重癥醫(yī)學(xué)科患者主動篩查分離的耐藥鮑曼不動桿菌獲得性耐藥基因及遺傳標(biāo)記檢測

楊雅蕓，陳琳，許小敏，梁珊燕，王春萍

重癥醫(yī)學(xué)科患者主動篩查分離的耐藥鮑曼不動桿菌獲得性耐藥基因及遺傳標(biāo)記檢測

楊雅蕓，陳琳，許小敏，梁珊燕，王春萍

目的 了解寧波地區(qū)6家三級醫(yī)院成人ICU患者主動篩查分離的耐藥鮑曼不動桿菌中獲得性耐藥基因與可移動遺傳元件的存在狀況。方法 采用主動篩查ICU患者收集菌株，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及序列分析檢測獲得性耐藥基因與可移動遺傳元件，GN-16藥敏卡及K-B法測定藥物的敏感性。結(jié)果 40株不動桿菌對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率27.5%，替加環(huán)素耐藥率25.0%，其他常見抗菌藥物耐藥率均為100%。檢出 -內(nèi)酰胺酶TEM、ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-24、OXA-66等6種基因，ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-66檢出率均達100.0%。檢出氨基糖苷類修飾酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3')-Ⅰ和armA 16SrRNA甲基化酶基因，陽性率均低于25.0%?？梢苿舆z傳元件遺傳標(biāo)記中IS26、ISaba1檢出率均達100.0%。intⅠ1、tnpU檢出率均為25.0%。連鎖檢測ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23陽性率均為100.0%，而ISaba1-OXA-66均呈陰性。獲得性耐藥基因OXA-2群、OXA-23、OXA-66及ADC與MGEs遺傳標(biāo)記IS26、ISaba1高度相關(guān)。結(jié)論 6家三級醫(yī)院篩查分離不動桿菌耐藥嚴(yán)重，獲得性耐藥基因與可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記存在高度相關(guān)。

耐藥不動桿菌；獲得性耐藥基因；可移動遺傳元件

鮑曼不動桿菌具有強大的獲得性和克隆傳播的能力，重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）鮑曼不動桿菌表現(xiàn)出高度的耐藥性。為了解寧波地區(qū)成人ICU患者ASC耐藥鮑曼不動桿菌的 -內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物和其他藥物的獲得性耐藥基因與可移動遺傳元件（MGEs）遺傳標(biāo)記存在狀況，以及這些獲得性耐藥基因與MGEs的關(guān)系。筆者對40株耐藥鮑曼不動桿菌進行了55種 -內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物和其他藥物的獲得性耐藥基因，13 種MGEs的遺傳標(biāo)記檢測，并對檢測結(jié)果作了指標(biāo)聚類分析系；同時為了探討部分 -內(nèi)酰胺酶基因與MGEs的關(guān)系，作 了 ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66連鎖檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2013年1—12月入住寧波市第一醫(yī)院、寧波市第二醫(yī)院、寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院3家三甲醫(yī)院和寧波市鄞州人民醫(yī)院、寧波市北侖人民醫(yī)院、寧波市第六醫(yī)院3家三乙院ICU時間＞48 h患者。入住ICU后第1天患者進行肛拭子采樣，法國bioMerieux公司顯色培養(yǎng)基篩查，共收集40株菌株。

1.2 菌種鑒定及藥敏試驗 菌種鑒定先用法國生物梅里埃公司全自動微生物鑒定儀作初步篩查，繼而進一步作gyrA基因擴增測序（gyrA 引物 P1：5’-AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT-3’；P2：5’-GCCATACCTACGGCGATACC-3’，測得序列與BLASTn比對。藥敏試驗為VITEK2及K-B法，抗菌藥物敏感性判斷根據(jù)2014CLSI進行。

1.3 細菌DNA模板制備 蛋白酶K裂解法。

1.4 基因檢測 全部基因檢測均為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法，完全按照試劑盒說明書操作。檢測項目：（1）-內(nèi)酰胺類藥物獲得性耐藥基因。TEM、SHV、CTXM-1群、CTX-M-2群、CTX-M-3群、CTX-M-9群、CTX-M-25群、PER、VEB、GES、CARB、RTG、KPC、SCO、IMP、VIM、SIM、SPM、GIM、AIM、NDM、KHM、DIM、TMB、ADC、DHA、OXA-1群、OXA-2群、OXA-10群、OXA-23群、OXA-24群、OXA-51群、OXA-58群。（2）氨基糖苷類獲得性耐藥基因。aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰad、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(2")-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ、ant (4')-Ⅰ、aph3'-Ⅰ、armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA。（3）其他藥物獲得性耐藥基因。qepA、qnrA、qnrB、qnrS、aac (6')-Ⅰb-cr、adeB、qacE△1。（4）MGEs的遺傳標(biāo)記。traA、trbC、intⅠ1、intⅠ2、intⅠ3、tnpU、tnp513、IS26、IS903、ISaba1、ISaba4、ISaba9、merA。（5）連鎖檢 測 基 因。ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66。

