茶樹咖啡堿合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建

唐雨薇，劉麗萍，王若嫻，陳宇宏，劉仲華，2，3，劉碩謙，2，3*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.教育部茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128

茶樹咖啡堿合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建

唐雨薇1，3，劉麗萍1，3，王若嫻1，陳宇宏1，劉仲華1，2，3，劉碩謙1，2，3*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.教育部茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128

CRISPR/Cas9技術(shù)是一門新興的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)點(diǎn)，可輕松實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的敲除、替換和定點(diǎn)突變等操作。該技術(shù)剛誕生，就受到了全球生命科學(xué)領(lǐng)域研究者的關(guān)注，不到 3年的時(shí)間就已經(jīng)成功應(yīng)用于多種動(dòng)、植物當(dāng)中。然而 CRISPR/Cas9技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用面臨載體構(gòu)建問題，本文以茶樹咖啡堿合成酶為例，聯(lián)合采用常規(guī)PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技術(shù)，構(gòu)建了包含茶樹咖啡堿合成酶雙靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9基因編輯載體，為CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

茶樹；基因組編輯技術(shù)；咖啡堿合成酶；CRISPR/Cas9技術(shù)

雖然我國(guó)一直非常重視茶樹的品種改良工作，但由于茶樹具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、自交不親和的特性，使得采用常規(guī)育種技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)茶樹育種工作取得突破性進(jìn)展。近年來(lái)分子育種及基因工程等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在水稻、西紅柿、馬鈴薯等農(nóng)作物品種改良中發(fā)揮了重要作用，也為茶樹育種提供了新的途徑。因而，茶樹分子生物學(xué)研究成了茶葉科學(xué)中最活躍和進(jìn)展最快的領(lǐng)域。最近，茶樹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作取得了重要進(jìn)展［1-4］。目前，GenBank已收錄了約35萬(wàn)條茶樹mRNA序列（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term=Camellia+ sinensis），幾乎涵蓋了茶樹中所有功能基因編碼序列。此外，我國(guó)茶樹的全基因組測(cè)序工作也于幾年前在多家單位開始啟動(dòng)，并已相繼完成，茶樹全基因組序列將會(huì)在短期內(nèi)釋放［5］。然而，面對(duì)大量的基因序列，我們對(duì)其功能了解卻是非常缺少，制約了基因資源的利用。因此，確定茶樹新基因的功能并高效利用新基因?qū)⑹俏磥?lái)茶樹分子生物學(xué)研究中一個(gè)非常重要的主題，也就是說(shuō)茶樹后基因組時(shí)代即將來(lái)臨。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的突飛猛進(jìn)，新型基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9）將會(huì)在茶樹功能基因研究中發(fā)揮重要作用，預(yù)計(jì)將成為茶樹后基因組時(shí)代不可或缺的研究工具。

基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)是分子育種、基因的功能研究和遺傳改造等重要工具，是通過(guò)某種途徑對(duì)基因組DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行改造的一種手段。迄今為止，應(yīng)用時(shí)間比較長(zhǎng)的基因組編輯技術(shù)有鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）［6］和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸（Transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN）技術(shù)［7］。但由于這兩項(xiàng)技術(shù)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的改造較為復(fù)雜，對(duì)每一個(gè)基因位點(diǎn)的編輯都需要重新設(shè)計(jì)、合成和組裝2個(gè)核酸酶，載體構(gòu)建困難，成為限制其發(fā)展的瓶頸［8］?？茖W(xué)家一直在尋找精確而簡(jiǎn)單的基因組編輯方法，直到 2013年發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9技術(shù)［9］。CRISPR/Cas9技術(shù)是通過(guò)一段RNA來(lái)識(shí)別靶位點(diǎn)，因而在設(shè)計(jì)和構(gòu)建上更加簡(jiǎn)單，只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性編輯［10］。自 CRISPR/Cas9技術(shù)的誕生到現(xiàn)在，短短幾年內(nèi)該技術(shù)迅速應(yīng)用于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，并成為基因組定點(diǎn)編輯的首選方法［11］。

