新生兒金黃色葡萄球菌皮膚和軟組織化膿性感染臨床分離株分子及毒力特征

耿文靜　李文婷　姚開虎　沈敘莊　齊宇潔

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·論著·

新生兒金黃色葡萄球菌皮膚和軟組織化膿性感染臨床分離株分子及毒力特征

耿文靜1,3李文婷2,3姚開虎2沈敘莊2齊宇潔1

目的監(jiān)測新生兒金黃色葡萄球菌(SA)皮膚和軟組織化膿性感染(SSTIs)臨床分離株的分子和毒力特征，為預(yù)防和治療新生兒SSTIs提供理論依據(jù)。方法 收集2015年5月至2016年4月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院NICU臨床診斷為SSTIs的病例，對SA分離株進(jìn)行agr、MLST、spa 和SCCmec 分型；通過PCR對SA菌株進(jìn)行21種超抗原毒素基因、sasX、PVL基因檢測。結(jié)果44例SSTIs新生兒，男22例，中位年齡4.5(0～22)d，均為社區(qū)獲得性感染。共分離出13例SA菌株，其中MRSA 7株，MRSA最常見的克隆是agrⅠ-MRSA-ST59-SCCmecⅣa，13株SA包含2～8種超抗原基因型，最常見的毒素基因型為sek-seb-seq，有6株SAPVL基因陽性，均不攜帶sasX基因。結(jié)論新生兒SSTIs中，SA攜帶率較低， agrⅠ-MRSA-ST59-SCCmecⅣa-t437是MRSA最主要的流行克隆，SA分離株超抗原基因攜帶率高。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；皮膚和軟組織化膿感染；毒力；新生兒

新生兒因其特殊的生理特點(diǎn)，表皮的屏障功能不完善，是皮膚和軟組織化膿性感染(SSTIs)的高危人群。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，金黃色葡萄球菌(SA)是新生兒SSTIs的主要病原[1]。自20世紀(jì)90年代末耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)出現(xiàn)以來，MRSA引起SSTIs的顯著增加，而MRSA的高度耐藥性是新生兒SA感染持續(xù)存在且難以清除的重要原因[2]。由于新生兒的免疫功能差，血腦屏障未發(fā)育成熟，SSTIs如未及時(shí)控制，可引發(fā)嚴(yán)重的侵襲性感染(敗血癥、化膿性腦膜炎等)，本研究前瞻性監(jiān)測首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)NICU診斷的SSTIs病例，對SA臨床分離株進(jìn)行分子及毒力特征研究，為預(yù)防及治療新生兒SSTIs提供理論依據(jù)。

1　方法

1.1樣本來源2015年5月1日至2016年4月1日我院NICU臨床診斷為SSTIs的病例，新生兒SSTIs主要包括：結(jié)膜炎、臍炎、膿皰瘡、皮膚外傷和術(shù)后傷口分泌物等，上述疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)用新生兒學(xué)》(第4版)[3]。

1.2菌株來源和鑒定對于確診為SSTIs的病例，用無菌棉簽將膿性分泌物或膿腫穿刺液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，通過菌落的形態(tài)學(xué)對SA進(jìn)行鑒定。通過凝固酶試驗(yàn)和頭孢西丁紙片(每片30 μg，Oxoid)法對其進(jìn)行篩查。使用PCR方法檢測mecA和nuc基因。以紙片法保存菌株，-20℃貯藏，冷凍狀態(tài)下轉(zhuǎn)運(yùn)。

1.3SA菌株基因檢測對SA菌株行統(tǒng)一基因檢測。

1.3.1DNA提取硅膠模型TM基因組DNA提取試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；溶葡萄球菌素(1 200 U·mg-1)購自BBI 公司。所提取DNA作為所有PCR的模板。

1.3.2PCR及測序采用PTC-200 PCR擴(kuò)增儀(美國MJ Research公司)行PCR操作。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：2.5 μL的10×PCR buffer(Mg2+Plus)，1.5 μL的2.5 mmol dNTP混合物，各1 μL的10 μmol·μL-1引物，0.2 μL的5 U·μL-1TaKaRa Taq，2.5 μL的模板DNA。PCR產(chǎn)物在含溴乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀觀察和保存結(jié)果。擴(kuò)增目的片段測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司完成。

