J， Ling H Q， Wan P. Genome sequencing of adzuki bean （Vigna angularis） provides insight into high starch and low fat accumulation and domestication. Proc Natl Acad Sci USA， 2015， 112： 13213-13218

［19］ Wu H J， Ma Y K， Chen T， Wang M， Wang X J. PsRobot： a web-based plant small RNA meta-analysis toolbox. Nucl Acids Res， 2012， 40： W22-28

［20］ Allen E， Xie Z， Gustafson A M， Carrington J C. micro-RNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell， 2005， 121： 207-221

［21］ Lopez J P， Fiori L M， Gross J A， Labonte B， Yerko V， Mechawar N， Turecki G.Regulatory role of miRNAs in polyamine gene expression in the prefrontal cortex of depressed suicide completers. Int J Neuropsychopharmacol， 2014， 17： 23-32

［22］ Wang X， El Naqa I M. Prediction of both conserved and nonconserved microRNA targets in animals. Bioinformatics， 2008， 24：325-332

［23］ Zhou L， Chen J， Li Z， Li X， Hu X， Huang Y， Zhao X， Liang C，Wang Y， Sun L， Shi M， Xu X， Shen F， Chen M， Han Z， Peng Z，Zhai Q， Chen J， Zhang Z， Yang R， Ye J， Guan Z， Yang H， Gui Y，Wang J， Cai Z， Zhang X. Integrated profiling of microRNAs and mRNAs： microRNAs located on Xq27.3 associate with clear cell renal cell carcinoma. PLoS One， 2010， 5： e15224

［24］ Audic S， Claverie J M. The significance of digital gene expres-sion profiles. Genome Res， 1997， 7： 986-995

［25］ Kanehisa M， Araki M， Goto S， Hattori M， Hirakawa M， Itoh M，Katayama T， Kawashima S， TokimatsuT， YamanishiY. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucl Acids Res，2008， 36： D480-484

［26］ Lu J， Shen Y， Wu Q， Kumar S， He B， Shi S， Carthew R W， Wang S M， Wu C I. The birth and death of microRNA genes in Drosophila. Nat Genet， 2008， 40： 351-355

［27］ Zhou Z， Jiang Y， Wang Z， Gou Z， Lyu J， Li W， Yu Y， Shu L， Zhao Y， Ma Y， Fang C， Shen Y， Liu T， Li C， Li Q， Wu M， Wang M， Wu Y， Dong Y， Wan W， Wang X， Ding Z， Gao Y， Xiang H， Zhu B， Lee S H， Wang W， Tian Z. Resequencing 302 wild and cultivated accessions identifies genes related to domestication and improvement in soybean. Nat Biotechnol， 2015， 33： 408-414

［28］ Li Y H， Zhou G， Ma J， Jiang W， Jin L G， Zhang Z， Guo Y， Zhang J，Sui Y， Zheng L， Zhang S S， Zuo Q， Shi X H， Li Y F， Zhang W K，Hu Y， Kong G， Hong H L， Tan B， Song J， Liu Z X， Wang Y， Ruan H， Yeung C K， Liu J， Wang H， Zhang L J， Guan R X， Wang K J，Li W B， Chen S Y， Chang R Z， Jiang Z， Jackson S A， Li R， Qiu L J. De novo assembly of soybean wild relatives for pan-genome analysis of diversity and agronomic traits. Nat Biotechnol， 2014，32： 1045-1052

Global Identification and Comparison of MicroRNA in Wild and Cultivated Adzuki Bean

MA Yan-Ming1， CHEN Chun-Hai2， YANG Kai1， LI Yi-Song1， ZHAO Bo1， LI Jiang2， LI Yong-Qiang1， and WAN Ping1，*

1Beijing University of Agriculture / Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application， Beijing 102206， China；2BGI-Shenzhen，Shenzhen 518083， China

MicroRNAs （miRNAs） are a class of small regulatory RNAs with the function as crucial regulators that repress the expression of their target genes at the transcriptional or post-transcriptional level. Global identification of miRNA is important for the functional study. Adzuki bean （Vigna angularis） genome sequencing has been finished recently， but lack of a systematical analysis of miRNA. In this study， we performed deep miRNA sequencing in wild （CW108） and cultivated （JN6） adzuki beans. Our investigation not only identified the miRNAs that shared by these two species， but also found miRNAs that specifically existed in individual accession. Through comparison of the miRNA expression and their target gene predictions between the wild and cultivated adzuki beans， we found that the miRNA was diverged between them， which may be associated with plant-pathogen interaction pathway. Our study provided a valuable resource for functional analysis in adzuki bean.

miRNA； Wild adzuki bean （Vigna angularis）； Cultivated adzuki bean （Vigna angularis var. nipponensis）

10.3724/SP.J.1006.2016.01273

本研究由國家自然科學(xué)基金項目（31371694）資助。

This study was supported by National Natural Science Foundation of China （31371694）

（Corresponding author）： 萬平， E-mail： pingwan3@163.com， Tel： 010-80799134

聯(lián)系方式： E-mail： 574088090@qq.com

Received（）： 2016-01-27； Accepted（接受日期）： 2016-05-04； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-05-09. URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160509.0955.004.html