氫飽和生理鹽水對大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷的保護(hù)作用*

楊　培,冷　波,李　波，曾新桃,羅　華

(1.四川省綿陽市中心醫(yī)院肝膽外科　621000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科,四川瀘州 646000)

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論著·基礎(chǔ)研究

氫飽和生理鹽水對大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷的保護(hù)作用*

楊培1,冷波2△,李波2，曾新桃1,羅華1

(1.四川省綿陽市中心醫(yī)院肝膽外科621000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科,四川瀘州 646000)

目的探討靜脈注射氫飽和生理鹽水(HRS)對?；悄懰徕c誘導(dǎo)的大鼠重癥急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷(APALI)是否具有保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法將54只健康SD雄性大鼠分成假手術(shù)組(Sham組)、模型組(SAP+NS組)和HRS處理組(SAP+HRS組)，各組再按時間點(diǎn)每個亞組分成6、12、24 h 3個亞組，每個時間點(diǎn)處死6只大鼠。收集血清、肺組織及胰腺組織。檢測血清TNF-α、IL-1β水平；肺組織濕干質(zhì)量比；測定肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)；并對胰腺組織、肺組織損傷進(jìn)行病理學(xué)評價。結(jié)果(1)SAP+NS組和SAP+HRS組血清中TNF-α、IL-1β水平、胰腺和肺組織病理評分、肺組織TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)，肺組織濕干質(zhì)量比在6、12、24 h各個時間點(diǎn)均高于Sham組(P<0.05)。(2)SAP+HRS組與SAP+NS組比較，SAP+HRS組血清TNF-α水平、肺組織TNF-α mRNA的表達(dá)、肺組織濕干質(zhì)量比在各個時間點(diǎn)均低于SAP+NS組(均P<0.05)。血清IL-1β水平、胰腺和肺組織病理評分、肺組織中IL-1β mRNA表達(dá)在6 h時兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但在12、24 h時SAP+HRS組低于SAP+NS組(均P<0.05)。結(jié)論HRS可能是通過其選擇性抗氧化作用抑制了氧化應(yīng)激損傷相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對APALI的保護(hù)。

胰腺炎,急性壞死性；呼吸窘迫綜合征,成人；氫飽和生理鹽水；大鼠,sprague-dawley

急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷(acute pancreatitis associated lung injury,APALI)[1]是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreastitis，SAP)最常見、也是最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，常發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，是SAP早期主要死亡原因。研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)在胰腺損傷及伴隨的局部或全身并發(fā)癥中起著至關(guān)重要的作用[2]。因此，抗氧化應(yīng)激治療可能是減輕SAP病情發(fā)展的重要手段。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠SAP模型，探討靜脈注射氫飽和生理鹽水(hydrogen-rich saline，HRS) 是否對APALI具有保護(hù)作用，并從炎癥細(xì)胞因子的變化方面初步探討其保護(hù)機(jī)制，旨在為應(yīng)用HRS治療APALI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組SPF級健康成年雄性SD大鼠由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)中心提供，體質(zhì)量200～250 g，分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(SAP+NS組)及HRS處理組(SAP+HRS組)，每組18只。各組再分成處理后6、12、24 h 3個時間點(diǎn)，各6只大鼠。

1.1.2主要儀器和試劑DH-300超高純度氫氣發(fā)生器(廣州深華生物技術(shù)有限公司)、大鼠TNF-α、IL-1β試劑盒(Bender公司)、PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物模型的建立Sham組大鼠開腹后翻動十二指腸并觸摸胰腺數(shù)次,隨即關(guān)腹，不做其他處理。采用膽胰管逆行緩慢注入(0.1 mL/min)5%無菌牛磺膽酸鈉(1 mL/kg)的方法制備大鼠SAP模型[3]。SAP+NS組和SAP+HRS處理組在大鼠SAP模型建模成功后1 h分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水或HRS(5 mL/kg)。

1.2.2標(biāo)本采集按規(guī)定時間點(diǎn)處死大鼠。心臟采血3～4 mL,4 ℃、12 000 r/min低溫高速離心得血清1.5～2.0 mL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫笥曳紊先~和部分胰腺組織置于10%甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋,4 ℃保存,然后4 μm切片,蘇木素-伊紅(HE)染色用于病理學(xué)評價。大鼠右肺中葉置于液氮中,-80 ℃保存?zhèn)溆?分別用于TNF-α、IL-1β mRNA等分子生物學(xué)檢測。取右肺下葉濾紙吸干表面滲液及血跡,稱濕質(zhì)量后置于80 ℃干燥箱內(nèi)烘烤72 h至恒重后稱質(zhì)量,用于計算肺臟濕干質(zhì)量比。

