維生素C對體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞系的影響

任晨霞　麻麗霞　郭　萍　郭　穎　曹文君

?

維生素C對體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞系的影響

任晨霞麻麗霞郭萍郭穎曹文君

目的：探討維生素C對大鼠H9C2心肌細(xì)胞抗氧化能力與細(xì)胞活力的影響。方法：以體外培養(yǎng)的大鼠H9C2心肌細(xì)胞為研究對象，在培養(yǎng)過程中，分別加入不同濃度的維生素C，觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測心肌細(xì)胞活力，DCFH-DA熒光探針法測定維生素C對H2O2處理的心肌細(xì)胞活性氧(ROS)生成的影響，用比色法檢測半胱天冬酶(caspase)-3和caspase-9活性。 結(jié)果：0.05 mg/mL維生素C處理后，H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞質(zhì)中顆粒狀物質(zhì)增多，排列紊亂，間隙增寬； 0.05 mg/mL維生素C可有效抑制H2O2導(dǎo)致的ROS積累；但隨著培養(yǎng)基中維生素C濃度的升高，心肌細(xì)胞存活率明顯降低，且維生素C處理后caspase-3和caspase-9活性明顯升高。結(jié)論：H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)中添加維生素C可產(chǎn)生明顯的抗氧化作用，但維生素C對H9C2心肌細(xì)胞生長具有抑制作用。

維生素C；H9C2心肌細(xì)胞；細(xì)胞活力

心肌病是由于心室結(jié)構(gòu)改變和心肌受損引起心臟功能障礙的病變。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌損傷區(qū)出現(xiàn)大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累[1]。心肌缺血再灌注過程中，大量氧自由基的產(chǎn)生可引起心律失常以及心肌梗死面積擴(kuò)大等現(xiàn)象[2]。早期酒精性心肌病大鼠模型的心肌組織中，過氧化物產(chǎn)物丙二醛水平顯著升高，而清除氧化物和自由基的過氧化物酶體和金屬硫蛋白水平降低[3]。心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌功能紊亂的一個重要因素。減少ROS產(chǎn)生、消除心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激可減輕心肌損傷[4-7]。因此，抗氧化藥物是心血管疾病治療中的重要部分。

維生素C(即抗壞血酸)具有多種生物學(xué)功能，是細(xì)胞中氧自由基的清除劑，參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)及羥化反應(yīng)。風(fēng)濕性心臟病患者血清中維生素C水平顯著高于健康人，其分子機(jī)制仍不明確[8]。本文主要探討維生素C對體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞系的影響。

1　材料與方法

1.1材料

大鼠H9C2心肌細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。DCFH-DA熒光探針法ROS檢測試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，半胱天冬酶(caspase)-3、caspase-9活性檢測試劑盒購于南京建成生物技術(shù)研究所；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中添加含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%～80%融合狀態(tài)時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)6～7代后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2MTT實驗取對數(shù)生長期的心肌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按1×104個/孔的密度接種于96孔板中，每孔200 μL細(xì)胞懸液。將96孔板放置在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，換用無血清培養(yǎng)液200 μL/孔饑餓培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長同步化至G0期。吸棄上清液，分別加入含不同濃度維生素C的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至測定時間。每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT，避光孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，將培養(yǎng)板置于水平搖床上37℃輕搖10 min。采用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定各孔吸光度值。

細(xì)胞存活率=處理組吸光度/對照組吸光度×100%

1.2.3心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測將心肌細(xì)胞以2×105個/mL的密度接種于6孔板中，無血清培養(yǎng)液同步化饑餓培養(yǎng)24 h后，分為對照組、過氧化氫(H2O2)組(加入50 μmol/L H2O2)、H2O2+維生素C組(加入50 μmol/L H2O2和 0.05 mg/mL維生素C)、維生素C組(加入0.05 mg/mL維生素C)，分別培養(yǎng)24 h。用無血清DMEM按1∶1 000比例稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmol/L，吸棄6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，37℃避光孵育30 min后，用無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次。將6孔板置于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，采集圖像。

