通過(guò)體外代謝途徑構(gòu)建確定乳酸合成關(guān)鍵酶

馬春玲，張彥飛，楊　雪，巨曉芝，刁愛(ài)坡，馬紅武*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

通過(guò)體外代謝途徑構(gòu)建確定乳酸合成關(guān)鍵酶

馬春玲1，2，張彥飛2，楊雪2，巨曉芝1，2，刁愛(ài)坡1，馬紅武2*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

基于代謝控制分析理論提出了一種通過(guò)體外代謝途徑構(gòu)建和分析確定關(guān)鍵酶的方法并應(yīng)用其確定乳酸高產(chǎn)菌株中的關(guān)鍵酶。首先獲得高產(chǎn)菌株的粗酶液并測(cè)定葡萄糖到乳酸合成途徑中各種蛋白的絕對(duì)濃度，進(jìn)而通過(guò)向粗酶液中分別添加同等比例的各純酶對(duì)途徑進(jìn)行擾動(dòng)，并由擾動(dòng)前后的途徑通量變化計(jì)算出各酶的通量控制系數(shù)以確定關(guān)鍵酶。結(jié)果表明，該菌株乳酸合成途徑中丙酮酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶對(duì)途徑通量影響最大，由此預(yù)測(cè)在該菌株基礎(chǔ)上進(jìn)一步過(guò)表達(dá)這兩個(gè)酶對(duì)提高乳酸生成速率可能最為有效。

體外代謝途徑構(gòu)建；乳酸合成途徑；代謝控制分析；關(guān)鍵酶；通量控制系數(shù)

乳酸是自然界中最小的手性分子，廣泛存在于生物體中，是世界上被公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、印刷、印染、制革、烤煙等領(lǐng)域［1］。目前，世界上90%的乳酸由發(fā)酵法生產(chǎn)獲得，少量由化學(xué)合成法生產(chǎn)［2-3］。近年來(lái)，因?yàn)榇竽c桿菌生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用大腸桿菌基因改造菌株生產(chǎn)D-乳酸也得到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注［4-5］。構(gòu)建高產(chǎn)D-乳酸菌株的常用方法有引入高活性外源酶、過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶及對(duì)酶基因的序列進(jìn)行改造以解除抑制等，這些方法往往需要以確定關(guān)鍵酶為前提。為提高乳酸生成量，人們首先會(huì)考慮增加D-乳酸脫氫酶（D-lactate dehydrogenase，D-LDH）基因的表達(dá)量，但BUNCH P K等［6］的研究結(jié)果表明，在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)D-LDH反而會(huì)使菌體生長(zhǎng)變慢，影響D-乳酸的生成。

該文利用體外代謝途徑構(gòu)建和代謝控制分析的方法對(duì)葡萄糖到乳酸合成途徑中各酶對(duì)合成通量的影響進(jìn)行了分析，計(jì)算通量控制系數(shù)，確定途徑關(guān)鍵酶，為胞內(nèi)改造提供指導(dǎo)方向。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Prime STAR mix、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Marker）：New England Biolabs；葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖1，6-二磷酸、甘油醛-3-磷酸、二羥丙酮磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、乳酸脫氫酶、乳酸：美國(guó)Sigma公司；丙酮酸、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinu cleotide，NAD+）、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adeninedinucleotidephosphate，NADP+）、磷酸鹽：北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

V-1600可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Tecan infinite M 200 PRO多功能微孔板檢測(cè)儀：瑞士Tecan公司；1260 Infinity LC高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）分析儀：美國(guó)Agilent公司。

