慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲性的影響

李晉福，弓軍勝，梁　鋼，王　鵬，錢會(huì)利，陳志婕，張寶林

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院整形外科　山西 太原　030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科　山西 太原　030001）

·基礎(chǔ)研究·

慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲性的影響

李晉福1，弓軍勝1，梁鋼2，王鵬1，錢會(huì)利1，陳志婕1，張寶林1

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院整形外科山西 太原030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科山西 太原030001）

目的：研究過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）基因?qū)w外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts，KF）增殖、遷移、侵襲性的影響。方法：將攜帶PPAR-γ及綠色熒光蛋白的慢病毒載體（LV-PPAR-γ-GFP，KF-PPAR-γ組）及空載體（LV-GFP，KF-NC組）感染KF細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組（KF組），應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)PPAR-γmRNA及蛋白的表達(dá)；MTT法檢測(cè)KF細(xì)胞增殖情況；劃痕實(shí)驗(yàn)和Trans-well小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KF細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。結(jié)果：PPAR-γ慢病毒載體感染KF細(xì)胞96 h后，KF-PPAR-γ組PPAR-γmRNA和蛋白的表達(dá)量明顯高于KF-NC組和KF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MTT結(jié)果顯示，KF-PPAR-γ組吸光度A值明顯降低，與KF-NC組和KF組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示劃痕后24 h和48 h，KF-PPAR-γ組劃痕愈合速度明顯慢于KF-NC組（P＜0.05）；Trans-well侵襲結(jié)果顯示KF-PPAR-γ組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)目較KF-NC組明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因能夠抑制KF細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，提示靶向提高瘢痕疙瘩中PPAR-γ的含量與活性，可能為瘢痕疙瘩的防治提供有效途徑。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ；瘢痕疙瘩；成纖維細(xì)胞；增殖；遷移；侵襲

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor， PPAR）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子， 屬于核內(nèi)受體超家族成員。1990年Issemann等［1］首先發(fā)現(xiàn)了這種能被一類脂肪酸樣化合物過氧化物酶體增殖劑（peroxisome proliferators，PP） 激活， 而被命名為PP 激活受體（PPAR）。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，PPAR 可分為α、β（或δ）和γ 3種類型，其中PPAR-γ 基因與脂肪細(xì)胞分化、肥胖、胰島素抵抗、糖尿病及腫瘤等多種疾病密切相關(guān)［2］，為腫瘤研究提供了新的靶點(diǎn)。瘢痕疙瘩本質(zhì)為結(jié)締組織腫瘤，向周圍正常組織浸潤(rùn)，具有類腫瘤特性［3］。前期研究表明瘢痕疙瘩的形成可能與PPAR-γ 在組織中的低表達(dá)有關(guān)。提示采用基因療法提高瘢痕疙瘩中PPAR-γ的含量與活性，可能為瘢痕疙瘩的防治提供有效途徑。因此我們構(gòu)建了過表達(dá)PPAR-γ的慢病毒載體，感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，探討過表達(dá)PPAR-γ基因?qū)︸：鄹泶衲[瘤樣生物學(xué)特性的影響。

1　材料和方法

1.1材料：重組慢病毒LV-PPAR-γ-GFP和LV-GFP由上海吉?jiǎng)P基因生物技術(shù)有限公司合成并鑒定，在293T細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增及滴度測(cè)定。DMEM培養(yǎng)基、牛血清白蛋白BSA（10g/L，Gibco公司，美國(guó)）；Trans-well小室（聚碳酸酯膜8.0μm，Chemicon公司，美國(guó)）、MTT試劑盒。瘢痕疙瘩標(biāo)本取自山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形科門診及住院手術(shù)患者（標(biāo)本術(shù)后經(jīng)病理診斷為瘢痕疙瘩），所有患者均排除了其他器質(zhì)性疾病，在手術(shù)切除前未接受其他任何治療。在征得患者知情同意并簽訂知情同意書后，切除瘢痕組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將切取的瘢痕疙瘩標(biāo)本剪去表皮和皮下組織，切成1.0～2.0mm3的組織塊，采用組織塊貼壁法進(jìn)行瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，以含20%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2慢病毒感染KF細(xì)胞：感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為20感染KF細(xì)胞，加入Polybrene至終濃度為5mg/L；96h后，熒光顯微鏡下觀察感染效率，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PPAR-γ基因表達(dá)：利用Trizol抽提KF細(xì)胞的總RNA，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）檢測(cè)PPAR-γ mRNA的表達(dá)水平。

