高溫誘導人ECV304的凋亡及其信號傳導通路

朱曄晶，彭寧，凌杰，趙兵

高溫誘導人ECV304的凋亡及其信號傳導通路

朱曄晶，彭寧，凌杰，趙兵

目的 探討不同溫度對人ECV304凋亡的影響以及在凋亡過程中caspase家族所起的作用。方法 應用MTT法、Hochest33342/pI熒光雙染、流式細胞術分析高溫對人ECV304細胞誘導凋亡的影響；比色法測定高溫誘導人ECV304凋亡過程中caspase-3、caspase-8、caspase-9活性變化。結果 39℃對細胞影響不明顯，41℃、43℃處理后細胞凋亡明顯增多，凋亡過程中，caspase-3活性與細胞凋亡率成正相關，caspase-8、caspase-9活性無明顯變化。結論 高溫對人ECV304有誘導凋亡作用，caspase-3在人ECV304凋亡過程中起重要作用。

細胞凋亡；熱處理；caspase活性；人ECV304

高熱環(huán)境對機體各個系統(tǒng)均有不同程度的損害，極端熱環(huán)境可以導致某些蛋白結構和功能改變，導致體能減弱甚至死亡[1]。高熱誘導機體細胞損傷程度與熱的程度相關，極度高溫（49～50℃以上）可導致細胞在5 min內以壞死方式死亡，而當環(huán)境溫度在41.6～42℃時，細胞死亡方式以凋亡為主[2]。血管內皮細胞廣泛分布于機體各個部位，研究發(fā)現(xiàn)，其是熱打擊時重要的反應細胞，也是最早發(fā)生損傷的細胞[3]。研究也證實，內皮細胞結構及功能損傷是引發(fā)多器官功能障礙綜合征等嚴重并發(fā)癥的重要因素[4]。本實驗通過研究高熱對內皮細胞凋亡的影響，為高溫環(huán)境下作業(yè)人群健康體能的防護提供理論依據(jù)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 主要儀器與細胞株 FormaSeriesⅡ隔水式CO2培養(yǎng)箱為美國Thermo公司；Nikon Eclipse TS100倒置顯微鏡來自日本Nikon公司；人臍靜脈內皮細胞株（human ECV304）由溫州醫(yī)科大學惠贈。

1.2 主要試劑及耗材 RPMI1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產品；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；細胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購自Corning公司；Hoechst33342/PI細胞凋亡與壞死檢測試劑盒、caspase全酶抑制劑（Z-VADFMK）及3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）細胞毒性與增殖檢測試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；Annexin V-488/PI凋亡檢測試劑盒為美國 Invitrogen公司產品；caspase-3，caspase-8，caspase-9分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人ECV304細胞株培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 g/ml鏈霉素，100U/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)的細胞生長鋪滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3 d更換新鮮培養(yǎng)液。

1.3.2 MTT法測定細胞生長抑制率收集對數(shù)生長期的人ECV304細胞，接種于96孔板，4 h細胞完全貼壁后進行熱處理，使其溫度分別為39℃、41℃、43℃，設加培養(yǎng)液對照組37℃，2 h后取出，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按MTT檢測試劑盒操作說明進行。用酶標儀570 nm處測定各組細胞（6個孔）的A值，以此表示細胞的相對活力。

1.3.3 Hoechst33342/PI熒光雙染進行細胞凋亡形態(tài)學觀察 人ECV304細胞按1×105/孔接種35 mm小培養(yǎng)皿，長滿瓶底70%后改用無血清培養(yǎng)液孵育，并進行實驗分組。作用2 h后，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按Hoechst33342/PI熒光染色試劑盒的操作說明進行活細胞染色，使用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)。正常細胞核Hoechst33342染色為淡藍色熒光，PI不染色；凋亡細胞核Hoechst33342染色為強亮藍色熒光，PI不染色；死亡細胞核Hoechst33342染色為強亮藍色熒光，PI染色呈紅色熒光。

1.3.4 流式細胞術定量檢測細胞凋亡人ECV304細胞按5×105/孔接種6孔板，長滿瓶底 90%后改用無血清培養(yǎng)液孵育，并進行實組分組，按細胞凋亡形態(tài)學觀察處理分組。作用2 h后，分別收集不同處理組細胞，按AnnexinV-488/PI凋亡檢測試劑盒操作說明進行處理。1h內用流式細胞儀檢測各組凋亡細胞率。

1.3.5 分光光度法檢測caspase-3，caspase-8，caspase-9活性變化 收集 0、0.5、1、2、3、4 h對照組與43℃處理組細胞于50 l冷裂解緩沖液中，按照Caspase-3，caspase-8，caspase-9分光光度法檢測試劑盒操作說明進行實驗處理。各處理樣品分別加樣至96孔培養(yǎng)板，酶聯(lián)免疫檢測儀測A值，檢測波長為405nm時caspase-3，caspase-8，caspase-9活性變化。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS13.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用 檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT結果 39℃熱處理對細胞活力幾乎無影響，其細胞存活率（[4.16±0.36）%]與對照組（[3.91±0.18）%]差異無統(tǒng)計學意義（i=1.77，＞0.05），隨著熱處理溫度的升高41℃、43℃組其細胞存活率（[16.09± 0.40）%、（48.21±0.58）%]與對照組37℃差異均有統(tǒng)計學意義（i=86.46、226.90，均＜0.05）。