1.3方法

本區(qū)硅質(zhì)巖主量元素分析結(jié)果列于表2。SiO2的含量較高，平均為89.82%，SiO2的含量高低與鏡下觀察的硅質(zhì)物質(zhì)比例基本吻合；Al2O3、TiO2及Fe2O3平均含量分別為4.16%、0.17%和1.86%，MgO和CaO含量較低，MnO的含量小于0.01%，研究Fe/Mn的比值可以確定礦床的成因類型。本區(qū)硅質(zhì)巖微量元素分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表2可以看出，Sc的含量平均為4.13×10-6。U和Th的含量平均含量分別為3.16×10-6和4.34×10-6，U/Th比值的平均值為0.84。下石炭統(tǒng)V的含量高于上泥盆統(tǒng)，且在接近地質(zhì)界線處為最高165×10-6。

1.3.1乳酸高產(chǎn)菌株粗酶液的制備

將實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一株D-乳酸高產(chǎn)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（12～14 h），取發(fā)酵液離心獲得菌體，再經(jīng)過(guò)重懸、破碎、離心取上清及透析后得到不含小分子干擾物的粗酶液，用于后續(xù)研究。

1.3.2質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白純化

根據(jù)GenBank基因序列及pET-28a的多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site，MCS），應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物F1/R1，以E.coli MG1655基因組為模板，擴(kuò)增目的片段。以pET-28a（+）為載體，以E.coli BL21（DE3）為宿主，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)12～16h后，離心獲得菌體。把菌體重懸后，經(jīng)破碎取上清，得到細(xì)胞液。利用咪唑?qū)?xì)胞液進(jìn)行梯度洗脫，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗(yàn)證［16-17］后，收集目標(biāo)蛋白，透析濃縮，經(jīng)Bradford法定量后，分裝、置于-80℃保存。

1.3.3乳酸合成途徑蛋白催化速率的測(cè)定

基于NAD（P）H在波長(zhǎng)340 nm處有吸收光，通過(guò)酶偶聯(lián)的方法可測(cè)定NAD（P）H的生成或消耗，可進(jìn)一步計(jì)算出反應(yīng)中途徑蛋白的催化速率。利用偶聯(lián)酶間接測(cè)定催化速率時(shí)，要考慮反饋抑制［18］、底物及偶聯(lián)酶過(guò)量等問(wèn)題。由于底物甘油酸-1，3-二磷酸、甘油酸-3-磷酸、甘油酸-2-磷酸無(wú)法體外獲得，故甘油酸磷酸激酶（phosphoglycerate kinase，Pgk）、甘油酸磷酸變位酶（2，3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase，GpmA）、烯醇化酶（enolase，Eno）的催化速率尚無(wú)法測(cè)定，因此未針對(duì)這三個(gè)酶進(jìn)行研究。乳酸合成途徑中各蛋白催化速率的測(cè)定原理及反應(yīng)方程見(jiàn)表1。

表1　乳酸合成途徑中各蛋白催化速率的測(cè)定原理及反應(yīng)方程Table 1 Measuremen t princip les and reaction equations of catalysis rates of the enzym es in the lac tate synthesis pathway

1.3.4代謝物濃度測(cè)定

（1）NADH濃度的檢測(cè)

利用光柵型多功能微孔檢測(cè)儀Tecan infinite M 200 PRO進(jìn)行在線測(cè)定，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm，檢測(cè)池溫度為37℃，樣品量200 μL。

（2）乳酸濃度的檢測(cè)

利用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為BIORAD Aminex HPX-87H有機(jī)酸柱（7.8 mm×300 mm），柱溫45℃，流動(dòng)相為終濃度5 mmol/L的H2SO4，流速0.6 m L/min，串聯(lián)連接RID、VWD檢測(cè)器，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為190 nm，檢測(cè)池溫度為35℃。每個(gè)樣品進(jìn)樣量為10 μL，分析時(shí)間為26 m in。

1.3.5計(jì)算公式

通量控制系數(shù)（FCCs）可以由下面的公式計(jì)算，F(xiàn)CC越大，代表酶濃度改變對(duì)途徑的通量影響越大。

式中：Jr和表酶濃度改變后的酶量和途徑通量值；ΔJ是指酶量改變后通量的變化；ΔEi是指酶濃度的變化量。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸合成途徑中各蛋白的表達(dá)純化

