液液萃取結(jié)合分散固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測食品包裝紙中的4-氨基偶氮苯

楊　飛,孫瑩瑩,李中皓, 邊照陽,唐綱嶺, 王　穎, 劉珊珊,鄧慧敏, 范子彥, 張艷革

(國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心, 河南 鄭州　450001)

?

研究報告(074～079)

液液萃取結(jié)合分散固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測食品包裝紙中的4-氨基偶氮苯

楊飛,孫瑩瑩,李中皓, 邊照陽,唐綱嶺, 王穎, 劉珊珊,鄧慧敏, 范子彥, 張艷革

(國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心, 河南 鄭州450001)

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)快速測定食品包裝紙中偶氮染料釋放的4-氨基偶氮苯. 試樣在0.5 mol/L氫氧化鈉溶液的堿性環(huán)境下，用連二亞硫酸鈉還原試樣中的偶氮染料，用甲基叔丁基醚反萃取還原裂解產(chǎn)生的4-氨基偶氮苯，經(jīng)氮吹、甲醇復(fù)溶后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行測定，內(nèi)標法定量. 方法優(yōu)化了色譜分離、質(zhì)譜、液液萃取和分散固相萃取等條件. 最優(yōu)化條件下方法的檢出限為0.13 mg/kg, 定量限為0.42 mg/kg，加標回收率在90%～95%之間(添加水平分別為1、 10、 30 mg/kg)，相對標準偏差小于5%.

4-氨基偶氮苯；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；液液萃取；分散固相萃??；包裝紙

食品接觸材料在生產(chǎn)加工過程中，為改良其性能，常需加入大量的添加劑. 著色劑可以賦予和改變食品接觸材料的顏色，起到美化和裝飾的作用. 但是倘若著色劑使用不當，或者使用劣質(zhì)的著色劑則有可能給消費者的健康安全造成隱患. 歐盟議會和理事會(EC)No 1935/2004法規(guī)其通用要求中提到：任何擬與食品直接或間接接觸的材料和制品必須足夠穩(wěn)定，以免引起其向食品遷移的物質(zhì)量大到足以危害人類健康，或?qū)е率称烦煞职l(fā)生不可接受的變化，或引起食品感官特性的劣變. 歐盟法規(guī)最新公布的(EU)No.10/201l對總遷移量和特定物質(zhì)遷移量分別給出了限量要求. 該法規(guī)在附件2明確規(guī)定在塑料材料和制品中初級芳香胺的遷移量不得超過0.0l mg/kg[1]. 而初級芳香胺的重要來源之一就是塑料原料中使用的含有偶氮染料的著色劑，在一定條件下發(fā)生分解而形成[2-3]. 偶氮染料常用于皮革、紙張、木材、麥稈、羽毛等的染色以及油漆、油墨、塑料、食品等的著色. 部分偶氮染料與人體的代謝產(chǎn)物(如汗液等)作用會產(chǎn)生對人體有致癌作用的初級芳香胺，這類偶氮染料稱之為禁用偶氮染料[4]. 目前國際上明令禁止使用的芳香胺有24種，4-氨基偶氮苯(4-amino azo benzene)是其中的一種. 判斷樣品中是否使用了會釋放出4-氨基偶氮苯的偶氮染料，需要在堿性條件下進行還原反應(yīng)，通過檢測還原液中是否含有4-氨基偶氮苯進行判斷[7-11].

