新型鈰苦味酸配合物表現(xiàn)和白蛋白的相互作用分析

李春玲，梁明慧 ，王 娜，仇曉陽(yáng)

?

新型鈰苦味酸配合物表現(xiàn)和白蛋白的相互作用分析

李春玲1，梁明慧1，王 娜1，仇曉陽(yáng)2

（1. 商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 公共學(xué)科部化學(xué)教研室，河南 商丘476000； 2. 商丘師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 商丘 476000)

分析了新型鈰苦味酸配合物表現(xiàn)和白蛋白的相互作用分析。采用元素分析、紅外光譜法、熒光光譜法、三維熒光光譜法、同步熒光光譜等，以分析配合物構(gòu)成物質(zhì)。結(jié)果表明配合物對(duì)3種白蛋白形成的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅，猝滅強(qiáng)弱依次如下：HAS（人血清白蛋白）＞ BSA （牛血清白蛋白）＞ VOA（雞蛋清白蛋白）。通過(guò)計(jì)算分析了不同溫度狀態(tài)下配合物和3種白蛋白間結(jié)合的主要形式是依賴靜電作用力。

稀土配合物; 熒光猝滅; 白蛋白

稀土化合物的藥理作用突出，融合了抗腫瘤和抗動(dòng)脈硬等多種特效。大量的稀土化合物可以直接當(dāng)作藥物使用，酰胺型化合物自身特征顯著，如抗變態(tài)和抗驚厥等反應(yīng)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用很熱。所以，酰胺型稀土配合物自誕生以來(lái)，就體現(xiàn)了二者的協(xié)同效應(yīng)和特有性能，逐漸受到目前一些科研學(xué)科領(lǐng)域，如超分子化學(xué)領(lǐng)域和稀土配位化學(xué)領(lǐng)域的重視，成為熱門研究課題。在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)中，白蛋白作用巨大，保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)，其中，將近1/3 白蛋白在肝臟合成下產(chǎn)生。另外，白蛋白還輸送部分蛋白質(zhì)材料，供應(yīng)所需細(xì)胞，有效發(fā)揮藥理作用，搭建了重要的載體支撐。所以，對(duì)小分子與白蛋白間的藥理活性作用，意義很大，利于分析和研究藥物代謝與運(yùn)輸過(guò)程，也有助于更好地解釋藥物分子設(shè)計(jì)和研究藥物作用機(jī)制等[1]。文章介紹了新型合成物-二苯胺酰乙氧基萘，探究該物質(zhì)和鈰苦味酸鹽的結(jié)合，此外，采用熒光光譜法，將合成物及配合物放置在pH = 7.30的Tris － HCl緩沖溶液中，分析配合物和 HSA、BSA和VOA的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)試劑使用了一些市場(chǎng)生產(chǎn)試劑：“如牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS），使用pH = 7.30的Tris-HCl緩沖溶液配制，為了保持一定的離子強(qiáng)度，使用5 mmol·L－1pH = 7.30的Tris-HCl緩沖溶液，放置在4 ℃保存，作為備用；剩下的試劑都屬于分析純?cè)噭?，使用之前并沒(méi)有進(jìn)行任何處理；實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了眾多的實(shí)驗(yàn)器材，如，F(xiàn)-4600型熒光光譜儀（日立）和ElementarVario EL型元素分析儀（德國(guó)）等[2]?！?/p>

1.2 合成稀土配合物

配體在二苯胺酰乙氧基萘合成下生成：配體原料，白色粉末狀固體，熔點(diǎn)在187～188 ℃，維持80%產(chǎn)出效率等，Ce（Ⅲ）配合物合成，把0.2 mmol配體放置5 mL氯仿中進(jìn)行溶解，放置在溫室環(huán)境中作攪拌處理，緩慢填入適量鈰苦味酸鹽和無(wú)水乙醇，持續(xù)時(shí)間4 h，黃色沉淀析出，攪拌，離心，分離，接著相應(yīng)用到了微量的無(wú)水乙醇洗滌和氯仿，為了更好地將清液分析出來(lái)，放置在真空環(huán)境中進(jìn)行干燥處理，生成了黃色粉末配合物。

1.3 探究配合物和白蛋白作用下的熒光光譜

在室溫狀態(tài)下：朝樣品池填入（HSA/BSA/VOA，=1×10－5mol·L－1）的3 mL白蛋白溶液，依據(jù)ex=280 nm，對(duì)溶液表現(xiàn)出的熒光光譜做記錄分析，接著逐次填入（5μL）的1.0×10－4mol·L－1配合物溶液，混合后保持均勻，在靜止?fàn)顟B(tài)下放置2min，對(duì)填入的Ce（Ⅲ）配合物生成的混合體系，進(jìn)行熒光光譜測(cè)定處理，保持Δ=60 nm或者 Δ=15 nm不變，填入Ce（Ⅲ）配合物，形成了混合體系，做同步熒光光譜處理，用三維熒光光譜作掃描處理[2]。