CRISPR/Cas廣泛存在于古生菌和細(xì)菌的基因組中，屬自身免疫系統(tǒng)，可降解入侵的病毒或質(zhì)粒 DNA［12］。在該免疫系統(tǒng)中，Cas蛋白（CRISP-associated protein）含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割兩條DNA鏈，切割后DNA雙鏈斷裂從而使入侵的外源DNA降解［13］。CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成結(jié)構(gòu)比較固定，由 CRISPR序列與 Cas基因家族組成，其中CRISPR由一系列高度保守的重復(fù)序列（Repeat）與間隔序列（Spacer）相間排列組成，間隔序列可特異識(shí)別外源 DNA［13］。在CRISPR序列附近存在高度保守的CRISPR相關(guān)基因，這些基因編碼的蛋白具有核酸酶功能，可以對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性切割［14］。

CRISPR系統(tǒng)分為3種類型，現(xiàn)在常用的CRISPR/Cas系統(tǒng)由類型Ⅱ系統(tǒng)改造而來(lái)。類型Ⅱ系統(tǒng)的特征性蛋白為Cas9蛋白，具有加工產(chǎn)生 CRISPR RNA（crRNA）和切割雙鏈DNA功能。crRNA（CRISPR-derived RNA）通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合體，此復(fù)合體一旦形成就能引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。而tracrRNA/crRNA復(fù)合體可通過(guò)人工設(shè)計(jì)，融合crRNA與tracrRNA形成sgRNA（single-guided RNA），sgRNA足以引導(dǎo)Cas9 對(duì)DNA的定點(diǎn)切割（圖1）［13，15］。sgRNA可以通過(guò)載體表達(dá)或者化學(xué)合成后與Cas9蛋白共同進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)特異DNA序列剪切，從而促使DNA 發(fā)生NHEJ（nonhomologousend-joining）導(dǎo)致的基因缺失或同源重組，實(shí)現(xiàn)基因敲除［16］。CRISPR-Cas9 體系的RNA-DNA識(shí)別機(jī)制為選擇性基因組編輯提供了一個(gè)簡(jiǎn)便而強(qiáng)大的工具。來(lái)自Streptococcus pyogenes的Cas9由于識(shí)別序列僅為2個(gè)堿基（GG），幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點(diǎn)，因此得到廣泛的應(yīng)用。Cas9蛋白在目前測(cè)試過(guò)的幾乎所有生物和細(xì)胞中均有活性，包括細(xì)菌、酵母、植物、魚，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞［17］。該體系其中一個(gè)最重要的優(yōu)勢(shì)是Cas9蛋白可在多個(gè)不同的sgRNA的引導(dǎo)下同時(shí)修飾多個(gè)基因組靶點(diǎn)。

圖1　CRISPR/Cas9工作原理［15］Fig.1 The working model of the CRISPR/Cas9 system［15］

目前植物CRISPR/Cas9系統(tǒng)已日趨完善，已在十多種植物中成功實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因組編輯，除了在本氏煙草［18-19］、擬南芥［20］等模式植物上獲得了成功，很快在小麥［21］、玉米［22］、水稻［23］、高粱［19］、西紅柿［24］以及甜橙［25］等農(nóng)作物上也成功實(shí)現(xiàn)了 CRISPR/Cas9的應(yīng)用。最近，先后利用 CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了木本植物楊樹［26］和觀賞植物牽?；ǎ?7］基因組的定點(diǎn)編輯，將 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中應(yīng)用推上了新的領(lǐng)域。

然而，到目前為止尚未見有關(guān)CRISPR/Cas9技術(shù)在茶樹上的應(yīng)用報(bào)道，其中一個(gè)重要的原因是針對(duì)茶樹的 CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建技術(shù)尚不完善。本文以茶樹中咖啡堿合成酶為例，建立茶樹CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建方法，為 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒、引物、菌種與試劑