分散固相萃取法操作簡單、快速、穩(wěn)定，已廣泛應(yīng)運于農(nóng)藥、塑化劑、獸藥等的檢測[12-17]. 目前采用分散固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定芳香胺尚未見報道. 本文采用液液萃取結(jié)合分散固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了食品包裝紙中的4-氨基偶氮苯. 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MS/MS)具有多離子反應(yīng)監(jiān)測(multiplereaction monitoring，MRM)功能，特征母離子或特征母離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的特征子離子可作為某一目標化合物定量的質(zhì)譜指紋，可有效去除基體雜質(zhì)干擾，相對于高效液相色譜(HPLC-DAD)法和單級質(zhì)譜(GC-MS或LC-MS)法，是一種靈敏度更高、選擇性更好、特異性更強的方法. 本研究中，我們將樣品還原分解后，使用叔丁基甲醚對還原液進行液液萃取，然后用C18柱進行分散固相萃取凈化，最大限度的減少雜質(zhì)對目標物干擾，與固相萃取相比，提高了偶氮染料的檢測速度. 本方法操作步驟比固相萃取法簡單，在取得滿意回收率和去除雜質(zhì)的同時，有利于樣品中芳香胺的檢測.

1　試驗部分

1.1儀器與試劑

API 4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國ABI公司)，配備電噴霧電離源(ESI)；1200系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配ZORBAX C18柱(Φ5 μm,250 mm×2.1 mm, 美國Agilent公司)；離心機(Sigma 3-30K，德國Sigma公司)；渦旋振蕩儀(VX200，美國Labnet公司)；恒溫水浴鍋(HH-8，江蘇金壇)；氮吹濃縮儀(TurboVap, 美國caliper).

4-氨基偶氮苯和D9-4-氨基聯(lián)苯(純度均大于98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer)；甲基叔丁基醚、甲醇、醋酸(色譜純，美國TEDIA公司)；水為超純水(美國 Milipore 公司)；無水硫酸鈉、氫氧化鈉(AR). 30個食品包裝紙樣品(包括卡紙10個、銅版紙10個、真空鋁紙10個)購買于市場.

1.2內(nèi)標溶液的配置

準確稱取10 mgD9-4-氨基聯(lián)苯，精確至0.1 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標儲備溶液. 移取內(nèi)標儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的內(nèi)標溶液，備用.

1.3標準工作溶液配置

稱取10 mg 4-氨基偶氮苯，精確至0.1 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的一級標準儲備溶液. 移取標準儲備液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的二級標準儲備溶液.

根據(jù)樣品實際含量配制合適濃度的系列標準工作溶液，推薦如下配制方法：分別準確移取0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL二級標準儲備溶液于6個10 mL 棕色容量瓶中，加入50 μL內(nèi)標溶液，用甲醇定容，即得系列標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用. 配制的系列標準工作溶液質(zhì)量濃度為20、50、100、200、500、1 000 ng/mL.

1.4LC-MS/MS檢測條件

色譜柱：ZORBAX C18柱(柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm ，固定相粒徑5 μm)；流動相：甲醇(A)和0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～2 min, 10%～60% A; 2～5 min, 60%～90% A; 5～10 min, 90% A; 10～11 min, 90%～10% A; 11～15 min, 10% A；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL.

質(zhì)譜掃描方式：正離子掃描；電噴霧離子源(ESI)；霧化氣流量：0.41 MPa; 氣簾氣流量：0.07 MPa; 輔助加熱氣流量：0.41 MPa; 離子化溫度：500 ℃; 碰撞氣流量：0.07 MPa; 4種氣體均為氮氣; 停留時間：30 ms; 電離電壓：5 500 V, 正離子MRM模式采集，MRM參數(shù)如表1所列.

表1　質(zhì)譜參數(shù)

* 定量離子對.

1.5樣品的提取和凈化

1.5.1還原反應(yīng)[7]

稱取0.5 g樣品，精確至0.1 mg，置于50 mL具塞離心管中，加入15.0 mL氫氧化鈉溶液、1.0 mL連二亞硫酸鈉水溶液. 加塞振搖使液體混勻且浸透樣品，于(40±2)℃水浴中放置 30 min 后，將離心管置于冰水浴中，于2 min內(nèi)冷卻至室溫.

