殼聚糖固定化乙醇脫氫酶的酶學性質研究

李　雪, 張彩艷, 童凱琛, 馬中良

(上海大學 生命科學學院,上海 200444)

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殼聚糖固定化乙醇脫氫酶的酶學性質研究

李雪, 張彩艷, 童凱琛, 馬中良

(上海大學 生命科學學院,上海 200444)

以殼聚糖作載體,戊二醛作交聯(lián)劑,并以游離的乙醇脫氫酶作為對照,對殼聚糖固定化乙醇脫氫酶的酶學性質進行研究.結果表明,當戊二醛濃度為0.6%(v/v),交聯(lián)時間為6h時,殼聚糖固定化乙醇脫氫酶對溫度、堿性環(huán)境以及金屬離子Cu2+溶液的耐受性均明顯增強,且操作穩(wěn)定性明顯提高.

殼聚糖; 乙醇脫氫酶; 固定化酶

幾丁質(chitin)是自然界中僅次于纖維素的第二大類天然高分子化合物,是地球上存量極為豐富的一種自然資源[1].殼聚糖(chitosan,CTS),幾丁質的脫乙?；a(chǎn)物,由β-(1,4)-2-乙酰胺基-D葡萄糖單元和β-(1,4)-2-氨基-D-葡萄糖單元組成,屬多糖類物質,是天然多糖中少見的帶正電荷的高分子物質,其在材料工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品以及環(huán)保等諸多方面具有廣泛的用途[2-4].

乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)大量存在于人類和動物肝臟、微生物細胞及植物組織內(nèi),是廣泛專一性的含鋅金屬酶,以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide,NAD)為輔酶,催化生物體內(nèi)伯醇的氧化和醛的還原.乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶(acetaldehydedehydrogenase,ALDH)共同構成乙醇脫氫酶系,參與體內(nèi)乙醇代謝,是人和動物體內(nèi)重要的代謝酶[5-6].

固定化酶(immobilizedenzyme)是20世紀60年代發(fā)展起來的一種新技術,將水溶性酶用物理或化學方法處理,使之成為不溶于水的,但仍具有酶活性的狀態(tài),并在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用,能反復和連續(xù)使用的酶[7-9].本文作者以殼聚糖作為載體,戊二醛作為交聯(lián)劑,將乙醇脫氫酶固定化,與游離的乙醇脫氫酶作比較,進而研究殼聚糖固定化乙醇脫氫酶的酶學性質,為工業(yè)生產(chǎn)提供更多的理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

殼聚糖(自制,脫乙酰度大于80%);乙醇脫氫酶為BBI公司(Canada)產(chǎn)品;戊二醛由上海試劑廠分裝,濃度為25%(v/v);其他試劑均為分析純或者生化試劑.

1.2方法

1.2.1甲殼素及殼聚糖的提取[10]

稱取200g干蝦殼置于4% 的HCl溶液中浸泡,期間不斷攪拌使蝦殼中鈣質充分分解,用自來水充分洗凈,直至pH呈中性后用10%(g/v) 的NaOH溶液浸沒,并放置于溫度設定為90 ℃的烤箱內(nèi)7h以上,取出過濾.重復脫鈣、去蛋白便可得到甲殼素.將得到的甲殼素用40% 的NaOH浸沒,放置于溫度設定為100 ℃的烤箱內(nèi)7h以上,進行脫乙?；磻蟮玫綒ぞ厶?

1.2.2殼聚糖固定化酶的制備[11-14]

稱取3g殼聚糖溶于1%的醋酸溶液中,緩慢攪拌過夜使其充分溶解并抽濾,濾液用2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至12,產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀后,抽濾,用蒸餾水洗至中性后懸浮于pH7.8Tris-HCl緩沖液中,再加入0.5mL乙醇脫氫酶原酶液,攪拌吸附1h,加入25%戊二醛,使其終濃度為0.6%(v/v),攪拌吸附6h,抽濾水洗,制備獲得殼聚糖固定化酶,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.3蛋白酶濃度的測定[15-16]

采用Lowry法對乙醇脫氫酶溶液蛋白濃度進行測定,并在650nm波長下測定吸光度變化值.

1.2.4酶活力的測定

稱取0.5g的固定化醇脫氫酶,加入6mL、pH7.5NaHPO4/NaH2PO4緩沖溶液,37 ℃下水浴10min,然后加入2mol/L乙醇和4.5mmol/LNAD+,37 ℃下水浴5min,回收固定化酶,反應液立刻置于沸水中滅活1min,并在320nm波長下測定吸光度變化值.

2　結　果

2.1戊二醛濃度對固定化酶蛋白濃度以及酶活力的影響

戊二醛既是交聯(lián)劑又是酶的變性劑,戊二醛的濃度對固定化酶的活性具有重大的影響,分別使用濃度為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和2.0%的戊二醛與殼聚糖載體交聯(lián),測定不同條件下固定化酶蛋白量和酶活力.

