Dectin-1受體、白細(xì)胞介素-17及白細(xì)胞介素-12在小鼠巨噬細(xì)胞活化后真菌性角膜炎中的表達(dá)

董騁寰， 鄭曉倩， 徐國(guó)興

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Dectin-1受體、白細(xì)胞介素-17及白細(xì)胞介素-12在小鼠巨噬細(xì)胞活化后真菌性角膜炎中的表達(dá)

董騁寰， 鄭曉倩， 徐國(guó)興

目的檢測(cè)小鼠活化巨噬細(xì)胞真菌性角膜炎中的人樹突狀細(xì)胞源性C型凝集素樣受體-1(Dectin-1)受體、白細(xì)胞介素-17(IL-17)及白細(xì)胞介素-12(IL-12)的表達(dá)水平。方法分別向小鼠角膜創(chuàng)口內(nèi)注入乳膠微粒液或PBS液構(gòu)成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。于感染后第1,3,5,7,9 d，裂隙燈顯微鏡下觀測(cè)各組小鼠真菌性角膜炎特點(diǎn)，H-E染色觀測(cè)其病理特征；通過(guò)Realtime-PCR檢測(cè)小鼠角膜中Dectin-1受體、IL-17及IL-12基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)組角膜浸潤(rùn)混濁，于第7天多發(fā)穿孔，未發(fā)現(xiàn)新生血管；對(duì)照組角膜混濁，于第5天廣泛分布新生血管，未發(fā)現(xiàn)穿孔。(2)實(shí)驗(yàn)組角膜大量炎癥細(xì)胞匯集，第5天基質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，破壞嚴(yán)重。(3)Realtime-PCR結(jié)果表明感染后第3,5,7,9 d，實(shí)驗(yàn)組Dectin-1受體、IL-17、IL-12基因mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論Dectin-1受體、Th1及Th17細(xì)胞免疫可能在角膜抵御真菌感染的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

角膜炎； 眼感染，真菌性； 巨噬細(xì)胞； 凝集素類； Th1細(xì)胞/免疫學(xué)； T淋巴細(xì)胞； 白細(xì)胞介素類

真菌性角膜炎是一種影響廣泛、易導(dǎo)致失明的眼表疾病。正常角膜中不存在巨噬細(xì)胞。當(dāng)感染真菌時(shí)，巨噬細(xì)胞上的人樹突狀細(xì)胞源性C型凝集素樣受體-1(Dectin-1)受體通過(guò)識(shí)別真菌表面的β-(1,3)-葡聚糖，激活巨噬細(xì)胞向病變組織浸潤(rùn)聚集并驅(qū)動(dòng)Th1及Th17細(xì)胞應(yīng)答。Dectin-1受體、Th1及Th17細(xì)胞應(yīng)答參與機(jī)體清除真菌感染，但在真菌性角膜炎中的機(jī)制尚不明確。

本研究通過(guò)模擬小鼠巨噬細(xì)胞活化后真菌性角膜炎，觀測(cè)小鼠真菌性角膜炎的臨床、病理特征及各階段Dectin-1受體、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及白細(xì)胞介素-12(interleukin-12,IL-12)的表達(dá)情況，研究Dectin-1受體、IL-17、IL-12在真菌性角膜炎中發(fā)揮的作用。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物5～6周已排除全身疾病的清潔級(jí)Balb/c小鼠100只[許可證編號(hào)：SCXK(滬)2007-0005]，體質(zhì)量19～20 g，不限雌雄，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各50只；30只已排除全身疾病的Sprague-Dawley(SD)大鼠(角膜植片用)[許可證編號(hào)：SCXK(滬)2007-0005]，體質(zhì)量200～250 g。

1.2方法

1.2.1菌株標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮刀菌(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)：3.2889)，28 ℃于下Sabouroud培養(yǎng)基內(nèi)培育7 d后，采用無(wú)菌PBS液稀釋菌液至濃度1×106CFU/mL。