植物 CRISPR/Cas9基因編輯載體為pYLCRISPR/Cas9P35S-H，GenBank登錄號(hào)為AY310901，是在雙元載體質(zhì)粒pCAMBIA1300（AF234296）的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造而來(lái)的，由花椰菜花葉病毒（CaMV）35 S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9p序列的表達(dá)。該質(zhì)粒在E.coli TOP10F′（LacIq）菌株繁殖，該菌株LacIq基因型產(chǎn)生的阻礙蛋白可抑制ccdB大腸桿菌致死基因的表達(dá)。植物CRISPR/sgRNA載體［28］pYLgRNAAtU3d-LacZ和 pYLgRNA-AtU3b，為植物CRISPR/Cas9基因編輯載體的中間載體，分別提供small nuclear（sn）RNA U3d和U3b啟動(dòng)子序列，驅(qū)動(dòng)sgRNA的表達(dá)并保證轉(zhuǎn)錄出的sgRNA停留在細(xì)胞核中與Cas9結(jié)合，且二者均提供長(zhǎng)度為57 nt的sgRNA3′區(qū)域保守結(jié)構(gòu)序列，可與靶基因的 20 nt靶序列組裝成sgRNA。此外，pYLgRNA-AtU3d-LacZ還提供了 LacZ標(biāo)記基因（198 bp）的表達(dá)元件，可在含有X-gal的培養(yǎng)基產(chǎn)生藍(lán)色菌斑篩選陽(yáng)性克隆。以上質(zhì)粒均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

本文所需引物序列如表1所示，引物合成與序列測(cè)序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。發(fā)根農(nóng)桿菌 GV3101和大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR純化試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒菌購(gòu)自全式基因生物有限公司，KOD-Plus酶購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司，BsaI-HF酶和 T4 DNA連接酶購(gòu)自New England Biolabs有限公司，其余分子生物學(xué)試劑和試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。

表1　引物序列Table 1 The list of primer sequences

1.2sgRNA序列設(shè)計(jì)及分析

為提高打靶效率針對(duì)TCS基因設(shè)計(jì)2個(gè)靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)靶點(diǎn)遵循如下原則：目的基因的正鏈和負(fù)鏈靶點(diǎn)的打靶效率大致相同，都可以設(shè)計(jì)靶點(diǎn)；靶點(diǎn)的GC%盡量不要低于40%，靶點(diǎn)序列GC%偏高（50%～70%）有較高的打靶效率；靶點(diǎn)內(nèi)（按5-N20NGG-3方向）不要有連續(xù)4個(gè)以上的T，以防RNA Pol III將其作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；雖然非特異打靶（脫靶）對(duì)植物基因打靶不是很重要的問題，但應(yīng)進(jìn)行靶點(diǎn)特異性分析，用靶點(diǎn)+NGG（前后各加幾十堿基）與茶樹轉(zhuǎn)錄組做 blast分析（參數(shù)選擇Somewhat similar sequences），避免使用與同源序列差異少于5個(gè)堿基的靶點(diǎn)（在切點(diǎn)附近和PAM有2個(gè)堿基差異就具有特異性）。把靶點(diǎn)序列連接到 sgRNA序列的 5′端（target sequence + GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA AGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT TTTT），利用在線軟件 RNA Folding Form（http：//mfold.rna.albany.edu/？q=mfold/RNA-F olding-Form2.3）做二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.3sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建方法

1.3.1Target 1 sgRNA（T1sgRNA）構(gòu)建

首先進(jìn)行第一輪PCR，第一輪PCR進(jìn)行2個(gè)反應(yīng)。取2～5 ng pYLgRNA-AtU3d-LacZ質(zhì)粒為模板，在1個(gè)PCR反應(yīng)中使用引物 U-F 和TCSU3dT1；第2個(gè)PCR反應(yīng)中使用引物TCSgRT1和gR-R。第1個(gè)PCR和第2個(gè)PCR反應(yīng)分別在兩個(gè) PCR管中進(jìn)行，采用相同的PCR反應(yīng)體系（表2）和相同的PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 2 min，25～28循環(huán)，94℃ 10 s，58℃ 15 s，68℃ 20 s。取 3 μL反應(yīng)液進(jìn)行電泳，檢查產(chǎn)物長(zhǎng)度是否符合預(yù)期，并估計(jì)樣品的大致濃度。第一輪PCR反應(yīng)完成后，進(jìn)行第二輪PCR。取第一輪PCR產(chǎn)物U3dT1-gRNA 各1 μL用H2O稀釋10倍，取1 μL為模板，以 Pps-R-C和 Pgs-GG2為引物，擴(kuò)增相應(yīng)的U3dT1-gRNA，采用表3所示的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min，17～20個(gè)循環(huán)，94℃ 10 s，58℃ 15s，68℃ 20 s。取 3 μL反應(yīng)液進(jìn)行電泳，檢查產(chǎn)物長(zhǎng)度是否符合預(yù)期，并估計(jì)樣品的大致濃度。