1.5 陽性基因測序和聚類分析 PCR產(chǎn)物用ABI公司3730（美國）全自動熒光法測序。用Chromas直接作BLAST Search網(wǎng)上比對。UPGMA法作指標(biāo)聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏檢測結(jié)果 40株耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感率50.0%，頭孢哌酮/舒巴坦敏感率12.5%，中敏率60.0%，對其他常用抗菌藥物均耐藥。見表1。

表1 40株耐藥鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物的敏感率 株（%）

2.2 基因檢測結(jié)果 -內(nèi)酰胺酶TEM、ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-66檢出率100.0%，OXA-24檢出率5.0%。氨基糖苷類獲得性耐藥基因aac(3)-Ⅰ檢出率15.0%，aac(6')-Ⅰb檢出率25.0%，ant (2")-Ⅰ檢出率20.0%，aph(3')-Ⅰ、armA 16SrRNA甲基化酶基因檢出率25.0%；MGEs遺傳標(biāo)記intⅠ、tnpU1、tnp513檢出率 25.0%，IS26、ISaba1檢出率100.0%；連鎖檢測ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23檢出率100.0%，ISaba1-OXA-66未檢出；其他藥物獲得性耐藥基因adeB檢出率100.0%，qacE△1檢出率25.0%。

2.3 檢測基因結(jié)果的指標(biāo)聚類分析獲得性耐藥基因 OXA-2群、OXA-23、OXA-66及ADC、adeB與MGEs遺傳標(biāo)記IS26、ISaba1高度相關(guān)。

3 討論

鮑曼不動桿菌的整合子、轉(zhuǎn)座子（含插入序列）和接合性質(zhì)粒等MGEs能將自身的整合酶基因、轉(zhuǎn)座酶基因、接合（性毛）基因以及所攜帶的耐藥基因在同種細菌不同菌株之間和不同種細菌菌株之間傳播，從而使其所攜帶的耐藥基因快速播散[1]。所以ICUASC耐藥鮑曼不動桿菌陽性者，在接下來的住院期間更易發(fā)生該細菌的感染，需要對患者進行床旁的接觸隔離。

本組菌株獲得性耐藥基因檢測顯示，-內(nèi)酰胺酶 ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-24及OXA-66等基因的高檢出率與包括亞胺培南和美洛培南在內(nèi)的頭孢類藥物高耐藥率一致；氨基糖苷類修飾酶基因和armA 16SrRNA甲基化酶基因的檢出率與氨基糖苷類藥物耐藥率一致。連鎖檢測ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23均呈陽性。連鎖檢測進一步驗證了ADC-67和OXA-232種 -內(nèi)酰胺酶基因均由插入序列 ISaba1介導(dǎo)。并由ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23測序圖ISaba1的IRL區(qū)可見，兩者有一個堿基差別。這與文獻報道相同[2-3]。ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23兩者有一個堿基差別又說明菌株擁有 2個不同的ISaba1拷貝（它們的IRL區(qū)不同）。

由于轉(zhuǎn)座子、插入序列自帶啟動子導(dǎo)致相鄰基因的高表達[4-6]。本文的連鎖檢測 ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23均呈陽性，并提示ADC-67和OXA-23 2 種 -內(nèi)酰胺酶基因有可能高表達。對耐藥鮑曼不動桿菌進行 ISaba1-ADC-67、ISaba1-OXA-23、ISaba1-OXA-66連鎖檢測國內(nèi)為首次。

[1] 王衛(wèi)華,陳潔,毛雄英,等.泛耐藥鮑曼不動桿菌獲得性耐藥基因與可移動遺傳元件檢測與指標(biāo)聚類分析[J].中華臨床感染病雜志,2012,5(1):9-13.

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.018

R446.6

A

1671-0800(2016)01-0035-03

2015-08-20（本文編輯：孫海兒）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2014KYA197）；寧波市科技局社發(fā)擇優(yōu)委托項目（2011C51002）

315010寧波，寧波市第二醫(yī)院

許小敏，Email:xjl19990 802@sina.com