PPAR-γ基因的上、下游引物為：

5'-ATTCCATTCACAAGAACAGATCCAG-3'

5'-TTTATCTCCACAGACACGACATTCA-3'

管家基因GAPDH為內(nèi)參，上、下游引物為：

5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'

5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'

1.2.4Western印跡檢測(cè)PPAR-γ蛋白表達(dá)：抽提KF細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶TBST溶液封閉過夜后洗膜，分別加入相應(yīng)的一抗Mouse anti-PPAR-γ（1∶500稀釋）及Mouse anti-GAPDH（1∶5 000稀釋），再分別加入二抗Rabbit anti-mouse IgG-HRP（1∶5 000稀釋），ECL法顯色后化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影，并保存圖像。

1.2.5MTT測(cè)定細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KF細(xì)胞，將其分為感染LV-PPAR-γ-GFP慢病毒細(xì)胞組（KF-PPAR-γ組），陰性對(duì)照組即感染LV-GFP慢病毒細(xì)胞組（KF-NC組）和空白對(duì)照組即未感染慢病毒細(xì)胞組（KF組）。以1×104個(gè)/孔接種于96孔板培養(yǎng)，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每孔100μl。按MOI為20感染細(xì)胞，于不同時(shí)間點(diǎn)每孔加入MTT溶液，孵育4 h后離心棄上清，另加入二甲基亞砜（DMSO）振蕩數(shù)分鐘，選擇吸光度490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的吸光度A值，并記錄結(jié)果。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞以5×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中，待形成細(xì)胞單層時(shí)，用200μl的槍頭在6孔板內(nèi)均勻劃直線，更換含1%PBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野（×40），測(cè)量劃痕寬度，比較各組劃痕愈合的情況。

1.2.7Trans-well侵襲實(shí)驗(yàn)：采用24孔Trans-well（8.0μm濾膜微孔）系統(tǒng)。小室內(nèi)加入40μl基質(zhì)膠（Matrigel），1∶3稀釋，用含0.5%BSA的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/L，取200μl細(xì)胞懸液加入小室內(nèi)，下室加入1 000μl含10%FBS的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24h。用棉簽擦去小室上面細(xì)胞，固定，HE染色。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析比組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1重組慢病毒的感染效率：慢病毒以MOI為20感染KF細(xì)胞96 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，結(jié)果顯示：PPAR-γ慢病毒感染KF細(xì)胞達(dá)到90%以上感染效率，符合基因治療對(duì)載體的要求（圖1）。

圖1　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞：A、B-陽性轉(zhuǎn)染組200倍（KF-PPAR-γ組）；C、D-陰性轉(zhuǎn)染組200倍（KF-NC組）

圖2　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞PPAR-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖3　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞后PPAR-γ 蛋白的表達(dá)

圖4　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞后各組PPAR-γ蛋白的表達(dá)比較

2.2重組慢病毒感染KF細(xì)胞后PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)：慢病毒以MOI為20感染KF細(xì)胞96 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：KF-PPAR-γ組PPAR-γ mRNA表達(dá)量明顯高于KF-NC組和KF組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05，圖2）。Western blot結(jié)果表明：KF-PPAR-γ組PPAR-γ蛋白的水平顯著高于KF-NC組和KF組（P＜0.05，圖3、4）。PPAR-γ mRNA和蛋白的表達(dá)量，KF-NC組與KF組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：在MOI為20時(shí)，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞感染LV-PPAR-γ-GFP后48h出現(xiàn)差異，KF組與KF-NC組比較，吸光度A值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；KFPPAR-γ組吸光度A值明顯降低，與KF-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示PPAR-γ可抑制KF細(xì)胞增殖（表1、圖5）。

表1　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞后各組的增殖情況

圖5　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞后各組的增殖情況比較

圖6　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞48h后各組的遷移情況

2.4重組慢病毒感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變：劃痕實(shí)驗(yàn)（圖6、7）結(jié)果顯示劃痕后24h和48h，KF-PPAR-γ組劃痕愈合速度明顯慢于KF-NC組（P＜0.05）。Trans-well侵襲（圖8、9）結(jié)果顯示KF-PPAR-γ組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)目較KF-NC組明顯減少（P＜0.05）。上述兩組實(shí)驗(yàn)KF-NC組與KF組相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖7　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞48h后各組的遷移率比較