1.3.2.1多位點(diǎn)序列分型(MLST)使用PCR檢測7個(gè)管家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil。參考Enrigh 等[4]設(shè)計(jì)引物。退火溫度53℃。測序結(jié)果在MLST數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://saureus.mlst.net)上比對等位基因的序列型(ST)。應(yīng)用eBURSTv3 軟件進(jìn)行菌株親緣關(guān)系分析。

1.3.2.2SCCmec分型和亞型采用Milheirico等[5]提出的多重PCR方法對所有SA分離株進(jìn)行SCCmec分型及亞型檢測。SCCmecⅠ-Ⅴ 型標(biāo)準(zhǔn)株由日本順天堂大學(xué)Teruyo Ito教授贈送。

1.3.2.3spa分型spa分型的PCR引物，上游：5′-GACG-ATCCTFCAGTGAGCAAAG-3′；下游：5′-GCAGCAATTTTGT-CAGCAGTAG-3′。退火溫度55℃。測序結(jié)果通過數(shù)據(jù)庫(http//www.ridom.de/spas erver)進(jìn)行spa分型。

1.3.2.4PVL基因檢測引物設(shè)計(jì)參照Lina等[6]方法。退火溫度55℃。擴(kuò)增片段長度433 bp。

1.3.2.5超抗原毒素基因檢測及agr分型的測定按照Holtfreter等[7]方法通過6個(gè)多重PCR對每株SA進(jìn)行21種超抗原毒素基因檢測及agr分型測定：①sea，seh，sec和tst；②sed，etd，eta和sek；③see，seb，sem，sel和seo；④sen，seg，seq和sej；⑤sei，ser，seu和sep；⑥agr-Ⅰ至agr-Ⅳ。退火溫度55℃。用超抗原基因陽性的SA標(biāo)準(zhǔn)株作為陽性對照，用SA 8325-4作為超抗原基因陰性的對照。德國Greifswald大學(xué)Br?ker教授饋贈了所有對照菌株。

1.3.2.6SasX基因檢測引物參照2010年對ST239測序完成的SATW20_21850序列[8]進(jìn)行設(shè)計(jì)。退火溫度56℃。擴(kuò)增片段長度522 bp。

1.4臨床資料采集收集SA菌株基因檢測陽性的SSTIs病例的臨床資料，①性別，年齡，感染疾病。②根據(jù)診斷SSTIs時(shí)點(diǎn)距入院時(shí)間判斷醫(yī)院感染或社區(qū)獲得性感染，參考美國CDC社區(qū)獲得性感染定義[9](從門診或從住院48 h內(nèi)的患兒中分離出來的菌株；同時(shí)沒有SA感染或定植的病史，無永久的留置設(shè)備，如導(dǎo)管或其他穿通皮膚的醫(yī)療用具)。③根據(jù)采集標(biāo)本時(shí)點(diǎn)新生兒日齡判斷早期新生兒(≤7 d)與晚期新生兒(>7 d)的SA攜帶。

2　結(jié)果

2.1一般情況我院NICU共收集到44例臨床診斷為SSTIs新生兒，男女各22例，中位年齡4.5(0～22) d，其中早期新生兒16例，晚期新生兒28例。44例均為社區(qū)獲得性感染，其中結(jié)膜炎17例，臍炎14例，膿皰瘡7例，皮膚外傷4例，術(shù)后傷口分泌物2例。44例SSTIs病例中(膿性分泌物35例，膿腫穿刺液9例)檢出SA 13例(膿性分泌物9例，膿腫穿刺液4例)。13例SA菌株中，其中男4例，女9例；來自臍炎5例，膿皰瘡及結(jié)膜炎各4例；早期新生兒2例，晚期新生兒11例。

2.2SA分離株的分子特征13株SA中，ST分子分型有5種，分別為ST59 7株，ST217和ST1各2株，ST1281和ST398各1株。MRSA有7株，其中ST59 5株，ST217 2株；SCCmecⅣ型 4株(均為SCCmecⅣa亞型)，SCCmecⅤ型3株。