1.2.2建立活化巨噬細(xì)胞后真菌性角膜炎模型眼科常規(guī)消毒麻醉后，于小鼠角膜表面刮出長(zhǎng)約1 mm、深達(dá)淺基質(zhì)層的創(chuàng)口。實(shí)驗(yàn)組向創(chuàng)口內(nèi)注入乳膠微粒液8 μL，對(duì)照組注入PBS液8 μL，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組一致。繼續(xù)飼養(yǎng)1周后，依據(jù)表層鏡法，用圓刀片刮除各組角膜上皮(直徑約1.5 mm)，覆蓋直徑約2 mm大鼠角膜植片，植片與角膜層間注入10 μL真菌液，縫合瞼緣，再注入真菌液5 μL，術(shù)后結(jié)膜囊涂氧氟沙星眼膏預(yù)防其他感染，于24 h后拆除植片[1]。

1.2.3真菌性角膜炎模型的鑒定小鼠縫線拆除后，模型成活100只，隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組小鼠，刮取潰瘍病灶，行真菌培養(yǎng)并鑒定菌種，同時(shí)排除細(xì)菌性角膜炎。

1.2.4角膜炎形態(tài)觀察病原感染后第1,3,5,7,9 d，裂隙燈顯微鏡下觀測(cè)各組角膜炎的面積大小、密度、表面的規(guī)則度，參考HU的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床評(píng)分，3個(gè)指標(biāo)的所得分?jǐn)?shù)相加即為總分。正常的角膜記0分，角膜輕度感染記1～4分，角膜中度感染記5～8分，角膜重度感染記9～12分[1]。

1.2.5實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)于感染后第1,3,5,7,9天，角膜組織切片行H-E染色組織病理學(xué)檢測(cè)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)F4/80細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)、Realtime-PCR檢測(cè)Dectin-1受體、IL-17、IL-12基因mRNA的表達(dá)，PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1　小鼠PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度

Dectin-1受體:人樹突狀細(xì)胞源性C型凝集素樣受體-1； IL-17：白細(xì)胞介素-17； IL-12：白細(xì)胞介素-12.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，組內(nèi)及組間的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1真菌性角膜炎形態(tài)觀察及炎癥評(píng)分感染后第1天實(shí)驗(yàn)組角膜中央輕度水腫；第3天角膜輕度隆起水腫伴霧狀混濁；第5天角膜明顯苔蘚樣混濁，直徑約1 mm，角膜表面凹凸不平，周圍伴有混濁環(huán)形浸潤(rùn)；第7天角膜中央潰瘍、明顯有水腫，伴壞死病灶或穿孔；第9天浸潤(rùn)混濁多發(fā)穿孔，未見(jiàn)新生血管。對(duì)照組第1天角膜輕度水腫，第3及5天角膜白色混濁；第7及9天角膜中央輕度水腫伴灰白色混濁，新生血管廣泛分布，角膜未出現(xiàn)壞死穿孔，各組巨噬細(xì)胞活化后小鼠真菌性角膜炎癥評(píng)分見(jiàn)表2。

表2　巨噬細(xì)胞活化后小鼠真菌性角膜炎實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組臨床評(píng)分

2.2活化的巨噬細(xì)胞分布小鼠F4/80細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞的特異性單克隆抗體，若小鼠角膜上無(wú)單核巨噬細(xì)胞分布，則角膜無(wú)陽(yáng)性F4/80細(xì)胞。小鼠真菌性角膜炎感染后各時(shí)間點(diǎn)角膜及前房可見(jiàn)大量陽(yáng)性F4/80細(xì)胞分布。

2.3H-E染色結(jié)果感染后實(shí)驗(yàn)組第1,3,5天角膜及前房大量炎癥細(xì)胞匯集，第5天后伴發(fā)角膜基質(zhì)纖維排列紊亂；對(duì)照組第1,3,5天小鼠角膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，第5,7天炎癥細(xì)胞減輕，新生基質(zhì)纖維細(xì)胞生長(zhǎng)見(jiàn)圖1。

2.4小鼠角膜中Dectin-1受體及IL-17、IL-12基因mRNA檢測(cè)結(jié)果感染后第3,5,7天實(shí)驗(yàn)組IL-17、IL-12、Dectin-1受體表達(dá)量不斷上調(diào)，且實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；感染后第3,5天IL-17的表達(dá)高于IL-12(P<0.05)，于第7天達(dá)到頂峰；IL-12、Dectin-1受體的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，于第9天達(dá)頂峰(表3)。

表3Dectin-1受體、白細(xì)胞介素-17及白細(xì)胞介素-12基因mRNA水平

Tab 3mRNA level of Dectin-1 receptor, IL-17 and IL-12 genes

n=6. Dectin-1受體：樹突狀細(xì)胞相關(guān)性C型凝集素-1受體； IL-17：白細(xì)胞介素-17；IL-12：白細(xì)胞介素-12. 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組指標(biāo)各截點(diǎn)比較，#：P<0.05.