1.3.2Target 2 sgRNA（T2sgRNA）構(gòu)建

首先進(jìn)行第一輪 PCR，同樣進(jìn)行 2個(gè)反應(yīng)。取2～5 ng pYLgRNA-AtU3b質(zhì)粒為模板，在第 1個(gè) PCR反應(yīng)中使用引物 U-F和TCSU3bT2，第 2個(gè) PCR反應(yīng)使用引物TCSgRT2和gR-R。U-F/TCSU3bT2擴(kuò)出U3bT2序列，gR-R/TCSgRT2擴(kuò)出T2sgRNA序列。采用與構(gòu)建T1sgRNA第一輪PCR反應(yīng)相同的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序。取3 μL反應(yīng)液進(jìn)行電泳，檢查產(chǎn)物長(zhǎng)度是否符合預(yù)期，并估計(jì)樣品的大致濃度。第一輪PCR完畢，進(jìn)行第二輪PCR。取第一輪PCR產(chǎn)物U3bT2-gRNA各1 μL用H2O稀釋10倍，取1 μL為模板，以Pps-GG2和Pgs-L-C為引物，擴(kuò)增相應(yīng)的 U3bT2-gRNA。采用與構(gòu)建T1sgRNA第二輪PCR反應(yīng)相同的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序。取3 μL反應(yīng)液進(jìn)行電泳，檢查產(chǎn)物長(zhǎng)度是否符合預(yù)期。

1.4組裝sgRNA表達(dá)盒到pYLCRISPR/Cas9載體

1.4.1雙元載體與 sgRNA表達(dá)盒的酶切-連接反應(yīng)

采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)T1sgRNA和T2sgRNA PCR產(chǎn)物純化，使用表4所示的酶切-連接反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：37℃，1 min，16℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；最后55℃滅活內(nèi)切酶 5 min。以PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化酶切-連接產(chǎn)物。

表2　第一輪PCR反應(yīng)體系Table 2 The PCR reaction system for the first round of PCR

表3　第二輪PCR反應(yīng)體系Table 3 The PCR reaction system for the second round of PCR

1.5酶切-連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒提取

從-80℃冰箱中取出50 μL DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，放置在冰上直至融化，取10 μL連接產(chǎn)物加入DH 5α感受態(tài)細(xì)胞離心管，輕輕小彈離心管，使之混合均勻，冰浴20 min，在精確的 42℃水浴中熱擊 90 s，迅速將管子移到冰中放置2 min，加入平衡至室溫的750 μL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45 min，取100 μL菌液涂到含50 μg·mL-1Kan、0.5 mmol·L-1IPTG 和40 μg·mL-1X-gal的LB平板，將平板于37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取藍(lán)斑菌落，于3 mL含50 μg·mL-1Kan的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用Mlu I酶切驗(yàn)證，挑取正確質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2　結(jié)果與分析