圖1　戊二醛濃度對固定化酶蛋白質量濃度的影響

圖2　戊二醛濃度對固定化酶酶活力的影響

從圖1、2可以看出在交聯(lián)體系中,戊二醛終濃度為0.6%時,固定化酶的酶活性是最高的.濃度低于或者高于0.6%,酶活性都會下降.

2.2pH值對固定化乙醇脫氫酶穩(wěn)定性的影響

在pH值 6.0～11.0 范圍內(nèi),測定不同pH值條件下游離酶和固定化酶的酶活力變化(圖3).游離的乙醇脫氫酶在堿性條件下酶活力較高,但當pH值高于9.0后,酶活力急速下降;而固定化醇脫氫酶在較高pH值的環(huán)境下反而有更高的酶活性.由于殼聚糖為陽離子型載體,其表面具有游離氨基,固定化酶周圍的微環(huán)境呈弱堿性,因而固定化酶的最適作用pH值明顯高于游離酶.并且固定化酶的空間結構受載體的影響,也降低了其對pH值變化的敏感性.

2.3固定化乙醇脫氫酶的熱穩(wěn)定性

分別在不同的溫度條件下將游離酶和固定化酶處理后測其酶活力(圖4).游離的乙醇脫氫酶最適溫度在40 ℃左右,超過50 ℃后酶活力急劇下降,溫度超過60 ℃后游離酶活力接近于0.而殼聚糖固定化乙醇脫氫酶與游離酶相比其耐熱性明顯增強,固定化酶在較高的溫度范圍內(nèi)保持有較高的活性,在80 ℃左右時,固定化酶仍具有較高的酶活力,這表明固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯提高.

圖3　游離酶和固定化酶的酶活性隨pH值變化關系

圖4　游離酶和固定化酶的酶活力隨溫度變化關系

2.4金屬離子對固定化乙醇脫氫酶酶活力的影響

研究金屬離子對固定化酶酶活力的影響,分別配置物質的量濃度為10-2mol/L和10-3mol/L兩種不同K+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+以及Ca2+溶液,稱量適量的游離酶溶液以及固定化酶加入其中,分別測其酶活力.由圖5可知,兩種不同物質的量濃度的Cu2+金屬離子溶液對游離酶都有強烈的抑制作用,而對固定化乙醇脫氫酶的抑制作用則較為微弱.由此可見,固定化酶對Cu2+的穩(wěn)定性較之游離酶有明顯的提高,固定化降低了酶對外界環(huán)境的敏感性,能更大程度地發(fā)揮酶的活性.

圖5　金屬離子對游離酶和固定化酶酶活力的影響

2.5固定化乙醇脫氫酶的半衰期

將固定化酶分別懸浮在pH=9.0和pH=10.0的緩沖液中,并進行連續(xù)12次使用的操作,測定每次使用后的酶活力(圖6).殼聚糖固定化乙醇脫氫酶具有較長的半衰期,在pH=9.0條件下,重復使用8次后,固定化酶酶活力雖隨著次數(shù)的增加有所降低,但仍保持55%的酶活,且表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性.在pH=10.0條件下,固定化酶穩(wěn)定性相對較低,在第1次使用后酶活力下降較快,高酶活力的優(yōu)勢不再明顯.相對于游離酶而言,固定化酶在使用中具有較好的穩(wěn)定性,半衰期較長,更加經(jīng)濟耐用.

圖6　不同pH值條件下固定化酶的半衰期

3　結　論

固定化酶的研究一直是酶學上研究的重要方面[17],乙醇脫氫酶在工業(yè)上的應用很廣泛.本研究表明,殼聚糖固定化乙醇脫氫酶與游離的乙醇脫氫酶相比,在較廣泛的溫度范圍和pH值范圍內(nèi)都有較高的酶活和穩(wěn)定性,Cu2+對固定化酶酶活力抑制作用微弱,且固定化酶在操作過程中具有較好的重復使用性,在經(jīng)過多次重復使用后仍然保有較高的催化活力.因此,殼聚糖固定化乙醇脫氫酶有望在實際生產(chǎn)中得到廣泛應用.

[1]YounesI,RinaudoM.Chitinandchitosanpreparationfrommarinesources.Structure,propertiesandapplications[J].MarineDrugs,2015,13(3):1133-1174.

[2]SahariahP,GawareVS,LiederR,etal.Theeffectofsubstituent,degreeofacetylationandpositioningofthecationicchargeontheantibacterialactivityofquaternarychitosanderivatives[J].MarineDrugs,2014,12(8):4635-4658.

[3]EijsinkV,HoellI,Vaaje-KolstadaG.Structureandfunctionofenzymesactingonchitinandchitosan[J].Biotechnology&GeneticEngineeringReviews,2010,27(1):331-366.

[4]PrasadM,PalaniveluP.Immobilizationofathermostable,fungalrecombinantchitinaseonbiocompatiblechitosanbeadsandthepropertiesoftheimmobilizedenzyme[J].Biotechnology&AppliedBiochemistry,2015,62(4):523-529.