3　討　論

小鼠角膜Dectin-1受體是主要的模式識(shí)別受體(pathogen recognition receptors,PRRs)之一，分布于單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞上，能夠識(shí)別煙曲霉病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patten,PAMP)即β(1,3)-葡聚糖，參與對(duì)煙曲霉菌的識(shí)別、殺菌等作用[2]。研究表明，Dectin-1識(shí)別真菌β-(1,3)-葡聚糖后誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞激活聚集及產(chǎn)生細(xì)胞因子，以抵抗曲霉菌感染[3]。Dectin-1受體還參與了小鼠獲得性免疫及其細(xì)胞因子的炎癥反應(yīng)。Dectin-1受體能直接驅(qū)動(dòng)小鼠獲得性免疫，包括小鼠Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞[4]。研究顯示，Th17細(xì)胞是小鼠對(duì)抗真菌感染的免疫基礎(chǔ)，Th17細(xì)胞在體內(nèi)通過(guò)Dectin-1受體途徑直接觸發(fā)IL-17抵抗真菌感染[5]。Th1細(xì)胞通過(guò)觸發(fā)炎癥細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12等，驅(qū)動(dòng)免疫應(yīng)答，清除真菌病原[6]。但關(guān)于Dectin-1受體抗角膜真菌感染的免疫反應(yīng)具體機(jī)制尚不明確。

研究發(fā)現(xiàn)，支氣管感染煙曲霉菌Dectin-1-/-小鼠與支氣管感染煙曲霉菌野生小鼠比較，肺部病原負(fù)荷相對(duì)更重，聚集到感染部位的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞較支氣管感染煙曲霉菌野生小鼠組明顯減少，相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)量及生存率明顯降低，ROS反應(yīng)的觸發(fā)受到抑制[7]。筆者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)體外模擬活化巨噬細(xì)胞真菌性角膜炎的過(guò)程，用曲霉菌刺激小鼠巨噬細(xì)胞激活，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠角膜巨噬細(xì)胞表面的Dectin-1受體的mRNA表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，于第9天達(dá)高峰，說(shuō)明在病程早期，真菌表面的β(1,3)-葡聚糖可能驅(qū)動(dòng)Dectin-1信號(hào)通路，觸發(fā)角膜對(duì)真菌的抵御作用，清除病原負(fù)荷。因此，筆者推測(cè)，Dectin-1受體可能作為一種角膜巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體，參與活化后巨噬細(xì)胞真菌性角膜炎的免疫進(jìn)程。

Saijo等發(fā)現(xiàn)，雖然Dectin-1信號(hào)通路同時(shí)誘導(dǎo)Th17和Th1細(xì)胞分化，但是優(yōu)先驅(qū)動(dòng)Th17細(xì)胞分化[8]。支氣管煙曲霉菌感染Dectin-1-/-小鼠與煙曲霉菌支氣管感染野生型小鼠相比，IL-17表達(dá)下調(diào)、IL-23表達(dá)增加，病原負(fù)荷更重，Th1細(xì)胞免疫通過(guò)產(chǎn)生IL-12 p40 IFN-γ發(fā)揮主導(dǎo)作用[9]。筆者的研究也發(fā)現(xiàn)，感染后第1,3,5,7,9天實(shí)驗(yàn)組IL-17、IL-12基因mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。第3,5,7天IL-17基因mRNA的表達(dá)高于IL-12基因mRNA的表達(dá)。筆者推測(cè)，Dectin-1信號(hào)通路可能直接誘導(dǎo)獲得性免疫，包括Th1和Th17細(xì)胞，上調(diào)IL-17、IL-12的表達(dá)，構(gòu)成了角膜清除真菌的免疫防線。