2 結(jié)果和討論

2.1 探析配合物

Ce(Ⅲ)配合物的生成物：黃色粉末裝固體，82%的產(chǎn)出效率；對(duì)元素進(jìn)行分析，通過(guò)計(jì)算，得出元素所占百分比，其中 Ce: 6.71%(6.70%)和C: 52.61% (52.62%) 等，元素分析值和組成:和［Ce( pic)3L2］大體相符；在滿足實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，通過(guò)測(cè)量，得出配合物溶解在(1×10－4mol·L－1)的DMF溶液中生成63 S·cm2·mol－1的摩爾電導(dǎo)值，是非電解質(zhì)的一種疇；配合物在DMSO與DM F溶解度大，可溶于乙酸乙酯與乙腈溶液，微溶于氯仿與乙醇，和石油醚、正己烷不相溶[2]。

2.2 熱分析

為探究配合物進(jìn)行了熱重，將研究條件控制如下：流速為100 mL / min和升溫速率10 ℃/min等，在303 ℃以下，鈰配合物無(wú)出現(xiàn)熱現(xiàn)象與失重現(xiàn)象，這說(shuō)明，配合物無(wú)結(jié)晶水及配位，當(dāng)水升溫達(dá)到303 ℃上下，配合物的分解才真正開始，當(dāng)溫度處在316 ℃時(shí)，結(jié)果出現(xiàn)突出的放熱峰，TG曲線出現(xiàn)了連續(xù)性失重，因?yàn)榕潴w與苦味酸的熱分解，結(jié)果產(chǎn)生了Ce2O3，理論殘重率應(yīng)是8.23%，但結(jié)果顯示為8.53%?？傊?，鈰苦味酸鹽和配體產(chǎn)生了型配合1∶ 2(M∶L)，在2個(gè)配體中，C= O基O原子4個(gè)，在苦味酸根中，3個(gè)O，這些O原子和NO2中3個(gè)基O通過(guò)雙齒形式實(shí)現(xiàn)配位，10個(gè)鈰離子配位。

從圖7算法復(fù)雜度對(duì)比圖可以看出,傳統(tǒng)HOG+SVM檢測(cè)動(dòng)物時(shí),每幀視頻的處理時(shí)間在570 ms左右,本文的處理時(shí)間在60 ms左右,速度提高了8.5倍,傳統(tǒng)HOG+SVM檢測(cè)越界人,每幀視頻的檢測(cè)時(shí)間在3 360 ms左右,相比之下我們的算法檢測(cè)時(shí)間僅在60 ms左右,檢測(cè)速度提高了大約55倍。檢測(cè)速度的提高得益于混合高斯背景建模提取運(yùn)動(dòng)目標(biāo),減少了計(jì)算背景的時(shí)間。

圖1 Ce(Ⅲ)配合物形成的TG-DSC曲線圖像

2.3 配合物的紅外光譜分析

紅外光譜分析：“ν(C = O) (1 687 cm－1)的配合物，在振動(dòng)作用下，向低頻產(chǎn)生75 cm－1位移，這表明，配體中C = O的O和稀土離子發(fā)生配位，振動(dòng)降低了C = O中的電子云濃度，減弱了振動(dòng)頻率；然而，ν(C－O－C) (1 117 cm－1)的配體變化較小，這表明，醚中O并未發(fā)生配位；另外，處在配合物中的ν(C－O)(1 265 cm－1)的苦味酸根出現(xiàn)了5 cm－1的藍(lán)移，其中，νs(1 342 cm－1)與νas (1 555 cm－1) 的NO2基都出現(xiàn)了裂分，產(chǎn)生雙重峰，從中可以得出，苦味酸根以雙齒形式、稀土離子進(jìn)行配位[2]?！?/p>

2.4 猝滅原理

藥物分子作用下的白蛋白熒的猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅，動(dòng)態(tài)猝滅符合Stern－Volmer方程中的0/= 1 +q0［］=1 + KSV［］，依據(jù)0/給［］圖像的直線斜率（KSV）配合物Ce(Ⅲ)作用下的白蛋白熒光的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下雙分子猝滅速率-q值；此外，0與：添加配合物前添加配合物后白蛋白的吸光度，［］：在混合體系內(nèi)，配合物濃度大小，當(dāng)沒(méi)有猝滅劑，用0表示熒光分子平均壽命[3]。