13株SA中，spa分型有6種，分別為t437 5株，t114、t548和t309各2株，t164 和t034各1株。7株MRSA中，t437 5株，t309 2株；13株SA中agrⅠ型9株，agrⅡ及Ⅲ型各2株，7株MRSA均為agrⅠ型。

7株MRSA中，agrⅠ-MRSA-ST59-SCCmecⅣa -t437 4株，agrⅠ-MRSA-ST217-SCCmecⅤ-t309 2株，ST59-SCCmecⅤ-t437 1株。

2.3SasX、PVL及超抗原毒力基因攜帶情況13株SA分離株中，均不攜帶sasX基因，有6株顯示PVL陽性(均為MRSA)。6例PVL陽性的MRSA分離株中，4例來源于膿皰瘡新生兒，另外2例分別來源于臍炎及結(jié)膜炎新生兒。

13株SA中，包含2～8種超抗原基因，10株攜帶3種以上超抗原基因，7株攜帶4種以上超抗原基因，8株攜帶sei基因，未發(fā)現(xiàn)etd、eta、see、sel、seu和sep基因。有3株SA攜帶sek-seb-seq基因型，同一agr、ST、SCCmec、spa型中可有1～3種超抗原基因譜, 4株agrⅠ-ST59-SCCmecⅣ-t437型菌株中共有3種基因譜，分別是sek-seb-seq(2株)，seq-sej(1株)，seb-seq(1株)。

3　討論

SA是SSTIs的主要致病菌之一，國外已有多項(xiàng)研究報(bào)道了新生兒SSTIs中SA暴發(fā)流行。在意大利新生兒SSTIs中SA的分離率為77%(339/441)，美國為61%(195/321)，日本MRSA分離率為87%(104/120)[10]。世界范圍內(nèi)SA引起的SSTIs主要是膿皰瘡和蜂窩織炎[11]。本研究中SA的分離率為29.5%(13/44)，較國外報(bào)道偏低。

MLST是針對SA的7個(gè)管家基因arcC，aroE，glpF，gmK，pta，tpi和ypil進(jìn)行的分型，目前已經(jīng)建立了國際大型的數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www. mlst.net)，以利于不同國家和地區(qū)SA分子特征的比較。目前，MLST廣泛應(yīng)用于SA，對了解其遺傳背景及可能的來源有很大幫助。SCCmec是一種攜帶mecA基因的可移動基因元件，可以整個(gè)的從染色體中自發(fā)剔除，也可以從1株菌細(xì)胞染色體轉(zhuǎn)移整合至另外1株菌細(xì)胞染色體中。目前根據(jù)mec復(fù)合體和ccr復(fù)合體將其分為11種SCCmec類型(Ⅰ～Ⅺ型)，spa是編碼SA細(xì)胞壁蛋白的基因， spa分型既可用于MRSA分子克隆計(jì)劃的研究，也可用于醫(yī)院MRSA暴發(fā)流行的檢測[12]。

有研究表明不同地域SSTIs中MRSA流行株基因型不同，來源于美國和加拿大SSTIs的MRSA主要為ST8型[13]，歐洲主要是ST80型，在瑞典、德國、西班牙、希臘、日本、中國香港和新加坡主要是ST30型[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中國兒童MRSA的流行克隆主要是ST59- SCCmecⅣa-t437[15]，而本研究發(fā)現(xiàn)新生兒SSTIs MRSA分離株中最常見克隆也是ST59-SCCmecⅣa-t437，與前期研究結(jié)果一致，與其他國家和地區(qū)有明顯不同。