2.1sgRNA設(shè)計(jì)

sgRNA序列全長(zhǎng) 97 nt，分為兩部分，5′決定靶序列的19 nt種子序列（Seed sequence）和3′區(qū)域?yàn)楸Ｊ氐慕Y(jié)構(gòu)序列。因此構(gòu)建針對(duì)特定靶位點(diǎn)的 sgRNA，只需要克隆決定靶序列的5′端20 nt。從GenBank中下載茶樹TCS基因組序列和cDNA序列，分析其內(nèi)含子所在區(qū)域。結(jié)果表明（圖 2），TCS1基因含 3個(gè)內(nèi)含子。在此基礎(chǔ)上搜尋 TCS的 CRISPR/Cas9靶序列，結(jié)果共搜尋到18個(gè)不含內(nèi)含子的候選靶序列。利用RNA Folding Form對(duì)18個(gè)候選靶序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，靶序列與sgRNA序列產(chǎn)生連續(xù)配對(duì) 7 bp以上會(huì)抑制其與染色體DNA靶序列結(jié)合靶點(diǎn)，因此要避免使用連續(xù)配對(duì)7 bp以上的靶序列。分析結(jié)果表明，在TCS1基因 ORF內(nèi)的靶序列“CTCACAAGCAGA GAAGGCT”（設(shè)為靶序列T1）和非編碼區(qū)內(nèi)靶序列“ATATCACTGCTGTGGCAGC”（設(shè)為靶序列T2）較為理想，可作為sgRNA序列的種子序列。

表4　雙元載體與sgRNA表達(dá)盒的酶切-連接反應(yīng)體系Table 4 The reaction system for the digestion and ligation of sgRNA expression cassettes and pYLCRISPR/Cas9 vector

2.2質(zhì)粒提取

將分別含有 pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b和pYLCRISPR/Cas9P35S-H質(zhì)粒的菌劃線活化，挑取單菌搖菌，采用質(zhì)粒提取試劑盒（小提）提取質(zhì)粒。電泳結(jié)果表明（圖3），提取的質(zhì)粒符合下一步實(shí)驗(yàn)的要求。

注：A：pYLgRNA-AtU3d-LacZ，B：pYLgRNA-AtU3b，C：pYLCRISPR/Cas9P35S-H，M：marker。Note：A：pYLgRNA-AtU3d-LacZ，B：pYLgRNA-AtU3b，C：pYLCRISPR/Cas9P35S-H，M：marker.圖3 質(zhì)粒電泳圖Fig.3 The electrophoresis analysis of plasmids

2.3sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建

sgRNA需要在植物細(xì)胞內(nèi)合成從而指導(dǎo)Cas9蛋白編輯靶基因，而sgRNA的合成是通過(guò)sgRNA表達(dá)盒來(lái)完成，sgRNA表達(dá)盒由啟動(dòng)子序列和gRNA序列組成。pYLgRNA載體（pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b）提供了不同的snRNA啟動(dòng)子可在植物細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄gRNA，并使gRNA停留在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其功能。此外，pYLgRNA載體還提供gRNA中保守序列。因此，以pYLgRNA質(zhì)粒為模板，通過(guò)常規(guī)PCR可以獲得snRNA啟動(dòng)子序列和gRNA中保守序列，而gRNA中5′段的種子序列在引物合成時(shí)導(dǎo)入，聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)PCR和overlapping PCR將啟動(dòng)子序列和gRNA序列組裝在一起（圖4）。電泳分析表明（圖5），針對(duì)靶序列 T1的第一輪PCR獲得了 360 bp 和130 bp左右的兩個(gè)片段，分別為U3d啟動(dòng)子和連接T1靶序列的gRNA；而針對(duì)靶序列T2的第一輪PCR獲得了380 bp和130 bp左右的兩個(gè)片段，分別為U3b啟動(dòng)子和連接T1靶序列的gRNA；針對(duì)靶序列T1的第二輪PCR 將U3d啟動(dòng)子片段和gRNA片段2個(gè)分離的片段連接在一起組裝成T1sgRNA表達(dá)盒；針對(duì)靶序列T2的第二輪PCR將U3b啟動(dòng)子片段和gRNA片段2個(gè)分離的片段連接在一起組裝成T2sgRNA表達(dá)盒。