1.3觀測指標(biāo)

1.3.1血清TNF-α、IL-1β水平采用ELISA法測定血清中TNF-α、IL-1β水平。

1.3.2胰腺、肺組織病理損傷評價在雙盲條件下，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。采用改良Schmidt評價標(biāo)準(zhǔn)[4]對胰腺組織損傷進(jìn)行病理學(xué)計分。參照Hofouaer方法[5],對肺組織損傷進(jìn)行病理學(xué)評價。每張切片隨機(jī)選取5個視野,取其平均分作為該切片的病理損傷評分,代表其損傷程度。

1.3.3肺組織濕干質(zhì)量比取右肺下葉進(jìn)行測量，反映組織水腫程度。

1.3.4肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)采用熒光定量PCR法檢測。

2　結(jié)　　果

2.1血清中TNF-α的水平變化SAP+NS組和SAP+HRS組大鼠血清中TNF-α水平在6、12、24 h 3個時間點(diǎn)均高于Sham組,但SAP+HRS組均低于SAP+NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

2.2血清中IL-1β的水平變化SAP+NS組和SAP+HRS組大鼠血清中IL-1β水平在6、12、24 h 3個時間點(diǎn)均高于Sham組。SAP+HRS組與SAP+NS組比較，6 h時SAP+HRS組略高于SAP+NS組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；12、24 h時SAP+HRS組均低于SAP+NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表1　　各組大鼠血清TNF-α水平比較

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

表2　　各組大鼠血清IL-1β水平比較

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

2.3胰腺和肺組織病理損傷評分在6、12、24 h 3個時間點(diǎn)，SAP+NS組和SAP+HRS組胰腺組織、肺組織病理損傷評分均高于Sham組(P<0.05)。SAP+HRS組與SAP+NS組比較，6 h時兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；12、24 h時SAP+HRS組均低于SAP+NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3　　各組胰腺和肺組織病理評分比較±s，分)

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

表4　　各組肺組織濕干質(zhì)量比比較±s)

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

2.4肺組織濕干質(zhì)量比的變化在6、12、24 h 3個時間點(diǎn)，SAP+NS組和SAP+HRS組肺組織濕干質(zhì)量比均高于Sham組(P<0.05)。SAP+HRS組與SAP+NS組比較，SAP+HRS組各時間點(diǎn)均低于SAP+NS組(P<0.05)。見表4。

2.5肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)變化在6、12、24 h 3個時間點(diǎn)，SAP+NS組和SAP+HRS組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平均高于Sham組(P<0.05)。

表5　　各組肺組織TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)水平的比較

a：P<0.05,與Sham組比較;b:P<0.05,與SAP+NS組比較。

SAP+HRS組與SAP+NS組比較，各時間點(diǎn)SAP+HRS組TNF-α mRNA均低于SAP+NS組(P<0.05)。6 h時兩組IL-1β mRNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；12、24 h時SAP+HRS組IL-1β mRNA明顯低于SAP+NS組(均P<0.05)。見表5。

3　討　　論

APALI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確。既往研究顯示，炎癥通路過度活化與SAP 時多器官功能損傷關(guān)系密切，IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子在SAP 早期表達(dá)明顯增加,且表達(dá)量的增加與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后明顯相關(guān)[6]。TNF-α等是促炎細(xì)胞因子，還能促進(jìn)其他細(xì)胞因子如IL-6、IL-8等形成，其表達(dá)水平上調(diào)會導(dǎo)致組織受損、微循環(huán)障礙，誘發(fā)多器官功能障礙[7]。因此，抑制促炎細(xì)胞因子的活化可能對APALI起到保護(hù)作用。2007年日本學(xué)者Ohsawa等[8]發(fā)現(xiàn)氫氣具有選擇性抗氧化作用，可以選擇性中和毒性作用強(qiáng)的羥自由基和亞硝酸陰離子，而后兩者是氧化應(yīng)激的重要介質(zhì)，目前體內(nèi)尚未找到特異性清除途徑。該研究迅速引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，掀起了研究氫分子生物學(xué)的熱潮。而后在肝、腎、心肌、腦、小腸等[9-13]器官的缺血再灌注模型中,也相繼發(fā)現(xiàn)氫氣在細(xì)胞保護(hù)和臟器損傷防護(hù)中發(fā)揮著明顯抗氧化和抗炎作用。