配合物Ce(Ⅲ)施加給3種白蛋白的熒光猝滅全都是靜態(tài)猝滅；研究配合物Ce(Ⅲ) 過(guò)程，其中涉及了有關(guān)系數(shù)、猝滅過(guò)程和常數(shù)等，這說(shuō)明，配合物Ce(Ⅲ) 施加給3種白蛋白的q值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于不同種類的猝滅劑施加給生物大分子的最大化擴(kuò) 散碰撞猝滅常數(shù)，從而得出，配合物Ce(Ⅲ)作用給3種白蛋白的熒光猝滅都是在生成復(fù)合物下產(chǎn)生的靜態(tài)猝滅。

圖2 配合物作用給HSA、BSA和VOA猝滅生成Stern-Volme圖像

Fig.2 Stern-Volme image of HSA and BSA and VOA quenching by the complex

2.5 熒光猝滅光譜

加強(qiáng)酪氨酸殘基熒光強(qiáng)度；藍(lán)移出色氨酸殘基波長(zhǎng);溫度在37 ℃時(shí)和與20 ℃時(shí)，產(chǎn)生了相同的各白蛋白的熒光猝滅光譜，沒(méi)有改變最大熒光發(fā)射峰位置，這說(shuō)明，溫度變化下，各白蛋白的構(gòu)象不隨之變化，所以，在測(cè)定溫度中，無(wú)需擔(dān)心各白蛋白構(gòu)象產(chǎn)生的變化。

圖3 配合物施加給 HSA、BSA和VOA 熒光光譜的作用圖像

2.6 配合物和白蛋白的結(jié)合

在臨床應(yīng)用需求基礎(chǔ)上,出現(xiàn)了研究載體白蛋白的修飾和改性的文獻(xiàn)[3]。蛋白質(zhì)和酶在日常生活和疾病防治等起到了重要作用,提取分離法成為獲取這種物質(zhì)的關(guān)鍵手段[4]。白蛋白結(jié)合為范德華力、疏靜電引力和水作用力等，各藥物分子和白蛋白結(jié)合方式不同，生成的力也不同。當(dāng)溫度條件差別不大時(shí)，Δ可以看成常數(shù)，借助下述熱力學(xué)公式，獲得相關(guān)參數(shù)：ln(2/1) = Δ/(1/1－ 1/2) ，Δ= －ln= Δ－Δ，通過(guò)對(duì)兩個(gè)公式的計(jì)算，獲得不同溫度條件下配合物和3種白蛋白相互作用下生成的Δ、Δ和Δ，其中，Δ＜ 0，說(shuō)明，配合物和3種白蛋白之間為自動(dòng)結(jié)合；Δ＜0，Δ＞ 0，這說(shuō)明，配合物Ce(Ⅲ)和3種白蛋白三者之間的作用力均為靜電引力，配合物和 HSA、BSA 、 VOA 共同作用下生成了同步熒光光譜；研究結(jié)果得出，添加配合物Ce(Ⅲ)后，產(chǎn)生改變的只是BSA 構(gòu)象，然而，VOA與HAS構(gòu)象無(wú)變化[2]。

2.7 配合物、白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與結(jié)合常數(shù)

處在靜態(tài)猝滅作用環(huán)境中，白蛋白分子熒光強(qiáng)度滿足配合物濃度中 Scatchard 方程的要求-lg［(0－)/］= lgA+lg［］，依照 lg［(0－)/］，繪制lg［］得出圖像為一直線，通過(guò)直線截距與斜率獲得不同溫度狀態(tài)下配合物和白蛋白具有的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)A；配合物與所有蛋白質(zhì)的A都在105數(shù)量級(jí)，說(shuō)明，配合物Ce(Ⅲ)和3種白蛋白之間的結(jié)合非常牢固，此外，隨著A增大，配合物和白蛋白作用越來(lái)越強(qiáng)烈，從數(shù)據(jù)可以得到配合物Ce(Ⅲ)和3種白蛋白作用下，產(chǎn)生的強(qiáng)度大小，HSA ＞ BSA ＞ VOA；結(jié)合位點(diǎn)數(shù)趨向1，表明，實(shí)驗(yàn)環(huán)境中配合物Ce(Ⅲ)和3種白蛋白都通過(guò)1∶1相互結(jié)合生成了復(fù)合物[2]。