2.4兩個(gè)sgRNA表達(dá)盒的拼接及與Cas9雙元表達(dá)載體的組合

T1sgRNA和T2sgRNA兩個(gè)單獨(dú)的表達(dá)盒構(gòu)建好后，需要將兩個(gè)表達(dá)盒拼接在一起，并且插入Cas9雙元表達(dá)載體中，以便通過(guò)農(nóng)桿菌的介導(dǎo)整合到茶樹基因組中，從而在茶樹細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，獲得Cas9和gRNA，進(jìn)而對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行編輯。我們應(yīng)用 Golden gate cloning 技術(shù)，一步完成sgRNA表達(dá)盒的拼接及與 Cas9雙元表達(dá)載體的組合，從而獲得CRISPR/Cas編輯載體（圖6）。如圖7所示，酶切、連接產(chǎn)物可見一條 980 bp左右的電泳條帶，表明T1sgRNA和T2sgRNA表達(dá)盒連接成功，同時(shí)還可見一條>4 000 bp的電泳條帶，說(shuō)明T1sgRNA和T2sgRNA表達(dá)盒可能已組裝進(jìn)入 pYLCRISPR/Cas9P35S-H雙元表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α后搖菌提取質(zhì)粒，以Mlu I酶切，結(jié)果如圖所示，可見兩條電泳條帶，其中一條 950 bp左右的條帶為T1sgRNA和T2sgRNA連接片段，而pYLCRISPR/Cas9P35S-H雙元表達(dá)載體未見950 bp左右的電泳條帶，說(shuō)明酶切、連接成功，獲得了TCS CRISPR/Cas9基因編輯載體。

2.5測(cè)序驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TCS 的CRISPR/Cas9基因編輯載體是否構(gòu)建成功，將獲得的10個(gè)質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序引物使用 SP-L2和 SP-R-C。測(cè)序結(jié)果（圖 8）表明，T1sgRNA和T2sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建成功，在119 bp處檢測(cè)到T1、T2靶序列，緊接靶序列后檢測(cè)到 gRNA保守序列的存在，同時(shí)在T1和T2靶序列上游分別檢測(cè)到U3d和U3b啟動(dòng)子序列，在 T1sgRNA 表達(dá)盒上游T2sgRNA表達(dá)盒下游均檢測(cè)到了pYLCRISPR/Cas9P35S-H雙元表達(dá)載體序列。測(cè)序結(jié)果（圖 9）說(shuō)明，T1sgRNA表達(dá)盒和T2sgRNA 表達(dá)盒構(gòu)建成功，并成功組裝入pYLCRISPR/Cas9P35S-H雙元表達(dá)載體，證實(shí)TCS的CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建成功。

圖4　sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建流程Fig.4 Procedures for generation of a sgRNA expression cassette

圖5　第一、二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖Fig.5 The electrophoresis analysis of the first and the second round of PCR products

圖6　Golden gate cloning 組裝茶樹CRISPR/Cas9基因組編輯載體Fig.6 Asembly the CRISPR/Cas9 editing vector by using golden gate cloning.

注：M為maker；L為sgRNA表達(dá)盒與Cas9雙元表達(dá)載體酶切、連接產(chǎn)物；TCA為CRISPR/Cas9基因編輯載體的Mlu I酶切產(chǎn)物；C為質(zhì)粒pYLCRISPR/Cas9P35S-H的Mlu I酶切產(chǎn)物。Note：M：maker.L：Digestion and ligation products of sgRNAs and pYLCRISPR/Cas9P35S-H.TCA：Digestion products of CRISPR/Cas9 cassettes for TCA with Mlu I.C：Digestion products of pYLCRISPR/Cas9P35S-H with Mlu I.圖7 連接產(chǎn)物及質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.7 The electrophoresis analysis of ligation and digestion products

圖8　TCS基因編輯載體部分測(cè)序圖Fig.8 The sequencing chromatogram of genome editing vector for TCS