1.2.4凋亡活性檢測采用比色法測定心肌細(xì)胞中caspase-3、caspase-9的活性。0.05 mg/mL 維生素C處理H9C2細(xì)胞24 h后，經(jīng)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌1次后吸去上清，加入50 μL細(xì)胞裂解液，反復(fù)凍融3次后，12 000 轉(zhuǎn)/min、4℃離心15 min，吸取上清液按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在405 nm波長下測定吸光度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每項實驗均獨立重復(fù)3次。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間差異比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞形態(tài)

正常心肌細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞界限清晰，排列規(guī)整；0.05 mg/mL維生素C組H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞質(zhì)中顆粒狀物質(zhì)增多，排列紊亂，間隙增寬(見圖1)。

注： A為對照組；B為維生素C組

2.2心肌細(xì)胞存活率

維生素C處理后24 h后心肌細(xì)胞活力顯著下降，0.05 mg/mL維生素C干預(yù)導(dǎo)致細(xì)胞存活率降至66.06%，隨著濃度增高細(xì)胞存活率降低至50%以下(見圖2)。在0.05 mg/mL維生素C作用下，心肌細(xì)胞存活率不隨培養(yǎng)時間的延長而變化(見表1)。

注：與未加維生素C組相比，(1)P<0.01

2.3維生素C的抗氧化作用

與對照組相比，H2O2組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS熒光明顯增強(qiáng)，而H2O2+維生素C組ROS熒光強(qiáng)度明顯低于H2O2組(見圖3)。

2.4caspase-3和caspase-9活性

與對照組相比，維生素C組H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)的caspase-3和caspase-9的活性均顯著上升(P<0.01，見圖4)。

表1　不同時間點 0.05 mg/mL維生素C處理對H9C2心肌細(xì)胞活力的影響

注：與對照組相比，(1)P<0.01

注： A為對照組；B為H2O2組；C為H2O2 +維生素C組；D為維生素C組

注：與對照組相比，(1)P<0.01

3　討論

心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)與心肌損傷密切相關(guān)[9]，ROS可作為信號分子激活致心肌細(xì)胞肥大或細(xì)胞凋亡的信號通路[10]。高水平ROS會破壞生物大分子、線粒體和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致心律失?；蛐募」δ苷系K[11]。減少病理情況下細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，防止細(xì)胞膜損傷和脂質(zhì)過氧化，對減輕或防止心功能障礙具有重要意義。

正常生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞通過抗氧化酶或維生素等抗氧化劑來維持ROS的低水平狀態(tài)。維生素C是一種廣泛應(yīng)用的抗氧化劑，已有研究表明維生素C可有效減輕腎和骨骼肌的氧化損傷，但是其對心肌的保護(hù)作用及機(jī)制的研究較少[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可引起心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，而維生素C可有效抑制ROS的積累，說明維生素C在抗氧化方面具有明顯效果，能夠改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，對心血管疾病的預(yù)防和治療有一定的積極作用。

然而，正如機(jī)體內(nèi)環(huán)境中的葡萄糖、脂類物質(zhì)積累過多會導(dǎo)致細(xì)胞毒性一樣，維生素C過多積累也會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，維生素C可降低H2O2引起的心肌細(xì)胞中ROS產(chǎn)生，但同時可顯著抑制心肌細(xì)胞的生長，并提高凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的活性。這說明維生素C在發(fā)揮抗氧化作用之外，還存在其他信號調(diào)控通路，有待于進(jìn)一步研究。

[1]陳凱， 景在平， 歐陽堯明，等.血管疾病的代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J].國際心血管病雜志,2015,42(4):238-240.

[2]趙瀟然， 張鳳如.心肌再灌注損傷的機(jī)制與治療策略[J].國際心血管病雜志,2014,41(3):158-160.

[3]程燕，孫堯，張浩良，等.慢性大鼠酒精性心肌病氧化應(yīng)激的影響[J].華西醫(yī)學(xué)，2010，25(4):664-666.