1.5.2萃取

在冷卻后的離心管中分別加入50 μL內(nèi)標溶液、10 mL甲基叔丁基醚和適量的無水硫酸鈉，以2 000 r/min渦旋振蕩5 min，然后以8 000 r/min離心3 min，將上層有機相全部轉(zhuǎn)移至25 mL儲液管中. 在離心管中再次加入10 mL甲基叔丁基醚，渦旋振蕩5 min，離心3 min，取出上層有機相，并與第一次有機相合并. 混合液充分混勻后，取10 mL上層有機相于15 mL離心管中，加入50 mgN-丙基乙二胺(PSA)和150 mg Na2SO4，渦旋振蕩2 min. 過濾后，取2 mL的濾液，氮吹至盡干. 用1 mL的甲醇復(fù)溶，進LC-MS/MS分析.

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜檢測條件優(yōu)化是為了保證被測離子能夠具有較好地靈敏度和穩(wěn)定性. 注入1.0 μg/mL 的標準溶液，經(jīng)過單極質(zhì)譜全掃描方式發(fā)現(xiàn)4-氨基偶氮苯和內(nèi)標溶液在甲醇/水、乙腈/水等流動相中主要形成[M+H]+的母離子. 為了獲得最佳的定性定量質(zhì)譜參數(shù)，本試驗采用儀器自帶的優(yōu)化軟件Optimizer 對碎裂電壓、碰撞能量、MRM離子對進行優(yōu)化，得到的最佳MRM采集參數(shù)如表1所列.

2.2萃取溶劑及萃取方式選擇

芳香胺的萃取溶劑一般為甲基叔丁基醚、乙醚、正己烷等. 正己烷回收率明顯低于乙醚和甲基叔丁基醚. 乙醚與甲基叔丁基醚回收率結(jié)果相近，3種紙張中4-氨基偶氮苯的檢測平均回收率在80%～95%之間，但是乙醚中含有過氧化物成分，使用前必須除去過氧化物，操作耗時費力，而且由于乙醚易燃，試驗中存在一定的安全隱患，因此本方法選用叔丁基甲醚作為提取溶劑.

2.3提取次數(shù)的選擇

通常萃取過程一般需多次提取，以保證得到較高的回收率. 通過對大量實際樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，其中4-氨基偶氮苯的質(zhì)量分數(shù)一般在20 mg/kg以下，本試驗中樣品添加水平為30 mg/kg. 以甲基叔丁基醚為萃取劑，比較了一次提取、二次提取和三次提取的回收率，結(jié)果顯示，一次提取平均回收率達到75%左右，二次提取以后平均回收率達到90%，三次提取平均回收率沒有明顯的變化. 因此本試驗選擇二次提取法.

2.4提取方式的選擇

振蕩提取是液-液萃取分析中的重要環(huán)節(jié). 試驗采用3種振蕩方式，即手搖2 min、渦旋振蕩5 min和10 min，比較了這3種震蕩方式對回收率的影響. 結(jié)果顯示，手搖2 min的回收率略低. 為了盡量在不影響回收率的前提下提高檢測效率，本方法采用渦旋振蕩5 min的振蕩方式.

2.5鹽析試劑的選擇

液-液萃取分析中，兩相分別為水相和有機相. 但是有機溶劑和水不是絕對的不互溶，叔丁基甲醚會有微量的分散在水相，加入少量的鹽可以促進兩相的分離. 本試驗分別考察了NaCl、Na2SO4和MgSO4對萃取效率的影響，結(jié)果如圖1所示. 由圖1可以看出，Na2SO4效果最好，NaCl次之， MgSO4回收率最低. MgSO4與水反應(yīng)放熱，溫度過高導(dǎo)致部分目標損失，從而回收率偏低，Na2SO4不僅可以起到鹽析的作用，而且可以與水結(jié)合降低水含量. 因此本文選擇Na2SO4作為鹽析試劑.