圖9　TCS基因編輯載體測(cè)序結(jié)果Fig.9 The sequence of genome editing vector for TCS

3　討論

CRISPR是一種簡(jiǎn)單的，在全基因組水平上選擇性調(diào)控目的基因表達(dá)的方法。該技術(shù)不同于傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)（RNAi），CRISPR干擾可以同時(shí)沉默任意數(shù)量的單個(gè)基因。此外，它能夠更明確、更穩(wěn)定地發(fā)揮作用，能夠極其靈活和快速選擇靶位點(diǎn)。2013年，張峰等［14］首先利用 CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了真核生物基因組的剪切。此后，CRISPR/Cas9技術(shù)研究一發(fā)不可收拾，國(guó)內(nèi)外學(xué)者迅速在多種動(dòng)、植物中開展了CRISPR/Cas9研究，不到3年的時(shí)間就已經(jīng)在模式植物、農(nóng)作物及園藝植物中取得了非常成功的應(yīng)用［17］。據(jù)報(bào)道，在擬南芥和水稻中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)引起的突變率高達(dá)90%以上。通常情況下，CRISPR/Cas9會(huì)產(chǎn)生野生株、雜合突變體、雙等位基因突變體和純合突變體，而只有雙等位基因突變體和純合突變體才有應(yīng)用價(jià)值。因此，如果第一代轉(zhuǎn)基因未能獲得雙等位基因突變體或純合突變體需要通過(guò)不斷自交從子代中篩選雙等位基因突變體和純合突變體。幸運(yùn)的是，業(yè)已證明多種植物均能在第一代轉(zhuǎn)基因中獲得雙等位基因突變體或純合突變體，從而增加了 CRISPR/Cas9實(shí)用性。因此，對(duì)于茶樹等自交不親和的作物同樣可以采用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得純合突變株。但是，將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于茶樹中將面臨表達(dá)載體構(gòu)建的問題，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本文以茶樹中咖啡堿合成酶為例，聯(lián)合采用常規(guī)PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技術(shù)，構(gòu)建了包含茶樹咖啡堿合成酶雙靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9基因編輯載體，為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)其他植物 CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建提供了技術(shù)支撐。

雖然茶樹基因組尚未釋放，影響脫靶效應(yīng)分析。但是，一般來(lái)說(shuō) CRISPR/Cas9要對(duì)基因編碼區(qū)進(jìn)行編輯才能引起突變表型，在沒有全基因組序列的情況下對(duì)轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對(duì)，可在一定程度上排除錯(cuò)靶現(xiàn)象。此外，相對(duì)動(dòng)物而言，植物的脫靶帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)較小。所以，在茶樹基因組釋放前，同樣可以開展針對(duì)茶樹的CRISPR/Cas9研究工作。

本文建立的 CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方法，在Ma等［28］報(bào)道的方法上進(jìn)行了完善與改進(jìn)。pYLCRISPR/Cas9P35S-H等雙元表達(dá)載體因?qū)儆诘涂截愝d體，且載體較大，一般需要采用大提質(zhì)粒試劑盒來(lái)提取，具有成本高、效率低的缺點(diǎn)。本文通過(guò)擴(kuò)大菌的培養(yǎng)量和培養(yǎng)時(shí)間，菌液約5 mL左右，震蕩培養(yǎng)約 16 h，洗脫質(zhì)粒時(shí)使用 60℃無(wú)菌水，且在烘箱中60℃孵育2 min，最后發(fā)現(xiàn)，采用小提質(zhì)粒提取試劑盒同樣可以獲得高質(zhì)量且足量的pYLCRISPR/Cas9P35S-H質(zhì)粒（圖3），完全滿足載體構(gòu)建要求。

第一輪PCR的目的是將gRNA及其啟動(dòng)子分別克隆出來(lái)，而第二輪 PCR是利用Overlapping PCR將和啟動(dòng)子連接起來(lái)形成gRNA表達(dá)盒，并在gRNA表達(dá)盒兩端加上帶BsaI酶切位點(diǎn)的接頭，然后酶切連接，將各個(gè)gRNA表達(dá)盒連接起來(lái)，并與pYLCRISPRcas9載體連接。在第一輪PCRMa等［28］人將第一個(gè)反應(yīng)與第2個(gè)反應(yīng)在同一PCR管中進(jìn)行，在一個(gè)反應(yīng)中使用4種引物，在循環(huán)初始階段同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)片段，并在循環(huán)后階段通過(guò)Overlapping PCR將兩片段拼接在一起。然而，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一PCR管中進(jìn)行2個(gè)反應(yīng)很難獲得特異片斷。最后，我們將2個(gè)反應(yīng)分開進(jìn)行，獲得了理想的結(jié)果。