研究表明，正常角膜中不存在CD4+細(xì)胞，Th17在抗真菌感染中具有保護(hù)性作用。Huang等報(bào)道，IL17受體基因缺失小鼠與野生型小鼠相比，腎部感染第3天念珠菌負(fù)荷明顯增加，清除病原能力、生存率顯著降低[10]。這與本實(shí)驗(yàn)組角膜真菌負(fù)荷減輕表現(xiàn)一致。筆者推測(cè)，Dectin-1的信號(hào)通路優(yōu)先觸發(fā)Th17細(xì)胞分化，Th17細(xì)胞的激活具有保護(hù)性作用，在清除真菌病原中發(fā)揮重要作用。

小鼠角膜炎中有效的抗真菌免疫應(yīng)答，需要Th17/Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答相互平衡。受真菌感染后，Th1細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)IL-12及IFN-γ等介導(dǎo)免疫應(yīng)答。由單核巨噬細(xì)胞分泌的IL-12是Th1型細(xì)胞的主要激動(dòng)劑，進(jìn)一步觸發(fā)Th1型細(xì)胞分化，持續(xù)上調(diào)IL-12、IFN-γ等。但是，Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答通路中的IFN-γ將抑制Th17細(xì)胞分化[11]。筆者推測(cè)，在本研究中，角膜感染第7天，實(shí)驗(yàn)組IL-17和IL-12表達(dá)總量達(dá)到高峰，角膜中央潰瘍、明顯有水腫，伴壞死病灶或穿孔炎癥反應(yīng)劇烈。對(duì)照組Th1細(xì)胞免疫發(fā)揮主導(dǎo)作用，IFN-γ抑制Th17細(xì)胞分化，清除病原負(fù)荷，角膜中央輕度水腫伴灰白色混濁，廣泛分布新生血管，炎癥損害相對(duì)較輕。若降低Dectin-1的表達(dá)水平，能否減輕炎癥損傷組織的作用及Dectin-1的表達(dá)與Th1、Th17之間的相互關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

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(編輯:張慧茹)

The Expression of Dectin-1 Receptor, Interleukin-17 and Interleukin-12 in Mice Fungal Keratitis after the Activation of Macrophage

DONG Chenghuan， ZHENG Xiaoqian， XU Guoxing

Department of Optometry & Ophthalmology, School of Medical Technology and Engineering, Fujian Medical University,Fuzhou 350005, China

ObjectiveTo investigate expression level of c-type lectin-1 receptor (dectin-1), interleukin-17(IL-17) and interleukin-12 (IL-12) in mice afflicted with fungal keratitis after the activation of macrophages.MethodsPrior to the infection ofFusariumsolani, BALB/c mice received subconjunctival injection of latex beads or liposomes containing phosphate-buffered saline (PBS-LIP) in the corneas to establish the experimental group or the control group, respectively.After infection, the morphological features of fungal keratitis were examined under the slit-lamp and microscope at day 1, 3, 5, 7, 9 and the histopathological changes were analyzed by H-E staining.The cytokine mRNA levels of IL-12, IL-17, and dectin-1 in the cornea were measured by real-time PCR.ResultsThe experimental group presented heavy inflammation, diffuse opacity, zero neovascularization, and corneal perforation at day 7; the control group showed diffuse opacity, extensive neovascularization at day 5, but no corneal perforation.Histopathologic examination of corneas found in the experimental group marked dense inflammatory cell infiltration and damage of the corneal stroma at day 5; The mRNA expressions of dectin-1, IL-17, and IL-12 in the experimental group were markedly enhanced at day 3,5,7,9 when compared with those in the control group.ConclusionDectin-1, IL-17, and IL-12 may play an important role in host defense against corneal infection ofF.solani.

keratitis； eye infections, fungal； macrophages； agglutinins； Th1 cells/immunology； T-lymphocytes； interleukins

2015-07-06

福建省教育廳科技項(xiàng)目(JA14136)

福建醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院眼視光學(xué)系，福州350005

董騁寰(1986-)，女，醫(yī)學(xué)碩士

徐國(guó)興. Email：fjmuxuguoxing@hotmail.com

R329.24； R331.125； R392； R392.12； R519； R772.21

A

1672-4194(2016)02-0103-04