2.6固相分散萃取劑的影響

液液萃取以后，萃取液中可能含有大量的雜質(zhì)，比如油墨、色素等. 這些雜質(zhì)不僅污染儀器，也給目標物的定性帶來干擾. 為降低基質(zhì)效應(yīng)，減少基質(zhì)干擾，提高方法的靈敏度，分別使用50 mg PSA+150 mg無水Na2SO4、50 mg C18+150 mg無水Na2SO4和50 mg石墨化炭黑+150 mg無水Na2SO4，對添加有4-氨基偶氮苯，其質(zhì)量分數(shù)為30 mg/kg的樣品進行優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見，石墨化炭黑回收率最低，原因可能是石墨化炭黑對4-氨基偶氮苯有一定吸附作用；50 mg C18+150 mg無水Na2SO4效果最好，4-氨基偶氮苯在3種紙張中的平均回收率達到90%. 因此，本試驗選用了50 mg C18+150 mg無水Na2SO4作為分散固相萃取劑.

2.7回歸方程及檢測限

分別移取一定量的混合標準溶液，按照給定的方法進行操作，制備至少6個標準工作溶液，其濃度范圍應(yīng)覆蓋預(yù)計檢測到的樣品含量. 對混合標準工作溶液進行色譜分析，即可得到標準曲線. 標準溶液的色譜圖如圖3所示.

首先以目標物和對應(yīng)內(nèi)標的色譜峰面積比對其相應(yīng)濃度進行回歸分析，得到標準曲線及其回歸方程，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8.取最低濃度標準工作溶液，做10次平行試驗，計算標準偏差，以最低濃度樣品信號的3倍標準偏差所對應(yīng)的濃度為檢出限，檢出限為0.13 mg/kg，10倍標準偏差所對應(yīng)的濃度為定量限，定量限為0.42 mg/kg，結(jié)果如表2所列 .

表2　方法線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.8重復(fù)性和回收率

分別在不同空白紙張樣品中加入3個不同質(zhì)量分數(shù)(1、10、30 mg/kg)的標準工作溶液，每個樣品分別測定5次，根據(jù)分析結(jié)果計算本方法的加標回收率及加標后測定值的相對標準偏差，結(jié)果如表3所列.

表3　方法重復(fù)性和回收率

2.9包裝紙實際樣品的測定

為了驗證本方法的可行性，采用本方法優(yōu)化后的條件對市售的30個樣品進行了檢測，個別樣品檢出4-氨基偶氮苯，檢測結(jié)果如表4所列. 表4還列出了采用國標GB/T23344—2009方法[7]測定的結(jié)果，兩種方法所得結(jié)果的相對標準偏差小于10%，表明本方法與國標方法沒有顯著性的差異.

表4　實際樣品中4-氨基偶氮苯的質(zhì)量分數(shù)

3　結(jié)論

針對目前國內(nèi)外相關(guān)法律法規(guī)的限制要求以及我國包裝紙的現(xiàn)狀，建立了食品包裝紙張中偶氮染料釋放的4-氨基偶氮苯的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)分析方法. 目標物線性關(guān)系良好(R2>0.99)，在3種質(zhì)量分數(shù)(1、10和30 mg/kg)的加標水平下，平均回收率大于90%，相對標準偏差小于5%. 方法的樣品前處理過程簡單，易操作，適用于煙用紙張中可釋放出4-氨基偶氮苯的日常檢測.

[1]歐盟委員會. Commission Regulation (EU) No 10/2011[S].

[2]Yamjala K, Nainar MS, Ramisetti NR. Methods for the analysis of azo dyes employed in food industry - A review[J]. Food Chemistry, 2016, 192: 813-824.

[3]Yang L, Wang Y W, Lou C Y, et al. Determination of aromatic amines from textiles using dispersive liquid-liquid microextraction[J]. Journal of Separation Science, 2013, 36: 947.

[4]李英，張焱，荊瑞俊，等.氣相色譜-質(zhì)譜法測定紡織品中的芳香胺化合物[J]. 印染,2006, 3:40-42．

[5]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會. GB/T17592—2011《紡織品 禁用偶氮染料的測定》[s].