本載體系統(tǒng)采用 Golden Gate Cloning［29］技術(shù)組裝Cas9載體和多個(gè)gRNA表達(dá)盒片段。Golden Gate cloning是利用 BsaI（type IIs restriction enzyme）的識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不重疊的特性，可以設(shè)計(jì)出多種不同的且非回文結(jié)構(gòu)的粘性末端（256-16=240種，減去的 16種是回文結(jié)構(gòu)）。多個(gè)要連接的片段在連接點(diǎn)具有特異的互補(bǔ)末端可以連接，而非連接點(diǎn)的末端之間不互補(bǔ)不能連接（相同末端分子間也不互補(bǔ)不能連接），因此連接反應(yīng)是向著目標(biāo)單方向進(jìn)行，效率很高。此外，利用 BsaI酶進(jìn)行Golden Gate cloning時(shí)，可實(shí)現(xiàn)酶切、連接同步化，即邊切邊連，不需要酶切后切膠回收的繁瑣操作，簡(jiǎn)單、方便且節(jié)省大量時(shí)間。Ma等［28］采用的酶切、連接程序?yàn)椋?0℃ 5 min，20℃ 5 min；10～15循環(huán)。按照Ma等［28］等方法我們嘗試多次，但均未成功，后來(lái)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了多次優(yōu)化，最后確定了酶切、連接程序?yàn)椋?7℃ 1 min，16℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，最后55℃滅活內(nèi)切酶5 min。

本文成功構(gòu)建了靶向TCS的CRISPR/Cas9基因組編輯載體，為茶樹其他基因靶向的 CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建提供了借鑒方法。下一步的工作，是通過(guò)根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將 CRISPR/Cas9基因組編輯載體轉(zhuǎn)入茶葉愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因愈傷組織或轉(zhuǎn)基因茶樹，并檢測(cè)突變材料中的咖啡堿生物合成情況，驗(yàn)證 CRISPR/Cas9基因組編輯載體的有效性。如有必要，再對(duì)載體進(jìn)行改進(jìn)，比如使用茶樹本身的 sn RNA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gRNA的表達(dá)，根據(jù)茶樹的特性優(yōu)化 Cas9密碼子，從而建立完善的 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的茶樹基因組編輯體系，推動(dòng)茶樹分子育種、基因功能研究、茶樹基因工程等工作快速發(fā)展。

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Development of a CRISPR/Cas9 Constructed for Genome Editing of Caffeine Synthase in Camellia sinensis

TANG Yuwei1，3，LIU Liping1，3，WANG Ruoxian1，CHEN Yuhong1，LIU Zhonghua1，2，3，LIU Shuoqian1，2，3*

1.College of Horticulture and Hardening，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；
2.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals，Changsha 410128，China；
3.Key Lab of Tea Science，Ministry of Education，Changsha 410128，China

CRISPR/Cas9 technology（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）is a novel and powerful approach for targeted genome editing，such as targeted gene knock out or site-directed mutagenesis in a simple and easy way.Since its establishment，the CRISPR/Cas9 technique has been successfully applied in many eukaryotic organisms，including more than 10 plant species.However，it has not been available for genome editing of tea plant ［Camellia sinensis（L.）O.Kuntze］due to the difficulty in constructing CRISPR/Cas9 expression vector.The present work developed an efficient method to construct a CRISPR/Cas9 expression vector for genome editing a tea caffeine synthase（TCS）by using general PCR，overlapping PCR and golden gate cloning technology.The present work would promote the application of CRISPR/Cas9 technology in genomic modification in tea plants.

Camellia sinensis（L.），genome editing technology，tea caffeine synthase，CRISPR/Cas9 technique

TS272；Q52

A

1000-369X（2016）04-414-13

2016-04-25

2016-05-12

唐雨薇，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究，*通訊作者：shqianliu@sina.com

2015，16：232.10.1186/s13059-015-0796-9.