本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠SAP模型的基礎(chǔ)上，經(jīng)尾靜脈注射HRS觀察其治療效果及對炎癥細(xì)胞因子的影響。結(jié)果顯示：SAP+HRS組肺組織病理損傷評分和肺水腫指標(biāo)(肺濕干質(zhì)量比)明顯優(yōu)于SAP+NS組，說明HRS能顯著改善肺組織炎癥損傷程度，對肺組織損傷具有保護(hù)作用。SAP+HRS組6、12、24 h時血清中TNF-α的水平均低于SAP+NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明HRS對TNF-α炎癥因子有明顯抑制作用；SAP+HRS組在6 h時血清中IL-1β水平與SAP+NS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，隨著時間的變化，在12、24 h時均低于SAP+NS組，表明HRS對IL-1β炎癥因子同樣具有抑制作用。再采用熒光定量PCR法對肺組織中TNF-α、IL-1β的核酸水平(TNF-α、IL-1β mRNA)進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，SAP+HRS組在6、12、24 h時肺組織中TNF-α mRNA的表達(dá)均低于SAP+NS組；SAP+HRS組在6 h時肺組織中IL-1β mRNA表達(dá)與SAP+NS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但隨著時間的延長，12、24 h時均低于SAP+NS組，表明HRS對肺組織中的TNF-α、IL-1β mRNA合成均有抑制作用，提示HRS可能從基因水平抑制炎癥細(xì)胞因子的生成。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靜脈注射HRS對血清中TNF-α、IL-1β水平及肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA水平表達(dá)具有明顯抑制作用，相應(yīng)的肺組織及胰腺組織病理損傷評分降低，肺濕干質(zhì)量比降低，提示HRS可能通過其選擇性抗氧化應(yīng)激作用下調(diào)血清和肺組織中TNF-α、IL-1β的表達(dá)，改善肺組織的病理損傷，從而對APALI起到一定的保護(hù)作用。但其具體的作用機(jī)制，如基因?qū)用嫒绾芜M(jìn)行調(diào)控等還有待進(jìn)一步研究明確。

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Protective effect of hydrogen-rich saline solution on lung injury in rats with severe acute pancreatitis*

YangBei1,LengBo2△,LiPo2,ZengXintao1,LuoHua1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,MianyangCentralHospital,Mianyang,Sichuan621000,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo explore whether intravenous injection of hydrogen-rich saline having the protective effect on sodium taurocholate induced severe acute pancreatitis(SAP) associated lung injury(APALI) in rats and its possible mechanisms.MethodsFifty-four healthy male SD rats were randomly divided into sham-operation group (Sham group),model group (SAP+NS group) and hydrogen water treatment group (SAP + HRS group),and each group was subdivided into 6,12,24 h subgroups.Six rats were killed at each time point for collecting serum,lung tissue and pancreas tissue.Serum TNF-α and IL-1β levels,lung wet /dry weight ratio,expression of TNF-α mRNA and IL-1β mRNA in the lung tissue were detected.The pathological evaluation of pancreas and lung tissue injury was performed.Results(1)The levels of TNF-α and IL-1β in serum,pancreas and lung tissue pathological scores,TNF-α mRNA and IL-1β mRNA expression levels in the lung tissue and lung wet dry weight ratio at the time points of 6,12,24 h in the SAP+NS group and the SAP+HRS group were higher than those in the sham group (P<0.05).(2) Compared with the SAP+NS group,the levels of serum TNF-α,TNF-α mRNA expression level in the lung tissue and lung wet dry weight ratio at all time points in the SAP+HRS group were lower(P<0.05);the levels of serum IL-1β,pancreas and lung tissue pathological score and IL-1β-mRNA expression at 6 h in the lung tissue had no statistical difference between the SAP+NS group and SAP+HRS group,but which at time points of 12,24 h in the SAP+HRS group were lower than those in the SAP+NS group(P<0.05).ConclusionHRS realize the protection on APALI possibly via its elective anti-oxidation action for inhibiting oxidative stress injury related cytokines expression.

pancreatitis,acute necrotizing;respiratory distress syndrome,adult;hydrogen-rich saline；rats,sprague-dawley

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.005

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃資助項(xiàng)目(2012JY0070)。作者簡介：楊培(1972-)，主任醫(yī)師，博士，主要從事肝膽外科學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:305827337@qq.com。

R576

A

1671-8348(2016)12-1598-03

2015-12-08

2016-01-12)