圖8　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞24h后各組的侵襲情況

圖9　慢病毒介導(dǎo)PPAR-γ基因感染KF細(xì)胞48h后各組的侵襲率比較

3　討論

人類的PPAR-γ基因位于染色體3p25，全長(zhǎng)大于105kb，含有9個(gè)外顯子。由于啟動(dòng)子和拼接方式不同PPAR-γ mRNA存在1、2、3、4四種異構(gòu)體。這4種異構(gòu)體的基因基本相同，均包括外顯子1-6。PPAR-γ1、PPAR-γ3、PPAR-γ4 mRNA生成相同的基因產(chǎn)物PPAR-γ。PPAR-γ2 mRNA生成一個(gè)在NH2端有28個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。4種異構(gòu)體在不同組織中表達(dá)不完全相同。PPAR-γ1在所有組織中均有不同程度表達(dá)［4］，PPAR-γ2主要在脂肪組織表達(dá)［5］。PPAR-γ3在脂肪組織、巨噬細(xì)胞和結(jié)腸卜皮細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞中表達(dá)［6-7］。PPAR-γ4的表達(dá)尚不清楚［4］。

研究表明，PPAR-γ基因與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在抑制腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移方面具有重要作用［8］。然而，關(guān)于PPAR-γ基因與腫瘤關(guān)系的研究主要集中在消化系統(tǒng)腫瘤（胃癌、結(jié)直腸癌等）、前列腺癌、乳腺癌、肺癌及子宮內(nèi)膜癌等［9-12］，在瘢痕疙瘩中的研究較少。陜光等［13］采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)50例膀胱尿路上皮癌和50例癌旁組織中PPAR-γ的表達(dá)，結(jié)果提示：①PPAR-γ在膀胱尿路上皮癌的發(fā)病和進(jìn)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用；②PPAR-γ蛋白表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌腫瘤分化程度及病理類型、原發(fā)腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期均相關(guān)，提示PPAR-γ在膀胱尿路上皮癌的增殖、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。李強(qiáng)等［14］采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)113例胃癌組織中PPAR-γ表達(dá)，提示癌組織中PPAR-γ表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類型、TNM分期密切相關(guān)，PPAR-γ可作為胃癌預(yù)后的判斷指標(biāo)。劉江惠等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌中PPAR-γ表達(dá)與細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P均＜0.05）。馬元華等［16］對(duì)大腸癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ表達(dá)與腫瘤分化程度、Dukes分期密切相關(guān)（P均＜0.05）。楊靖宇［17］通過構(gòu)建siRNA沉默PPAR-γ的A549細(xì)胞系，探討PPAR-γ表達(dá)下調(diào)對(duì)人肺癌A549順鉑耐受性和細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果提示抑制A549中PPAR-γ的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞獲得對(duì)順鉑藥物更高的耐受性，其機(jī)制與升高Akt磷酸化水平和bcl-2表達(dá)水平，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，PPAR-γ下調(diào)是臨床腫瘤產(chǎn)生耐藥性的可能機(jī)制之一。PPAR-γ活化后通過上調(diào)某些基因促使肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞周期停滯。Okumura［18］認(rèn)為噻唑烷二酮類可通過激活PPAR-γ，上調(diào)基因p27進(jìn)而促使HCC細(xì)胞周期停滯。Koga等［19］的研究表明曲格列酮可使HCC細(xì)胞停滯于G0-G1期，且與p21、p27和p18基因的上調(diào)密切相關(guān)。曲格列酮誘導(dǎo)的p27上調(diào)與skp2下調(diào)相關(guān)，當(dāng)skp2過表達(dá)時(shí)，曲格列酮幾乎不能使HCC細(xì)胞周期停滯。Cheung等［20］在分子水平發(fā)現(xiàn)PPAR-γ攻擊的羧基末端結(jié)構(gòu)-2與p21、p27上調(diào)有關(guān)。上述結(jié)果［18-20］提示，激活的PPAR-γ作用于羧基末端結(jié)構(gòu)-2后，再通過p27或p21/skp2途徑使HCC細(xì)胞周期停滯于G0-G1期，為HCC的基因治療提供作用靶點(diǎn)。侯新新等［21］通過調(diào)控PPAR-γ基因在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)，證實(shí)上調(diào)PPAR-γ基因的表達(dá)可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移、侵襲及增殖，而下調(diào)PPAR-γ基因的表達(dá)可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移、侵襲及增殖。說明PPAR-γ基因在子宮內(nèi)膜癌中可能發(fā)揮抑癌作用，而PPAR-γ基因的表達(dá)缺失可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。