3 結(jié) 論

苦味酸銪配合物和BSA產(chǎn)生配比為1∶1型無(wú)熒光復(fù)合物Eu(pic)3L-BSA,是一種靜態(tài)猝滅, 作用力為氫鍵與范德華力，1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[5]。稀土元素和其配合物具有藥物活性功效，如抗凝血、抗菌、消炎等[6]。把2，7－二羥基萘作為骨架，通過(guò)合成生成了一種新的物質(zhì)，酰胺型開鏈冠醚、鈰苦味酸鹽的配合物。使用熒光光譜探究目標(biāo)配合物的發(fā)光性能，研究結(jié)果獲得：目標(biāo)配合物均發(fā)射強(qiáng)度不同的中心離子，此外，中心離子具有不對(duì)稱中心[7，8]。研究其結(jié)構(gòu)特性發(fā)現(xiàn):鈰苦味酸鹽和配體生成了配合物1∶2( M∶L)，此外，在配體上面，僅有C = O鍵中的O原子和鈰離子相互作用，產(chǎn)生了配位，苦味酸根參與配位形式都是雙齒，10鈰離子配位；當(dāng)緩沖液Tris－HCl， pH =7.30 時(shí)，使用熒光法，分析了配合物Ce(Ⅲ)對(duì)3種白蛋白的施加作用；配合物Ce(Ⅲ)作用給3種白蛋白的熒光猝滅均因生成復(fù)合物產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，配合物和 3 種白蛋白相互作用，借助靜電引力，生成了復(fù)合物；此外，配合物Ce(Ⅲ)作用下的 HSA、BSA 和 VOA 都生成了構(gòu)象，這也表明，該配合物在一定程度上符合促凝血、抗病毒和抗菌活性藥物的需求[2]。”

［1］ Zhao dragon, Lu Jixin, Xiang Zhenling, et al. Study on the interaction between the rare earth complexes of the rare earth complexes with human serum albumin[J]. Analysis of scientific journal, 2011, 27 (5): 581-585.

［2］ 霍麗娜. 酰胺型開鏈冠醚稀土配合物的合成、表征及其與BSA、DNA相互作用研究[D]. 銀川：寧夏大學(xué), 2013.

［3］ Gao Xu, Yujiang, Ma Yujie, et al. Study on the interaction between bovine serum albumin and La (III)[J]. rare earth, 2012,33 (5): 7-10.

［4］ Tian Mingyu. Preliminary. study on the aqueous two-phase extraction of albumin and enzyme [D]. Dalian University of Technology, 2009.

［5］宋盼，楊水蘭，劉偉，楊天林.N,N',N″-三(亞磷酸三乙酯)縮甲膦酸亞氨二乙酸及苦味酸銪配合物的合成及其與BSA相互作用的研究[J].化學(xué)試劑，2015（06）：487-494.

［6］ 賀微. 新型酰胺開鏈冠醚及其銪、鋱配合物的合成與性能研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南大學(xué)，2013.

［7］ 董文魁，李剛 ，李翔 ，楊成娟， 趙萌萌 ，董秀延. 一種不對(duì)稱Salamo．型螯合配體及其鈷(Ⅱ)配合物：合成、表征與晶體結(jié)構(gòu)[J]. 無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2014（08）：1911-1919

［8］ 何亭，葛軼岑，武壘壘，付海燕，陳華，李賢均. 碘化亞銅/亞磷酸三乙酯催化碘代芳烴和末端炔烴的偶聯(lián)反應(yīng)[J]. 催化學(xué)報(bào)，2011（08）：37-40．

Analysis on Performance of a Novel Cerium Picorate Complex and Its Interaction With Albumin

LI Chun-ling1，LIANG Ming-hui1，WANG Na1，QIU Xiao-yang2

（1. Department of Chemisty of Commen subjects department, Shangqiu medical college，Shangqiu Henan 476000,China;2. Shangqiu Teachers College,Chemistry and Chemical Engineering, Shangqiu Henan 476000,China)

Performance of a novel cerium picorate complex and its interaction with albumin were analyzed. Structure and composition of the complex were investigated by elemental analysis, infrared spectroscopy, fluorescence spectrometry, 3D fluorescence spectroscopy, synchronous fluorescence spectroscopy and other research methods. The results show that fluorescence quenching of three kinds of albumin by the complex is static quenching, quenching intensity in turn is as follows: HAS (human serum albumin) > BSA (bovine serum albumin) > VOA (egg white protein). The main form of combination between three kinds of albumin with the complex is dependent on the electrostatic force.

Rare earth complexes; Fluorescence quenching; Albumin

TQ 028

A

1671-0460（2016）06-1156-04

商丘市科技公關(guān)項(xiàng)目，項(xiàng)目號(hào)：141055。

2016-05-17

李春玲（1980-），女，河南商丘人，講師，2004年畢業(yè)于商丘師范學(xué)院化學(xué)專業(yè)，主要從事醫(yī)用化學(xué)分析。Email:hnlcl07911@163.com。