目的蛋白100℃變性10 min后，SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示。

圖1　目的蛋白SDS-PAGE圖譜分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of target protein

由圖1可知，目的蛋白基本沒(méi)有雜帶，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2粗酶液中乳酸合成途徑各蛋白絕對(duì)濃度的測(cè)定

蛋白組學(xué)測(cè)定方法雖然可以同時(shí)測(cè)得多個(gè)蛋白的濃度變化，但結(jié)果一般是該蛋白在不同條件下的相對(duì)濃度變化而非絕對(duì)濃度，而代謝控制分析需要酶的絕對(duì)濃度。針對(duì)這一問(wèn)題提出了一種通過(guò)純酶滴定確定粗酶液中各酶絕對(duì)濃度的方法。首先對(duì)要定量的酶添加過(guò)量底物使其反應(yīng)速率僅受酶濃度影響，然后在粗酶液中添加不同濃度的純酶，通過(guò)純酶添加濃度和反應(yīng)速率的擬合曲線得到原粗酶液中相應(yīng)酶的絕對(duì)濃度。以Glk為例，在200 μL粗酶反應(yīng)體系中加入過(guò)量葡萄糖、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸及偶聯(lián)酶，為了使反應(yīng)速率控制在合適的范圍內(nèi)，得到更多NADH濃度處于線性變化階段的數(shù)據(jù)，需將粗酶稀釋60倍后待用。測(cè)定只有粗酶液及添加不同濃度Glk純酶后的反應(yīng)速率，結(jié)果如圖2所示。

圖2　反應(yīng)體系中Glk質(zhì)量濃度變化對(duì)反應(yīng)速率的影響曲線Fig.2 Changing curve of reaction rates w ith the Glk concentrations on reaction ra te

由圖2可知，純酶質(zhì)量濃度與反應(yīng)速率擬合可得到一線性關(guān)系，當(dāng)純酶質(zhì)量濃度為0時(shí)的速率（Y軸截距）即粗酶液中Glk催化反應(yīng)的速率，其在X軸上的截距即對(duì)應(yīng)Glk在稀釋后粗酶液中的絕對(duì)質(zhì)量濃度，為0.63 mg/L。由稀釋率可推算出原粗酶液中含有的Glk蛋白質(zhì)量濃度為37.8 mg/L。

根據(jù)確定粗酶液中Glk蛋白定量的方法最終確定乳酸合成途徑中各種蛋白的含量見(jiàn)圖3。

圖3　粗酶液中乳酸合成途徑各蛋白濃度的絕對(duì)定量Fig.3 Enzymes absolute concentrations of the lactate synthesis pathway in the crude enzyme

由圖3可以看出，在此高產(chǎn)菌株的粗酶液中GapA蛋白濃度遠(yuǎn)高于其他蛋白，可能是由于GapA催化反應(yīng)中有NADH產(chǎn)生，而乳酸的生成消耗NADH，GapA蛋白含量較多能夠提供更多的合成還原力使該菌株能夠更有效地合成乳酸。