瘢痕疙瘩為皮膚軟組織損傷后非正常愈合過程中形成的真皮纖維組織腫瘤，呈持續(xù)性、漸進(jìn)性向周邊正常皮膚侵襲性生長(zhǎng)，破壞周圍正常皮膚附屬器，無自限傾向，具有類腫瘤特性［3］。我們前期通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，PPAR-γ在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中呈低表達(dá)，提示激活或者過表達(dá)PPAR-γ基因可能是抑制瘢痕疙瘩的潛在靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PPAR-γ對(duì)瘢痕疙瘩增殖的作用，以及對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞類腫瘤樣生物學(xué)作用的影響，構(gòu)建了針對(duì)PPAR-γ基因的慢病毒表達(dá)載體，以探討慢病毒介導(dǎo)的PPAR-γ對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，結(jié)果表明LV-PPAR-γ-GFP感染KF細(xì)胞后，PPAR-γ mRNA和蛋白的表達(dá)增高，繼而有效地抑制KF細(xì)胞的增殖。LV-PPAR-γ-GFP感染KF細(xì)胞后通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Trans-well實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PPAR-γ基因能夠抑制KF細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示PPAR-γ參與了KF細(xì)胞的遷移和侵襲生長(zhǎng)過程。Mansure等［22］和Jiang等［23］研究顯示，PPAR-γ基因被激活后，對(duì)腫瘤細(xì)胞起到抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制侵襲轉(zhuǎn)移的作用，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，PPAR-γ基因可以抑制KF細(xì)胞增殖、遷移和侵襲性生長(zhǎng)，為進(jìn)一步靶向治療瘢痕疙瘩提供了新的理論基礎(chǔ)。然而，PPAR-γ在瘢痕疙瘩形成中的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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編輯/張惠娟

Effect of lentivirus-mediated PPAR-γ gene on proliferation，migration and invasion of keloid fbroblasts

LI Jin-fu1，GONG Jun-sheng1，LIANG Gang2，WANG Peng1，QIAN Hui-li1，
CHEN Zhi-jie1， ZHANG Bao-lin1
（1.Department of Plastic Surgery，The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001， Shanxi，China； 2.Department of Pathology， The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001， Shanxi，China）

ObjectiveTo investigate the effect of PPAR-γ gene on proliferation，migration and invasion activity of human keloid fibroblasts（KFs）.MethodsPPAR-γ gene was cloned into lentivirus vector，then the lentivirus particles expressing PPAR-γ were infected into KF cells. Real-time PCR and Western blot were performed to examine the expression of PPAR-γ in lentivirus infected cells. The growth ability was detected by MTT assay.The invasion and migration were detected by matrigel invasion assay and wound healing assay.ResultsComparing to controls group and KF-NC group， the expression levels of PPAR-γ mRNA and protein were both signifcantly up-regulated after 96 hours of PPAR-γ lentivims infection. Comparing with the KF-NC group and KF group，MTT assay showed that the A490 of KF-PPAR-γ group was down-regulated after lentivims infection（P＜0.05）. Transfection of PPAR-γ lentivirus inhibited the migration and invasion activity of KF cells（P＜0.05）. ConclusionLentivirus-mediated PPAR-γ gene effciently inhibits proliferation，migration and invasion activity of KF cells. It suggests that improve the content and activity of PPAR-γ in keloid， which may provide an effective way for the prevention and treatment of the keloid.

peroxisome proliferator activated receptor-γ； keloid； fbroblasts；proliferation； migration；invasion

R619+.6

A

1008-6455（2016）07-0042-05

山西省科技發(fā)展計(jì)劃＜社會(huì)發(fā)展＞基金（20110313011-7）；山西省衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)基金，2014032；山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院院基金（YC1415）

張寶林，男，科主任、教授、主任醫(yī)師；中華醫(yī)學(xué)會(huì)整形分會(huì)全國(guó)委員、山西省醫(yī)師協(xié)會(huì)整形美容協(xié)會(huì)主委；通聯(lián)：山西省太原市解放南路85號(hào)，郵編：030001

2016-03-23

2016-05-30