[6]國際標準化組織.ISO 17234: 2010 《皮革-化學測試-皮革中某些偶氮染料的測定》[s].

[7]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會. GB/T23344—2009《紡織品 4—氨基偶氮苯的測定》[s].

[8]歐洲標準化委員會. BS EN 14362-2：2012．Textiles-Methods for determination of certain aromatic amines derived from azo colorants-part l：Detection of the use of certain azo colorants accessible with and without extracting the fibres[S].

[9]張建揚，洪鋼林，盧獻雷．紡織品中4-氨基偶氮苯的來源、性質(zhì)及檢測技術(shù)現(xiàn)狀[J]．中國纖檢，2008,01: 46-48.

[10]季浩，樸克壯，劉春成．氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定染料中的4-氨基偶氮苯[J]．染料與染色, 2010,4: 54-57.

[11]丁友超,張國娟,曹錫忠,等. 紡織品中4-氨基偶氮苯檢測能力驗證結(jié)果分析[J].紡織導(dǎo)報,2013,2: 85-87.

[12]劉宏程，李寧， 林濤 ，等 . 基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定牛奶中9種類固醇激素殘留[J].色譜，2015,11:1163-1168.

[13]趙鵬，施家威， 李繼革，等. 基質(zhì)固相分散-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定孕婦血清中22種持久性有機污染物[J].分析化學，2015,5: 651-657.

[14]馬微,程麗,張?zhí)m威,等.基質(zhì)分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定減肥保健食品中20種違禁添加藥物[J].分析化學，2014,8:1161-1170.

[15]李婷，湯智，洪武興. 分散固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定含油脂食品中17種鄰苯二甲酸酯[J].分析化學，2012,3 :391-396.

[16]林濤,樊建麟,劉興勇,等.分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋和雞肉中金剛烷胺和金剛乙胺殘留[J].色譜，2015,11:1169-1174.

[17]王東，侯傳金，趙爾成，等.鹽析輔助均相液液萃取/分散固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中新煙堿類農(nóng)藥殘留[J].分析測試學報，2015,6:681-685.

Determination of 4-Aminoazobenzene in Paper Packaging by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Combining with Liquid-Liquid Extraction and Dispersive Solid-Phase Extraction

YANG Fei, SUN Ying-ying, LI Zhong-hao, BIAN Zhao-yang, TANG Gang-ling, WANG Ying,LIU Shan-shan, DENG Hui-min, FAN Zi-yan, ZHANG Yan-ge

(ChinaNationalTobaccoQualitySupervision&TestCenter,Zhengzhou450001,China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometric(LC-MS/MS), method for the quick detection of 4-Aminoazobenzene released from azo dyes in food wrappers, has been established. Sodium dithionite was added to sodium hydroxide solution to reduce and decompose the possible azo dyes. The extract was analyzed by liquid chromatography with tandem mass chromatography for the quantification and confirmation after a liquid-liquid extraction and dispersive solid-phase extraction. The chromatographic separations were performed on a ZORBAX Eclipse XDB-C18 column with gradient elution. In this method the conditions of chromatographic separation, mass spectrum, liquid-liquid extraction and dispersive solid-phase extraction were optimized. The detection limit was 0.13 mg/kg and the quantification limit was 0.42 mg/kg under optimal conditions, the spiking standard recoveries were ranged from 90%～95% with relative standard deviations (RSDs) ≤5%.

4-Aminoazobenzene;HPLC-MS/MS;dispersive solid-phase extraction;liquid-liquid extraction;paper packaging

2016-01-25;

2016-04-06.

國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心科技創(chuàng)新項目(562015CA0090)

楊飛(1985-)，碩士，工程師，主要從事煙草化學檢驗研究,E-mail：yangfei0797@163.com

唐綱嶺，E-mail：tglcttc@163.com.

O657.32

A

1006-3757(2016)02-0074-06

10.16495/j.1006-3757.2016.02.003