2.3乳酸合成途徑中各蛋白的通量控制系數(shù)計(jì)算

基于菌種基因工程改造過(guò)程中酶量常發(fā)生較大變化，選擇將每個(gè)酶的濃度都增加到其在稀釋粗酶液濃度中的兩倍。代謝控制分析時(shí)要測(cè)量整個(gè)途徑達(dá)到擬穩(wěn)態(tài)時(shí)的通量，在葡萄糖到乳酸的合成途徑中的中間代謝物都可通過(guò)前面的反應(yīng)生成，因此在多酶反應(yīng)體系中只需添加初始底物葡萄糖、ATP、ADP、NAD+和磷酸。參考BRENDA數(shù)據(jù)庫(kù)中的親和常數(shù)Km值及文獻(xiàn)中胞內(nèi)代謝物濃度水平［19］，結(jié)合實(shí)驗(yàn)摸索，確定當(dāng)上述代謝物終濃度分別為5 mmol/L、5 mmol/L、2 mmol/L、2 mmol/L、2 mmol/L時(shí)已足夠保證底物為過(guò)量。同樣，在上述稀釋60倍后的粗酶液基礎(chǔ)上，分別添加不同純酶，純酶添加量均為粗酶稀釋液中對(duì)應(yīng)該蛋白絕對(duì)濃度2倍。因合成途徑的最終產(chǎn)物是乳酸，以乳酸合成速率代表整個(gè)途徑的通量，乳酸的生成速率見(jiàn)圖4。

圖4　各純酶添加后乳酸的生成速率Fig.4 Lactate production rate after enzym e addition

由圖4可知，在粗酶液催化反應(yīng)基礎(chǔ)上添加純酶PykA及純酶GapA時(shí)有較大的乳酸生成速率。

經(jīng)計(jì)算，途徑中各種蛋白的通量控制系數(shù)（FCCs）見(jiàn)圖5。

圖5　乳酸合成途徑中各蛋白的通量控制系數(shù)Fig.5 Flux control coefficients of the enzymes in the lactate synthesis pathway

由圖5可知，PykA的FCC最大，其次是GapA，在蛋白濃度絕對(duì)定量的結(jié)果中，粗酶液中PykA濃度最低，其為催化生成乳酸的前體物質(zhì)丙酮酸的步驟，使得添加PykA后對(duì)代謝途徑通量影響最大。GapA催化反應(yīng)生成NADH，而乳酸生成需要消耗NADH，所以GapA含量增加也對(duì)代謝途徑通量影響較大。

3　結(jié)論

本研究利用體外代謝途徑分析的方法確定了一株乳酸合成大腸桿菌中從葡萄糖到乳酸各步酶的絕對(duì)濃度，為確定該菌株的關(guān)鍵酶奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而通過(guò)向粗酶液中添加純酶的方法對(duì)體外多酶反應(yīng)體系進(jìn)行擾動(dòng)，基于代謝控制分析原理求得各個(gè)酶的通量控制系數(shù)從而確定對(duì)通量具有較大影響的關(guān)鍵酶。結(jié)果表明，該菌株中PykA和GapA為乳酸合成通量控制的關(guān)鍵酶，在后續(xù)代謝工程改造中可以作為過(guò)表達(dá)靶點(diǎn)以進(jìn)一步提高乳酸合成速率。

［1］胡永紅，管珺，楊文革，等.發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（12）：99-103.

［2］VIJAYAKUMAR J，ARAVINDAN R，VIRUTHAGIRI T.Recent trends in the production，purification and application of lactic acid［J］.Chem Biochem Eng Q，2008，22（2）：245-264.

［3］吳軍華.生物質(zhì)制備乳酸研究進(jìn)展［J］.中國(guó)釀造，2011，30（10）：9-12.

［4］DATSENKOK A，WANNER B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products［J］.P Natl Acad Sci USA，2000，97（12）：6640-6645.

［5］ZHOU S D，CAUSEY T B，HASONA A，et al.Production of optically pured-lactic acid in mineral salts medium by metabolically engineered Escherichia coli W 3110［J］.App l Environ M icrobiol，2003，69（1）：399-407.

［6］BUNCH P K，JAN F M，LEE N，et al.The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli［J］.M icrobiology，1997，143（1）：187-195.

［7］KIM B，KIM W J，KIM D I，et al.Application of genome-scale metabolic network model in metabolic engineering［J］.J Ind M icrobiol Biot，2014，42（3）：339-348.

［8］KING Z A，LLOYD C J，F(xiàn)EIST A M，et al.Next-generation genomescale models for metabolic engineering［J］.Curr Opin Biotechnol，2015，35：23-29.