MRSA可產(chǎn)生多種與感染相關(guān)的外毒素，包括超抗原毒素、溶細(xì)胞毒素以及抗吞噬的微生物表面組分等，超抗原毒素能夠顯著改變宿主的免疫功能，能夠誘發(fā)高熱，增強(qiáng)宿主對毒素殺傷效應(yīng)的敏感性，并誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[16]。超抗原基因位于可移動遺傳元件(MGEs)上，如致病島、噬菌體和質(zhì)粒上，可在菌株間通過水平轉(zhuǎn)移傳遞，本研究13株SA均攜帶2～8個(gè)超抗原基因，表現(xiàn)出明顯的多樣性。日本最常見的克隆為ST5型，seo基因是最常見的超抗原基因；西班牙ST125型最常見，sec基因是最常見的超抗原基因，美國CC8型最常見，ser基因是最常見的超抗原基因[17]，本研究中ST59型最常見(7/13)，sei基因的攜帶率最高。造成這一差異的原因?yàn)槌乖虻臄y帶多與克隆相關(guān)，不同地理來源的菌株克隆分布有很大差別。sek-seb-seq位于致病島SaPI1上[18]，本研究3株SA中檢測到sek-seb-seq基因型，表明這些菌株包含有致病島SaPI1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)1株SA攜帶有sek-seb-seq中的1或2個(gè)基因，說明可能在SaPI1的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了新的變異體，另外有9株SA攜帶有其他基因，說明這些菌株上存在攜帶其他超抗原基因的MGEs，是菌株在進(jìn)化過程中基因重組的結(jié)果。

PVL在MRSA致病中的作用存在爭議。Archer等的[19]研究表明PVL并未在小鼠皮膚感染模型中發(fā)揮重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)13株SA中有6株P(guān)VL陽性，但由于樣本量較小，未得出PVL與臨床疾病相關(guān)性分型。2010年英國Holden等對英國醫(yī)院環(huán)境內(nèi)暴發(fā)流行MRSA ST239克隆株進(jìn)行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞壁錨定蛋白，將其命名為SA表面蛋白X(SasX)，編碼15 kDa的分泌型表面錨定蛋白，已有文獻(xiàn)報(bào)道MRSA的流行傳播與SasX密切相關(guān)[20]。目前已有報(bào)道sasX基因在小鼠皮膚膿腫、肺炎中起重要的作用[11]，本研究13株SA均不攜帶sasX基因。

綜上所述，新生兒SSTIs中，SA攜帶率較低，agrⅠ-MRSA-ST59-SCCmecⅣa-t437是MRSA最主要的流行克隆，SA分離株超抗原基因攜帶率高。

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(本文編輯：張崇凡)

Molecular and virulence characterization of methicilin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from neonates with skin and soft tissue infection

GENGWen-jing1,3,LIWen-ting2,3,YAOKai-hu2,SHENXu-zhuang2,QIYu-jie1

(1DepartmentofNeonatology,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100045；2BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity，BeijingPediatricResearchInstitute，NationalKeySubjectsofPediatrics，KeyLaboratoryofMajorDiseaseoftheMinistryofEducation,Beijing100045,China；3Co-firstauthor)

QI Yu-jie，E-mail:qiyj0805@yeah.net

AbstractObjective To investigate the molecular and virulence characterization ofStaphylococcusaureus(SA) isolated from neonates with skin and soft tissue infections(SSTIs) through one-year prospective surveillance study, and to provide the scientific evidence for prevention and control of SA infection. MethodsCases of SSTIs in neonates were prospectively collected from May 2015 to April 2016 in NICU of Beijing Children′s Hospital, the clinical data were recorded, the multilocus sequence typing(MLST) and Staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec) types were analyzed by multiplex polymerase chain reaction method, the spa type was analyzed by PCR. PCR was also used to test 23 virulence genes, including 21 superantigen genes,PVLgene andsasXgene.ResultsA total of 13 SA strains were collected, including 7 MRSA，the most common clone of MRSA was agrⅠ-ST59-SCCmecⅣ-t437. It was found that all strains contained at least two superantigen toxin genes, and 6 strains werePVLpositive.SasXwas not detected in any of the isolates. ConclusionThe carrying rate of SA from SSTIs in neonates was low, the most common clone of MRSA was agrⅠ-ST59-SCCmecⅣ-t437, the carrying rate of superantigen was high.

Methicillin-resistantStaphylococcusaureus; Skin and soft tissue infections; Virulence;Neonate

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院2016年國家級繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育項(xiàng)目

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目:81171648；北京市優(yōu)秀人才青年骨干個(gè)人資助項(xiàng)目:2014000021469g243

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院新生兒中心北京，100045；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京市兒科研究所，兒科學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科，教育部兒科重大疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京，100045；3 共同第一作者

齊宇潔，E-mail:qiyj0805@yeah.net

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.03.014

2016-05-15

2016-06-11)