[4]Panera N,Gnani D,Piermarini E,et al.High concentrations of H2O2trigger hypertrophic cascade and phosphatase and tensin homologue (PTEN) glutathionylation in H9C2cardiomyocytes [J].Exp Mol Pathol,2016,100(1):199-206.

[5]Chen W,Druhan LJ,Chen CA,et al.Peroxynitrite induces destruction of the tetrahydrobiopterin and heme in endothelial nitric oxide synthase:transition from reversible to irreversible enzyme inhibition[J].Biochemistry,2010,49(14):3129-3137.

[6]Djuric＇ D,Vusanovic＇ A,Jakovljevic＇ V.The effects of folic acid and nitric oxide synthase inhibition on coronary flow and oxidative stress markers in isolated rat heart[J].Mol Cell Biochem,2007,300(1-2):177-183.

[7]Kyaw M,Yoshizumi M,Tsuchiya K,et al.Atheroprotective effects of antioxidants through inhibition of mitogen-activated protein kinases[J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(8):977-985.

[8]葛淑清，劉洪武，李英慈，等.568例心血管患者血清維生素A、E、C水平的初步觀察[J].心肺血管病雜志，1992，11(2)：4-5.

[9]Sawyer DB,Siwik DA,Xiao L,et al.Role of oxidative stress in myocardial hypertrophy and failure[J].J Mol Cell Cardiol,2002,34(4):379-388.

[10]Kwon SH,Pimentel DR,Remondino A,et al.H(2)O(2) regulates cardiac myocyte phenotype via concentration-dependent activation of distinct kinase pathways[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(6):615-621.

[11]Bhatt DL,Pashkow FJ.Introduction.Oxidative stress and heart disease[J].Am J Cardiol,2008,101(10A):1D-2D.

[12]陳暉，周力.維生素 C預(yù)防冠心病合并腎功能不全患者發(fā)生對比劑腎病的臨床研究[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志， 2011，10(3)：176-178.

[13]Kearns SR,Moneley D,Murray P,et al.Oral vitamin C attenuates acute ischaemia-reperfusion injury in skeletal muscle[J].J Bone Joint Surg Br,2001,83(8):1202-1206.

(收稿：2016-03-03修回：2016-06-02 )

(本文編輯：梁英超)

Effect of vitamin C on cultured H9C2myocardial cells

REN Chenxia,MA Lixia,GUO Ping,GUO Ying,CAO Wenjun.

Institute of Cardiovascular Diseases,Changzhi Medical College,Shanxi046000,China

Objective:To investigate the effect of vitamin C on the antioxidant capacity and cell viability of H9C2cell lines.Methods:The cultured H9C2cells were treated with vitamin C of different concentrations,and cell morphology was observed under inverted microscope.MTT assay was used to test the cell viability.Fluorescent probe DCFH-DA was used to determinate the effect of vitamin C on the intracellular ROS induced by H2O2.The activity of caspase-3 and caspase-9 were tested by colorimetric method.Results:The morphological changes of H9C2cardiomyocyteswere observed after treatment of 0.05 mg/mL vitamin C,including the increase of granular substance in the cytoplasm,arranged disorder and widened intercellular gap.0.05 mg/mL vitamin C could inhibit the accumulation of ROS caused by H2O2,but with the increase of vitamin C concentration,the survival rate of cardiomyocytes decreased significantly and the activity of caspase-3 and caspase-9 increased significantly.Conclusion:Vitamin C has a significant antioxidant effect on the H9C2cardiomyocytes,but it can significantly inhibit the cell growth.

Vitamin C; H9C2cardiomyocytes; Cell viability

山西省基礎(chǔ)研究計劃項目(2015021185)；長治醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(CX201507)；長治醫(yī)學(xué)院普及項目(QDZ201503)

046000長治醫(yī)學(xué)院心血管病研究所

曹文君，Email：wjcao16@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.04.012