［9］MCCLOSKEY D，PALSSON B，F(xiàn)EIST A M.Basic and applied uses of genome-scale metabolic network reconstructions of Escherichia co li［J］. M ol Syst Biol，2013，9（1）：661-666.

［10］PARK J M，PARK H M，KIM W J，et al.Flux variability scanning based on enforced objective flux for identifying gene amplification targets［J］. BM C Syst Biol，2012，6（2）：106-112.

［11］王景川，龐廣昌.乳酸代謝通量調(diào)控規(guī)律的研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（21）：246-251.

［12］DE ATAURI P，RODRIGUEZ-PRADOS J C，MAURY J，et al.In silico strategy to rationally engineer metabolite production：a case study for threonine in Escherichia coli［J］.Biotechnol Bioeng，2009（25）：609-620.

［13］CHASSAGNOLE C，F(xiàn)ELL D A，RAIS B，et al.Control of the threonine synthesis pathway in Escherichia coli：a theoretical and experimental approach［J］.Biochem J，2001，356：433-444.

［14］SMALL J R，KACSER H.Responses of metabolic systems to large changes in enzyme activities and effectors［J］.Eur J Biochem，1993，213：625-640.

［15］ZHANG Y F，MENG Q L，MA H W，et al.Determ ination of key enzymes for threonine synthesis through in vitro metabolic pathway analysis［J］.M icrob Cell Fact，2015，86（14）：1-10.

［16］ULUSU Y，S，ENTüRK S B，KUDUGˇH.Expression，purification，and characterization of bovine chymosin enzyme using an inducible pTOL system［J］.Prep Biochem Biotech，2015，18（6）：245-254.

［17］ASHRAFI F，F(xiàn)ALLAH MEHRABADI J，SIADAT S D，et al.Expression and purification of the uropathogenic Escherichia coli PapG protein and its surface absorption on Lactobacillus reuteri：implications for surface display system vaccines［J］.Jund ishapur J M icrobiol，2015，8（9）：25595-25603.

［18］OGAWA T，MORI H，TOM ITA M，et al.Inhibitory effect of phosphoenolpyruvate on glycolytic enzymes in Escherichia coli［J］.Res M icrobiol，2007，158（2）：159-63.

［19］CHRISTOPHE C，NARUEMOL N R，JOACHIM W S，et al.Dynamic modeling of the central carbon metabolism of Escherichia coli［J］.W iley Periodicals，2002，79（1）：53-73.

Determ ination of key enzymes for lactate synthesis through in vitro metabolic pathway construction

MA Chunling1，2，ZHANG Yanfei2，YANG Xue2，JU Xiaozhi1，2，DIAO A ipo1，MA Hongwu2*
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Systems M icrobial Biotechnology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

A method was presented for key enzyme determination through in vitro metabolic pathway analysis based on the metabolic control analysis theory and it was used to determ ine the key enzymes in lactate-producing strain.Firstly，crude enzyme extracts were obtained from the strain and the absolute protein concentrations for all enzymes in the pathway from glucose to pyruvate were measured.Then individual pure enzymes were added to the crude extract and the pathway flux changes were measured to calculate the flux control coefficients（FCCs）of the enzymes to determine the key enzymes.It was found that pyruvate kinase（PykA）and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GapA）had the largest effect on FCCs，and thus should be the gene overexpression targets for further improvement of lactate production.

in vitro metabolic pathway construction；lactate synthesis pathway；metabolic control analysis；key enzyme；flux control coefficient

Q815

0254-5071（2016）05-0144-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．030

2016-02-15

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃‘973計(jì)劃’（Nos.2012CB725203）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’（No.2012AA 022103）；天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（No.14ZCZDSY 00060）

馬春玲（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹铣缮飳W(xué)。

馬紅武（1970-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)橄到y(tǒng)微生物學(xué)。