[5]LerchnerA,JaraschA,MeiningW,etal.Crystallographicanalysisandstructure-guidedengineeringofNADPH-dependentRalstoniasp.alcoholdehydrogenasetowardNADHcosubstratespecificity[J].Biotechnology&Bioengineering,2013,110(11):2803-2814.

[6]HongSH,NgoHP,KangLW,etal.CharacterizationofalcoholdehydrogenasefromKangiellakoreensisanditsapplicationtoproductionofall-trans-retinol[J].BiotechnologyLetters,2015,61(2):165-174.

[7]HomaeiAA,SaririR,VianelloF,etal.Enzymeimmobilization:anupdate[J].JournalofChemicalBiology,2013,6(4):185-205.

[8]QiaoL,LvB,FengX,etal.Anewapplicationofaptamer:One-steppurificationandimmobilizationofenzymefromcelllysatesforbiocatalysis[J].JournalofBiotechnology,2015,203:68-76.

[9]VidalJC,EstebanS,GilJ,etal.Acomparativestudyofimmobilizationmethodsofatyrosinaseenzymeonelectrodesandtheirapplicationtothedetectionofdichlorvosorganophosphorusinsecticide[J].Talanta,2006,68(3):791-799.

[10]郭敏亮,姜涌明,馬中良.殼聚糖固定化AS1.398中性蛋白酶穩(wěn)定性的研究 [J].微生物學通報,1996(1):19-21.

GuoML,JiangYM,MaZL.Studyonthestabilityofchitosan-imbolizedas1.398neutralproteinase[J].Microbiolgy,1996(1):19-21.

[11]馬中良,李艷利,焦吉祥,等.殼聚糖固定化酵母蔗糖酶的研究 [J].藥物生物技術,2005(6):379-382.

MaZL,LiYL,JiaoJX,etal.Studyonthepropertiesofchitsan-immoblizedyeastsurase.PharmacetticalBiotechnology[J].PharmaceuticalBiotechnology,2005,(6):379-382.

[12]李艷利,史永昶,姜涌明,等.殼聚糖多孔珠的制備及其作為親和吸附劑載體的研究 [J].藥物生物技術,1998(4):241-244.

LiYL,ShiYC,JiangYM,etal.Preparationofchitosanporousbeads(CPB)andstudiesonCPBasaffinityadsorbentssupport[J].PharmacetticalBiotechnology,1998(4):241-244.

[13]李艷利,史永昶,姜涌明,等.殼聚糖多孔珠作為親和吸附劑載體純化人尿胰蛋白酶抑制劑 [J].藥物生物技術,2000(4):218-220.

LiYL,ShiYC,JiangYM,etal.Purificationofhumanurinetrypsininhibitorbyaffinitychromatographyusingchitosanporousbeadsassupport[J].PharmacetticalBiotechnology,2000(4):218-220.

[14]TaqieddinE,AmijiM.Enzymeimmobilizationinnovelalginate-chitosancore-shellmicrocapsules[J].Biomaterials,2004,25(10):1937-1945.

[15]Redmile-GordonMA,ArmeniseE,WhiteRP,etal.Acomparisonoftwocolorimetricassays,baseduponLowryandBradfordtechniques,toestimatetotalproteininsoilextracts[J].SoilBiology&Biochemistry,2013,67(100):166-173.

[16]LuTS,YiaoSY,LimK,etal.InterpretationofbiologicalandmechanicalvariationsbetweentheLowryversusBradfordmethodforproteinquantification[J].NorthAmericanJournalofMedicalSciences,2010,2(7):325-328.

[17]SilvaDF,RosaH,CarvalhoAF,etal.Immobilizationofpapainonchitinandchitosanandrecyclingofsolubleenzymefordeflocculationofsaccharomycescerevisiaefrombioethanoldistilleries[J].EnzymeResearch,2015:573721.

(責任編輯：顧浩然)

Study of enzymatic properties of Chitsan-immobilizedAlcohol Dehydrogenase

LI Xue, ZHANG Caiyan, TONG Kaichen, MA Zhongliang

(CollegeofLifeSciences,ShanghaiUniversity,Shanghai200444,China)

Takingfreeenzymeascontrol,weinvestigatedtheenzymaticpropertiesofimmobilizedalcoholdehydrogenaseusingchitosanascarrierandglutaraldehydeascrosslinkingagent.Theresultsshowedthattheresistanceofimmobilizedalcoholdehydrogenasetotemperature,alkalineenvironmentandCu2+wassignificantlyimprovedwhenthechitosanwascrosslinkedwith0.6%glutaraldehydefor6hours,andtheoperationstabilitywasalsoobviouslyimproved.

chitosan;alcoholdehydrogenases;immobilizedenzyme

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2016.04.015

2015-05-26

上海市能源與育種重點實驗室項目;上海大學生命科學學院大學生創(chuàng)新項目

馬中良,中國上海市寶山區(qū)上大路99號，上海大學生命科學學院，郵編：200444，E-mail:zlma@shu.edu.cn

Q55

A

1000-5137(2016)04-0482-05