2.2 細胞凋亡形態(tài)學觀察 對照組細胞核均勻，Hoechst33342染色呈彌散均勻淡染熒光，PI不染色。39℃作用組經(jīng)Hoechst33342染色后可見大部分為正常細胞核，僅少量細胞核出現(xiàn)核固縮，染色呈亮藍色熒光增強等凋亡細胞核形態(tài)學改變，其中PI染色細胞數(shù)極少。43℃作用組凋亡細胞比例較39℃作用組明顯增加，核為強藍色熒光染色，核邊緣呈明顯波紋狀或折縫狀改變，可見到染色質聚集、邊緣化等凋亡早期典型形態(tài)學改變，PI不染色。43℃+40MZ-VAD-FMK組凋亡細胞比例較43℃作用組有所下降，細胞凋亡影響與39℃作用組較接近。見封三彩圖9。

2.3 流式細胞術檢測凋亡 39℃作用組凋亡率高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（i=1.11，＞0.05）；41℃、43℃作用后凋亡率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（i=25.31、74.95，均＜0.05）。見表1。

表1 不同溫度處理組對人ECV304細胞凋亡的影響（ =3）

2.4 熱處理誘導人ECV304凋亡過程中caspase-3，caspase-8，caspase-9活性變化caspase-3活性與對照組差異有統(tǒng)計學意義（t=32.63，＜0.05）；caspase-8，caspase-9活性變化不明顯，與對照組差異無統(tǒng)計學意義（t=1.49、1.16，均＞0.05）。見圖1。

圖1 不同溫度對caspase-3、caspase-8、caspase-9活性的影響

3 討論

細胞凋亡不同于細胞壞死，是細胞在生理或病理情況下發(fā)生有序的主動的非炎癥死亡，又稱程序性死亡，它不僅存在于生長發(fā)育的一般生命過程，還廣泛參與了許多疾病的病理機制[5]。

血管內皮系統(tǒng)能維持血管內環(huán)境的穩(wěn)定及各組織器官的功能，其內皮細胞出現(xiàn)凋亡或壞死改變能引起一系列繼發(fā)機體生理生長功能改變，出現(xiàn)各種臨床癥狀[6]。本實驗驗證高溫對血管內皮細胞的傷害，從41℃開始，隨著溫度的增高，細胞凋亡的數(shù)量也逐漸增多，尤其在持續(xù)高溫2～3 h時間段，凋亡率達到頂峰，顯示出溫度對其誘導作用具有依賴性；同時通過對人ECV304凋亡的檢測，可以發(fā)現(xiàn)caspase全酶抑制劑對高溫造成的細胞凋亡具有一定的抑制作用，可在一定程度降低高溫對細胞凋亡的誘導率，推測caspase在細胞凋亡過程中發(fā)揮作用，本實驗進一步觀察發(fā)現(xiàn)在熱處理人ECV304后，caspase-3隨著時間的增加其活性變化與細胞凋亡趨勢一致，說明caspase-3可能參與了高溫誘導的人ECV304細胞凋亡；同時caspase-8和caspase-9活性變化不大，caspase-8和caspase-9在此次凋亡誘導實驗中的具體作用仍有待進一步證實。由此證明血管內皮細胞凋亡是由caspase-3介導，caspase-8、caspase-9不參與或參與的較少。此次實驗還顯示出caspase全酶抑制劑并沒有完全阻斷高溫誘導的人ECV304細胞的凋亡，提示高溫誘導的細胞損傷還可能涉及其他信號傳導通路，亦有研究顯示不依賴caspase的凋亡模式存在[7]，因此，其具體的細胞毒性機制仍有待進一步研究。

本實驗證實caspase-3在血管內皮細胞損傷中的作用，為中暑的發(fā)病機制提供了實驗依據(jù)，也為中暑與溫度之間的關聯(lián)提供了一些相關的實驗與理論依據(jù)。

[1] Gasparrini A,Arostrong B.The impact of heat waves on mortality[J].Epidemiology, 2011,22(1):68-73.

[2] 張水文.熱射病時中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化研究進展[J].解放軍預防醫(yī)學雜志,2000,18 (4):307-309.

[3]李丹丹,孟建中,呂蘇一,等.野外演練致勞力性熱射病的多器官功能損傷規(guī)律及高危因素[J].生物醫(yī)學工程研究,2010,29 (4):287-292.

[4] Winn RK,Harlan JM.The role of endothelial cell apoptosis in inflammatory and immune diseases[J].Thromb Haemost, 2005,3(8):1815-1824.

[5] 邱志凌,張軍平,郭曉辰.內質網(wǎng)應激與血管內皮細胞凋亡的研究進展[J].中國醫(yī)學科學院學報,2014,36(1):102-107.

[6] 趙平,劉永海,王敦敬.血管內皮細胞功能檢測方法的研究進展[J].國際免疫學雜志,2013,36(3):200-203.

[7] 石紅,馮江敏.馬兜鈴酸通過ERKl/2信號傳導途徑誘導人臍靜脈血管內皮細胞凋亡[J].基礎醫(yī)學與臨床,2013,33(6):744-748.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.013

R594.1

A

1671-0800(2016)01-0025-03

2014-10-12（本文編輯：孫海兒）

318020浙江省臺州，臺州市第一人民醫(yī)院

朱曄晶，Email:hyzyj001@163.com